Tumorceller kan ikke præsentere MHC-II-begrænsede epitoper afledt af onkogener til CD4+ T-celler

CD4+ T-celler spiller en afgørende rolle i antitumorimmunitet via genkendelse af peptidantigener præsenteret på MHC klasse II (MHC-II). Selvom nogle faste kræftformer kan induceres til at udtrykke MHC-II, er det uklart, i hvilket omfang dette muliggør direkte genkendelse af tumorspecifikke CD4+ T-celler. Vi isolerede og karakteriserede T-celleantigenreceptorer (TCR'er) fra naturligt primede CD4+ T-celler, der er specifikke for 2 onkoproteiner, HPV-16 E6, og den aktiverende KRASG12V-mutation, fra patienter med pladecellecarcinom i hoved og hals og pancreas duktalt adenokarcinom, og bestemte deres evne til at genkende autologe eller humane leukocytantigen-matchede antigen-udtrykkende tumorceller. Vi fandt i begge tilfælde, at TCR'erne var i stand til at genkende peptidfyldte målceller, der udtrykker de relevante MHC-II- eller B-celle antigen-præsenterende celler (APC'er), når antigenerne var endogent udtrykt og rettet mod den endosomale vej, men ikke kunne genkende tumor celler, der udtrykker kildeproteinet selv efter induktion af overflade-MHC-II-ekspression af IFN- eller transduktion med CIITA. Disse resultater tyder på, at priming og funktionel genkendelse af både et nukleært (E6) og et membranassocieret (KRAS) oncoprotein er overvejende begrænset til krydspræsenterende APC'er snarere end via direkte genkendelse af tumorceller induceret til at udtrykke MHC-II.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

Introduktion

Malign transformation af somatiske celler initieres af virkningen af ​​aktiverede onkogener, der dysregulerer cellevækstveje og fører til ukontrolleret proliferation (1). I tilfælde af HPV-associerede cancere bidrager ekspression af de tidlige HPV-gener E6 og E7 til onkogenese ved at hæmme tumorsuppressorgenerne henholdsvis p53 og Rb (2). Alternativt kan konstitutiv onkogenaktivering forekomme gennem somatisk mutation i gener, der regulerer cellevækst og proliferationsveje, såsom RAS-familien. Faktisk er aktiverende KRAS-mutationer såsom KRASG12V almindeligvis fundet hos patienter med bugspytkirtel-, tyktarms- og lungecancer (3). Selvom onkogener fremmer sygdom, kan de også tilvejebringe mål for værtens immunsystem. I de senere år er immunsystemets rolle i at kontrollere HPV-associerede kræftformer blevet bredt anerkendt. CD8+ og CD4+ T-celler, der genkender HPV E6 og E7, såvel som andre HPV-proteiner, er blevet identificeret i både det perifere blod og tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) fra patienter med HPV-associeret kræftformer (4-6). Immunterapier rettet mod disse antigener, herunder terapeutiske cancervacciner og adoptiv cellulær terapi (ACT) med TIL'er eller TCR-konstruerede T-celler, er et aktivt område af præklinisk og klinisk undersøgelse (2). T-celleresponser mod onkogene mutationer er også blevet beskrevet bredt (7-9). Endvidere er der direkte klinisk bevis for, at ACT med TIL'er rettet mod mutant KRAS kan fremme objektive responser (10). Selvom CD8+ T-celler, der genkender epitoper afledt af onkogener, medierer direkte cytotoksicitet mod tumorceller (11-13), er CD4+ T-cellers rolle i antitumorimmunitet mindre godt forstået. Nylige undersøgelser har fremhævet en undergruppe af CD4+ T-celler, der udtrykker cytotoksiske markører, såsom granzym B (GrzmB), i humane kræftformer (14, 15). Antigenspecificiteterne af disse celler, og dermed deres terapeutiske potentiale, forbliver imidlertid stort set ukendte. For at disse cytotoksiske CD4+ T-celler skal genkende og dræbe tumorceller, skal tumorcellen endvidere ikke blot udtrykke MHC-II, men også de relevante antigener skal ledes til den passende præsentationsvej. I denne undersøgelse undersøgte vi kapaciteten af ​​CD4+ T-celler, der er specifikke for onkoproteinerne HPV-16 E6 og KRASG12V til at genkende antigen-udtrykkende tumorceller. Selvom begge TCR'er var i stand til direkte at genkende endogent behandlede og præsenterede antigener rettet mod det endosomale rum af HLA-matchede B-celler, var ingen af ​​dem i stand til at genkende antigen-udtrykkende tumorceller med induceret ekspression af MHC-II. Samlet set tyder vores resultater på, at kun visse antigener præsenteres direkte på MHC-II+ tumorceller, hvilket kan begrænse puljen af ​​CD4+ T-celler, der er i stand til direkte at genkende og eliminere tumorceller.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Resultater

Identifikation af HPV-16 E6-specifik CD4+ og CD8+ T-cellerespons fra TIL'er af planocellulært karcinom i hoved og hals. Vi screenede en række individuelle TIL-kulturer isoleret fra 2 til 4 mm tumorfragmenter fra en patient (Hu-56) med HPV-16+ hoved- og halspladecellekræft (HNSCC) (Supplerende tabel 1; supplerende materiale tilgængelig online med denne artikel; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) af IFN-ELISPOT-assays for at identificere T-celleresponser rettet mod HPV-16 virale onkoproteiner E6 og E7 ved hjælp af peptidpuljer, der omfatter overlappende 15-merer, der spænder over længden af ​​E6- og E7-proteinerne. TIL-fragmenter 12 og 29 genererede især et betydeligt antal pletter over baggrunden, når de blev restimuleret med E6-peptidpuljen og indeholdt både CD4+- og CD8+-T-celler (figur 1A og supplerende figur 1A). For at identificere de relevante T-celleundersæt analyserede vi disse TIL-kulturer ved hjælp af et cytokinsekretionsassay. Dette afslørede TIL-fragment 29 (F29) indeholdt E6-reaktive CD8+ T-celler, hvorimod fragment 12 (F12) indeholdt både CD4+ og CD8+ T-celler, der var i stand til at genkender E6-peptidpuljen (figur 1B). Ingen af ​​CD4+ T-cellerne producerede IL-5 som svar på E6-restimulering, hvilket validerede en Th1-lignende fænotype. For at bestemme TCR-klonaliteten af ​​E6-specifikke TIL'er sorterede vi enkelte IFN- –secernerende CD4+ T-celler fra F12 og CD8+ T-celler fra F12 og F29. TCR-sekventering afslørede en enkelt TCR udtrykt af IFN- – secernerende CD4+ T-celler (n=31 af 31 sekventerede celler), såvel som en enkelt TCR-klon delt af IFN- – secernerende CD{{53 }} T-celler fra både F12 og F29 (n=40 af henholdsvis 41 og 37 af 38 celler sekventeret) (Supplerende tabel 2). Disse resultater indikerer, at monoklonale CD4+ og CD8+ T-celler, der er reaktive over for E6, er til stede i TIL'er fra denne patient. HLA-A*02:01-begrænset CD8+ T-celler fra TIL'er genkender E6 præsenteret af en patientafledt tumorcellelinje. TIL'er fra F29 producerede IFN-, når de blev restimuleret med E629-38-peptidet, hvilket tyder på, at F29 TCR genkendte denne tidligere beskrevne HLA-A*02:01-begrænsede epitop (Supplerende figur 1B) (11). Dette blev bekræftet af tetramer-bindingsundersøgelser med E629-38/HLA-A*02:01 til at mærke TCR-deficiente J76-celler, der udtrykker human CD8, og ved at bruge en tidligere beskrevet E628-38-specifik TCR som en positiv kontrol (figur 2A) (11). Begge TCR'er udviste lignende niveauer af funktionel aviditet, som vist ved opregulering af den akutte aktiveringsmarkør CD69 på J76 efter stimulering med autologe B-lymfoblastoidcellelinjer (B-LCL'er) pulseret med titrerede koncentrationer af E629-38-peptid (figur 2, B og C). Disse data validerer tilstedeværelsen af ​​en CD8+ T-celleklon, der er specifik for en kendt epitop af E6 med lignende funktionelle karakteristika som en TCR, der er blevet testet i et klinisk miljø (16). Vi forsøgte derefter at bestemme, om den E6-specifikke CD8+ TCR kunne genkende endogent udtrykte antigener og derved mediere antitumor cytotoksicitet. For at gøre dette brugte vi en velkarakteriseret HLA-A*02:01+ HPV-16+ tumorlinje, CaSki, samt en autolog tumorcellelinje, HNSCC-56, genereret gennem cellulær omprogrammering af primært tumorvæv som tidligere beskrevet (17) til in vitro cytotoksicitetsassays. RNA-Seq-analyse validerede ekspressionen af ​​HPV-16 tidlige gener, inklusive E6, af både den primære tumorprøve og den autologe cellelinje (Supplerende figur 1C). Primære humane CD8+ T-celler, der udtrykker F29 TCR, kunne mediere celledrab af både CaSki og HNSCC-56 ved en række effektor-til-mål-forhold in vitro (figur 2, D og E). Tilsammen validerer disse data, at F29 TCR genkender endogent udtrykt E6-antigen. Identifikation af en HLA-DQ-begrænset, E6-specifik CD4+ T-celle fra TIL'er. For at udvide E6-specifikke TIL'er til yderligere funktionel analyse brugte vi den tidligere beskrevne hurtige ekspansionskulturprotokol med OKT-3 og bestrålede allogene PBMC'er til at udvide TIL'er fra F12. Selvom den primære F12-kultur oprindeligt indeholdt både CD8+ og CD4+ T-celler med E6-reaktivitet, indeholdt det endelige celleprodukt efter hurtig ekspansion 99 % CD4+ T-celler, heraf ca. 38,33 % viste reaktivitet mod E6, som vist ved intracellulær cytokinfarvning for IFN- (figur 3A).

Kinesisk urt cistanche plante-Antumor

Ud over IFN- kunne stimulerede E6-specifikke CD4+ TIL'er udskille TNF- men ikke IL-2 (Supplerende figur 2A). Selvom den totale frekvens af GrzmB+-celler ikke steg med antigenstimulering, viste gating på TNF-secernerende celler, at E6-specifikke CD4+ TIL'er indeholdt mere lagret intracellulær GrzmB end ikke-specifikke TIL'er (supplerende figur 2B) ). IFN- –secernerende CD4+ TIL'er udtrykte også den coinhibitoriske markør programmeret celledød 1 (PD-1), i overensstemmelse med offentliggjorte signaturer af tumorreaktive CD4+ TIL'er (Supplerende figur 2C) ( 18, 19). E6-specifikke CD4+ TIL'er viste en høj funktionel aviditet, fordi disse celler kunne udskille cytokiner ved peptidkoncentrationer på mindre end 1 ug/ml (figur 3B). For at bestemme specificiteten af ​​F12 TIL-kulturen pulserede vi autologe B-LCL'er med individuelle peptider svarende til hver af de 37 peptider indeholdt i den oprindelige E6-pulje (Supplerende tabel 3). CD4+ TIL'er fra F12 udskilte IFN-, når de stimuleres med peptiderne E61-15 og E65-19, som deler en 11-aminosyre-kernesekvens (Supplerende figur 2D). Samkultureksperimenter i nærvær af HLA-blokerende Abs afslørede signifikant formindsket IFN-sekretion af TIL'er, når B-LCL'er blev blokeret med anti-HLA-DQ Abs, men ikke anti-HLA-DR eller isotype kontrol Abs (figur 3C). For at bestemme, hvilke HLA-DQ-alleler, der er ansvarlige for præsentationen af ​​denne epitop, pulserede vi B-LCL'er, der udtrykker kendte HLA-DQ-alleler (supplerende tabel 4) med E61-15 og fandt ud af, at KAS011-celler, der udtrykker HLA-DQA1*01 :02 og DQB1*05:02, men ikke Hu-195 B-LCL'er, der udtrykker DQA1*05:05 og DQB1*03:01, kunne præsentere antigen til TIL'erne på en måde, der kan sammenlignes med autolog Hu{{63} } B-LCL'er (figur 3D). Endelig søgte vi at verificere, at den tidligere identificerede TCR-sekvens faktisk var ansvarlig for E6-genkendelse. Ekspression af F12 TCR i primære humane sunde donor CD4+ T-celler var tilstrækkelig til at fremme genkendelse af E61-15 peptidet, som det fremgår af opreguleringen af ​​CD69 og PD-1 (Figur 3E ). Tilsammen viser disse resultater identifikationen af ​​en HLA-DQ-begrænset epitop af E6 genkendt af monoklonale CD4+ TIL'er. E6-specifikke CD4+ T-celler genkender eller dræber ikke autologe tumorceller, der udtrykker MHC-II. Nylige undersøgelser har identificeret genetiske signaturer af cytotoksiske CD4+ TIL'er i nogle humane kræftformer (14, 15). Hvorvidt cytotoksiske CD4+ T-celler spiller en rolle i HPV-drevne cancere er dog ukendt. For at bestemme, om E6-specifikke CD4+ T-celler fra TIL'er direkte kunne genkende HNSCC-56, undersøgte vi først dets MHC-II-ekspressionsstatus. Selvom tumorcellerne ikke udtrykte nogen påviselig overflade-MHC-II i kultur, var behandling med IFN- i 72 timer tilstrækkelig til at inducere opregulering af MHC-II (figur 4A). Dernæst dyrkede vi HNSCC-56 med CD4+ F12 TIL'er. Det er vigtigt, at MHC-II+ tumorceller prækonditioneret med IFN- ikke var i stand til at stimulere CD4+ TIL'er målt ved IFN-sekretion (figur 4B).

Figur 1. Identifikation af E6-reaktive CD4+ og CD8+ TIL'er fra HPV-16+ HNSCC. (EN)

Figur 2. Funktionelle karakteristika for en HLA-A*02:01-begrænset, E6-specifik TCR fra Hu-56 TIL'er. (EN)

Imidlertid var IFN-behandlede tumorcellelinjer pulseret med E61-15 før tilføjelsen af ​​TIL'er i stand til at stimulere en T-cellerespons, hvilket indikerer, at overfladeekspression af de begrænsende HLA-DQ-alleller i en cellelinje, der endogent udtrykker E6 var ikke tilstrækkelig til tumorgenkendelse, men krævede eksogen belastning af målpeptidet. Det samme krav om eksogen målpeptidbelastning blev observeret med CIITA-transducerede tumorceller (HNSCC-56 CIITA), som konstitutivt udtrykker høje niveauer af overflade-MHC-II (figur 4B). For at teste, om CD4+ TIL'er kunne genkende en endogent behandlet og præsenteret version af E6-epitopen på en APC, transducerede vi retroviralt autologe B-LCL'er med en ekspressionskonstruktion, der koder for de første 50 aminosyrer af E6 fusioneret til MHC- I transmembrandomæne (E6-MITD), som inducerer lokalisering af den fusionerede aminosyresekvens til plasmamembranen og understøtter præsentation på MHC-II via endosomal trafficking (20). B-LCL'er, der udtrykker E6-MITD-konstruktionen, kunne stimulere E6-specifikke CD4+ TIL'er, hvilket indikerer, at peptidepitopen, der genkendes af disse TIL'er, naturligt kan behandles og præsenteres på MHC-II, når rettet til den passende vej (figur 4C).

Figur 3. Funktionelle karakteristika af klonalt udvidede, HLA-DQ-begrænsede, E6-specifikke CD4+ TIL'er. (EN)

Dernæst søgte vi at bestemme, om de F12 E6-specifikke CD4+ TIL'er var i stand til direkte tumorcytotoksicitet. I overensstemmelse med dataene fra vores genkendelsesassays var E6-specifikke CD4+ TIL'er ikke i stand til at begrænse væksten af ​​HNSCC-56 tumorceller, som ikke udtrykker MHC-II (Figur 4D) . Desuden voksede HNSCC-56 CIITA-tumorceller også uhæmmet i nærvær af CD4+ TIL'er. Væksten af ​​HNSCC-56 CIITA-tumorceller pulseret med E61-15-peptid blev imidlertid hæmmet på en effektorcelledosisafhængig måde. Samlet set tyder disse data på, at selvom HNSCC-56 kan præsentere E6-epitoper til CD8+ T-celler, er E6-specifikke CD4+ TIL'er ikke i stand til direkte at genkende og lysere MHC- II+ autologe tumorceller. Gener involveret i antigenpræsentation muteres ofte i cancer, hvilket kan forhindre genkendelse af T-celler (21). For at bestemme, om HNSCC-56-tumorceller indeholdt somatiske mutationer, der udelukkede antigenpræsentation på MHC-II, udførte vi hel-eksom-sekventering af tumorceller og PBMC'er fra Hu-56 som en referenceprøve. Af de 104 identificerede ikke-synonyme somatiske mutationer var der ingen tilsyneladende mutationer i komponenter af MHC-II-præsentationsvejen, herunder HLADMA, HLADMB og CD74 (supplerende tabel 5). Identifikation af en HLA-DRB5*01:01-begrænset, KRASG12V-specifik TCR fra blodet fra en patient med pancreas duktalt adenokarcinom. Efter disse resultater satte vi os for at bestemme, om tumorcellernes manglende evne til at præsentere antigen på MHC-II var sand for andre onkogener. I betragtning af at cirkulerende tumorspecifikke T-celler er blevet identificeret i humane patienter med cancer (8, 22), stimulerede vi PBMC'er fra en patient (Hu-66) med pancreas duktalt adenokarcinom (supplerende tabel 1) med en pulje af peptider svarende til almindelige onkogene mutationer (Supplerende Tabel 6) i 14 dage før restimulering med individuelle peptider for at identificere relevante T-celleresponser af ELISPOT. Disse resultater indikerede tilstedeværelsen af ​​et T-cellerespons rettet mod KRASG12V, som det fremgår af et øget antal IFN-pletter over baggrunden som respons på KRASG12V aminosyrer 1-15 (figur 5A). For at identificere de relevante TCR'er, der er forbundet med dette respons, brugte vi igen cytokinsekretionsassayet til at sortere IFN---secernerende celler. Cytokinsekretionsassayet afslørede specifik produktion af IFN- af CD4+ T-celler som respons på restimulering med KRASG12V (figur 5B). Sammenligning af TCR-kæderne fra sorterede IFN---udskillende celler med dem, der er til stede i ikke-ekspanderede PBMC'er fra denne patient, afslørede en enkelt TCR-klonotype til stede ved den højeste frekvens blandt begge populationer (figur 5C og supplerende tabel 2). Disse resultater indikerer, at frekvensen af ​​denne T-celleklon blev udvidet ved baseline i PBMC'er, hvilket tyder på en naturligt opstået in vivo-respons snarere end in vitro-priming i vores ekspansionskultur. For at verificere antigenspecificiteten af ​​denne TCR udtrykte vi den i primære humane CD4+ T-celler ved retroviral transduktion og dyrkede disse celler med autologe B-LCL'er pulseret med enten mutant KRASG12V eller tilsvarende WT-peptid. Konstruerede T-celler udskilte IFN-, når de blev stimuleret med mutanten, men ikke WT, KRAS-peptidet, hvilket bekræfter, at denne TCR er specifik for KRASG12V (figur 5D). I overensstemmelse med vores resultater fra E6 TCR var konstruerede T-celler, der udtrykker den KRASG12V-specifikke TCR, også i stand til at genkende B-LCL'er, der udtrykker et fragment af KRASG12V, men ikke WT KRAS, rettet mod endosomet ved inklusion af en MITD, hvilket tyder på, at dette TCR genkender endogent behandlet og præsenteret antigen (figur 5D).

Figur 4. Autologe tumorceller præsenterer ikke endogene E61-15 på MHC-II til CD4+ T-celler. (EN)

Figur 5. Identifikation af en HLA-DRB5*01:01-begrænset, KRASG12V-specifik TCR fra blodet fra en patient med pancreas duktalt adenokarcinom. (EN)

For at identificere den begrænsende HLA-allel gentog vi disse peptidstimuleringseksperimenter under anvendelse af B-LCL'er, der udtrykker forskellige kombinationer af HLA-gener. B-LCL'er, der udtrykker den almindelige HLA-B7-DR15-DQ6-haplotype, kunne stimulere de konstruerede T-celler, hvorimod B-LCL'er uden disse alleler ikke kunne (figur 5E). I sidste ende bekræftede stimulering af disse celler med peptid-pulseret IHW03304, en muse DAP3-cellelinje transficeret med human HLA-DRB5*01:01, dette som det begrænsende HLA-molekyle (figur 5F). MHC-II+ NCI-H2444 og DAN-G tumorceller præsenterer ikke KRASG12V-afledt epitop til CD4+ T-celler. Dernæst undersøgte vi tumorcellernes kapacitet til direkte at præsentere KRASG12V-afledte epitoper på MHC-II. For at generere HLA-matchede MHC-II+-cellelinjer til disse undersøgelser transducerede vi KRASG12V+-cellelinjerne NCI-H2444 og DAN-G, afledt af henholdsvis human lunge- og bugspytkirtelcancer med CIITA og en konstruktion, der koder for HLA-DRB5*01: 01 med et trunkeret CD34-reportergen (figur 6A). I overensstemmelse med vores tidligere resultater var MHC-II+-tumorceller, der udtrykte den begrænsende HLA-allel, ikke i stand til at stimulere TCR-konstruerede T-celler, medmindre målceller først blev pulseret med eksogent peptid (figur 6B). Det er vigtigt, at der ikke var anførte somatiske mutationer i MHC-II-præsentationsgener (nemlig HLADMA, HLADMB, CD74) for hverken NCI-H2444 eller DAN-G i offentligt tilgængelige sekventeringsdata (23). NCI-H2444 CIITA-celler voksede uhæmmet i nærvær af TCR-konstruerede T-celler, hvorimod NCI-H2444 CIITA-celler pulserede med KRASG12V-peptid oplevede forsinket tumorvækst (figur 6C). I overensstemmelse med resultaterne opnået for HNSCC-56, CD8+ T-celler, der udtrykker en HLA-A*03:01- begrænset, KRASG12V-specifik TCR (24) var i stand til at genkende NCI-H2444-celler, men ikke CaSki-celler, som udtrykker HLA-A*03:01, men ikke KRASG12V (figur 6D). Disse resultater viser, at et distinkt onkogen, der er til stede i cytosolen, heller ikke kan præsenteres af MHC-II+ tumorceller på trods af, at det effektivt præsenteres på MHC-I. Ekspression af coinhiberende ligander såsom programmeret celledødsligand 1 (PD-L1) af tumorceller begrænser TCR-signalering i T-celler (25). For at bestemme, om denne mekanisme kan forhindre genkendelse af MHC-II+ tumorceller af CD4+ T-celler, dyrkede vi CD4+ T-celler, der udtrykker vores KRASG12V-specifikke TCR eller den E6-specifikke F12 TCR med henholdsvis NCI-H2444 CIITA og HNSCC-56 CIITA med eller uden anti-PD-L1-blokerende abs. Blokering af PD-L1/PD-1-interaktioner var ikke tilstrækkelig til at fremme tumorcellegenkendelse (Supplerende figur 3). Tilsvarende modulerede tilføjelsen af ​​anti-CD28-agonist Ab ikke tumorcellegenkendelse. Disse resultater tyder på, at en mangel på antigenpræsentation snarere end tilstedeværelsen eller fraværet af henholdsvis coinhibitoriske eller costimulerende signaler er ansvarlig for denne fænotype. Nogle undersøgelser tyder på, at endogene proteiner internaliseret fra plasmamembranen fortrinsvis indlæses på MHC-II til præsentation sammenlignet med andre subcellulære rum (26). Selvom KRAS-proteiner ofte er forbundet med membraner via lipidmodifikationer, udtrykker de ikke et transmembrant domæne, og disse interaktioner er ikke stabile (3, 27). Vi begrundede derfor, at forankring af det immunogene fragment af KRASG12V til plasmamembranen af ​​tumorceller kan muliggøre direkte antigengenkendelse af CD4+ T-celler. Tumorceller, der udtrykker KRASG12V-MITD-konstruktionen, som det fremgår af ekspressionen af ​​en P2A-koblet EGFP-reporter, var på samme måde ude af stand til at stimulere TCR-konstruerede CD-{109}}-T-celler (Supplerende figur 4). Disse resultater tyder på, at subcellulær onkogenlokalisering ikke er den eneste determinant for tumorcellernes direkte præsentation af MHC-II. Derudover tyder disse resultater på, at overekspression af antigenet ikke er tilstrækkelig til at fremme præsentationen af ​​MHC-II. Vores resultater hidtil tyder på, at tumorspecifikke CD4+ T-celler kan være mere tilbøjelige til at genkende antigener præsenteret af APC'er end af tumorceller selv. Derfor vurderede vi kapaciteten af ​​HLADRB5*01:01+ DC'er til at præsentere antigener afledt af eksogene proteiner. HLA-matchede DC'er genereret in vitro var i stand til at stimulere TCR-konstruerede CD4+ T-celler, der udtrykker den KRASG12V-specifikke TCR, når umodne DC'er enten blev pulseret med KRASG12V 20-mer-peptidet eller fodret med KRASG12V-helprotein, men ikke KRAS WT-protein (figur 6E). Disse resultater tyder på, at selvom TCR'en ikke kan genkende endogene antigener præsenteret af tumorceller, kan den genkende krydspræsenterede eksogene antigener i sammenhæng med DC'er.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Diskussion

Målet med denne undersøgelse var at bestemme, om TCR'er isoleret fra naturligt primede T-celler opnået fra patienter med cancer kunne genkende tumorceller, der udtrykker onkogener. Med hensyn til klasse I (HLA-A*02:01)-begrænset, HPV-16 E629-38 TCR opnået fra HNSCC TIL'er, blev anerkendelse, måske ikke overraskende, bekræftet for både en autolog tumorcellelinje og en velkarakteriseret HLA-matchet og E6--udtrykkende tumorcelle, CaSki (vigtigt, se figur 2). De samme TIL'er (Figur 1) indeholdt også et betydeligt antal IFN-producerende E6-specifikke CD4+ T-celler (Figur 3), som i modsætning hertil ikke genkendte E6- der udtrykker tumorceller, selv når de blev induceret til at udtrykke rigelig overflade MHC klasse II af den korrekt præsenterende allel (DQA1*01:02/DQB1*05:02) ved IFN-behandling eller CIITA-transduktion (figur 4). CIITA-ekspression inducerer ikke kun overfladeekspressionen af ​​MHC-II-proteiner, men også HLA-DM og invariante kædemolekyler, som er nødvendige for antigenbehandling og -præsentation (28). HLA-matchede B-celler blev derimod genkendt af denne TCR, når antigenet blev rettet mod MHC-II-vejen. En lignende situation blev observeret i tilfælde af en KRASG12V-specifik, HLA-DRB5*01:01-begrænset TCR, som kunne genkende HLA-matchede B-celler, men ikke MHC-II-udtrykkende tumorceller, når antigenet blev rettet mod MHC-II præsentationsvej. Begge TCR'er havde tilstrækkelig funktionel aviditet til at mediere genkendelsen af ​​endogent udtrykte antigener under de ovenfor beskrevne betingelser, og begge kunne mediere cytotoksiciteten af ​​peptidfyldte målceller. Sidstnævnte observation afspejler omstændighederne præsenteret i flere rapporter om cytotoksiske CD4+ T-celler, selvom vores data udvider konteksten for denne observation ved at vise, at endogen ekspression af kildeantigenet og induktion af MHC-II med IFN- er usandsynligt at give et fysiologisk mål på epitelafledte tumorceller for TCR'er mod nukleare eller membran-associerede antigener. Nylige undersøgelser af human blærekræft og melanom identificerede genetiske signaturer svarende til cytotoksiske CD4+ T-celler blandt TIL'er (14, 15). Funktionelt er disse cytotoksiske CD4+ TIL'er i stand til direkte MHC-II-afhængig tumorgenkendelse, hvilket i sidste ende fører til mållysis af granzymer på en måde, der ligner deres CD8+ modstykker. Imidlertid kan terapeutisk translation af disse fund være begrænset af det faktum, at få solide tumorer udtrykker MHC-II. Faktisk antydede resultater fra 2 uafhængige undersøgelser, at kun cirka en tredjedel af patienter med melanom har nogen MHC-II+ tumorceller, og hyppigheden af ​​disse celler i tumoren er ofte mindre end 10 % (15, 29). I stedet ser den dominerende cellulære kilde til MHC-II i tumormikromiljøet ud til at være infiltrerende leukocytter (26).

Figur 6. MHC-II+ KRASG12V+ tumorceller præsenterer ikke KRASG12V-afledte epitoper til CD4+ T-celler. (EN)

Selvom nogle solid-tumorceller udtrykker enten konstitutiv eller inducerbar MHC-II, viser vores resultater, at på trods af tilstedeværelsen af ​​onkogen-specifikke CD4+ T-celler blandt TIL'er og PBMC'er, kan disse celler ikke genkende og lysere antigenudtrykkende direkte MHC-II+ tumorceller, hvorimod epitoper fra det samme protein effektivt kan præsenteres for CD8+ T-celler på MHC-I (13). Dette tyder på, at blot at udtrykke et målantigen muligvis ikke er tilstrækkeligt til at give genkendelse af CD4+ T-celler for undergruppen af ​​tumorer, der udtrykker MHC-II. Ydermere ser disse resultater ud til at være konsistente på tværs af flere tumortyper, fordi cellelinjerne, der forespørges i denne undersøgelse, inkluderer dem, der er afledt af HNSCC, lungeadenokarcinom og bugspytkirtelkræft. Direkte CD4+ T-celle-genkendelse af melanomcellelinjer, der udtrykker MHC-II naturligt eller efter CIITA-transduktion er blevet rapporteret i 2 undersøgelser (30, 31). I begge disse undersøgelser genkendte en signifikant del af de testede TCR'er imidlertid ikke tumorceller direkte. Det er uklart, om disse TCR'er repræsenterer "bystander"-klonotyper, der ikke genkender tumorantigener eller tumorspecifikke TCR'er, som ikke er i stand til at genkende deres beslægtede antigen på grund af antigenpræsentationsmangler, såsom dem, der er fremhævet i denne undersøgelse. Oliveira et al. (31) viste, at direkte genkendelse af CD4+ T-celler var begrænset til 2 melanomer med ekstremt høje tumormutationsbyrder, hvilket tyder på, at denne fænotype kan give yderligere nødvendige ændringer, der tillader MHC-II-præsentation af tumorantigener. Selvom binding af en MITD til det immunogene fragment af KRASG12V ikke resulterede i direkte genkendelse af tumorceller af CD4+ T-celler, har undersøgelser beskrevet en bias for endogene peptider afledt af membranbundne proteiner elueret fra MHC-II, formentlig på grund af membrangenanvendelse (26, 32). Melanomantigenet Trp1 findes i plasmamembranen, hvilket kan lette direkte præsentation til CD4+ T-celler af B16-tumorceller (33). Et andet melanom-associeret antigen, gp100, præsenteres af tumorceller til CD4+ T-celler på en måde, der afhænger af gp100's transmembrane domæne (34). I nyere arbejde, der undersøgte rollen af ​​neoantigen-specifikke CD4+ T-celler i en murin sarkommodel, blev epitoper afledt af en muteret integrinunderenhed, også et membranbundet protein, elueret fra MHC-II på CIITA-transduceret tumor celler (35). Vores resultater tyder på, at selvom membranbundne proteiner fortrinsvis kan transporteres til endosomer til direkte præsentation på MHC-II, er tilstedeværelsen af ​​et immunogent membranprotein alene ikke tilstrækkelig til at fremme denne præsentation. Andre ikke-klassiske præsentationsveje er blevet beskrevet, som kan tillade cytosoliske eller nukleare proteiner adgang til MHC-II, herunder autofagi-associeret præsentation af intracellulære proteiner og transporter forbundet med antigenbearbejdning-afhængig præsentation til CD4+ T-celler, hvorved antigene peptider overføres formentlig fra MHC-I til MHC-II under membrangenbrug (36, 37). Direkte MHC-II-afhængig genkendelse af autologe tumorceller af CD4+ T-celler, der er specifikke for E7-epitoper, er blevet rapporteret (38, 39); imidlertid vedrørte disse undersøgelser begge E7-proteiner udtrykt af mindre udbredte onkogene HPV-undertyper (nemlig HPV-33 og HPV-59), præsenteret af livmoderhalskræftceller på HLA-DR-molekyler. Det er derfor muligt, at HPV-subtype, tumorhistologi og begrænsende HLA-alleler også kan være relevante faktorer i den differentielle præsentation af nukleære HPV-antigener på MHC-II+ tumorceller. Selvom vores data tyder på, at direkte tumorcytotoksicitet ikke er en sandsynlig mekanisme for E6- og KRASG12V-specifikke CD4+ T-celler, er andre antitumormekanismer for CD4+ T-celler blevet beskrevet, og adoptiv overførsel af tumorspecifikke CD4+ T-celler hos patienter med cancer har vist antitumoraktivitet (7, 40, 41). Derfor kan MHC-II-begrænsede TCR'er, såsom dem, der er identificeret i denne undersøgelse, være nyttige til ACT i humane patienter, givet sådanne TCR'ers målretning mod epitoper afledt af driver-oncoproteiner begrænset til HLA-haplotyper estimeret til 1,27% og 16,10% af US White indbyggertal for henholdsvis HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 og HLA-DRB5*01:01 (42). Navnlig hjælper CD4+ T-celler til priming af tumorspecifikke CD8+ T-celler ved at licensere antigenbærende DC'er på en CD40L-afhængig måde (43-45). Vi demonstrerer, at den KRASG12V-specifikke TCR identificeret i denne undersøgelse genkender krydspræsenterede antigener i sammenhæng med DC'er, hvilket tyder på, at disse celler muligvis kan bidrage til antitumorimmunitet via denne funktion. CD8+ T-celler kan også give lokal hjælp til CD8+ T-celler i tumorer ved at udskille cytokiner såsom IL-2 og IFN-, hvilket understøtter CD8+ T-celleoverlevelse og rekruttering til tumoren (46). Derudover kan CD4+ TIL'er genkende antigener i tumormikromiljøet på myeloide celler såsom makrofager. Faktisk har prækliniske undersøgelser vist, at i fravær af MHC-II på tumorceller kan adoptivt overførte Trp1 CD4+ T-celler stadig udøve antitumorimmunitet afhængig af IFN- og korrelere med øget cytotoksisk aktivitet af makrofager (47). Dette fænomen ser dog ud til at være afhængig af tumorantigensekretion, som vi også vil spekulere er minimal i tilfældet med de fleste onkogener. Samlet set fremhæver vores undersøgelse selektiviteten af ​​direkte præsentation af endogene antigener af MHC-II+ tumorceller og viser, at hverken CIITA-ekspression eller tilstedeværelsen af ​​et membranbundet antigen alene er tilstrækkeligt til at fremme direkte genkendelse af tumorceller af CD{{115} } T-celler. Flere undersøgelser er nødvendige for at karakterisere, hvilke antigener der kan præsenteres direkte af MHC-II+ tumorceller under hvilke betingelser for fuldt ud at forstå de kontekstafhængige roller af CD4+ T-celler i cancer.

cistanche planteforøgende immunsystem

Metoder

Cellekultur. TIL'er blev høstet og dyrket som tidligere beskrevet (48). Kort fortalt blev primært tumorvæv dissekeret i 2-3 mm fragmenter, som blev anbragt i en 24-brøndplade og dyrket i RPMI-1640 suppleret med 1{{102}}% humant AB-serum, penicillin-streptomycin, HEPES, gentamicin og 6,000 IE/ml IL-2. Ekstravaserede TIL'er blev dyrket ved halv-medie-erstatninger hver 2.-3. dag. Primære humane T-celler fra perifert blod blev dyrket i et 50:50 medium bestående af 50% AIM V plus 50% RPMI-1640 suppleret med 10% humant AB-serum, penicillin-streptomycin (100 U/ ml hver; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IE/mL IL-2, 5 ng/ml IL-7 og 5 ng/ml IL-15. Patient-afledte tumorcellelinjer blev genereret og dyrket som tidligere beskrevet (17). Kort fortalt blev primært tumorvæv skåret i fragmenter mindre end 2 mm og dissocieret under anvendelse af en GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Tumorceller blev resuspenderet i F-Media indeholdende 5 μM Rho-kinaseinhibitor og udpladet over et leje af bestrålede 3T3-fibroblaster (30 Gy). Efter indledende dyrkning blev tumorceller formeret i en 3:1-blanding af bestrålet 3T3--konditioneret medium og F-Media indeholdende 5 μM Rho-kinaseinhibitor. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L og B-LCL'er blev opretholdt i RPMI-medium suppleret med l-glutamin og HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10 % FBS, 1 mM natriumpyruvat (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM ikke-essentielle aminosyrer (Gibco, Thermo Fisher Scientific) og penicillin-streptomycin (100 U/ ml hver; Gibco). Vi opretholdt 293GP (ATCC) i DMEM-mediumtilskud med 10% FBS og penicillin-streptomycin (100 U/mL hver; Gibco, Thermo Fisher Scientific). IHW03304-, GM3107-, KAS011-, D8- og D66-celler var gaver fra Alessandro Sette (La Jolla Institute for Immunology). ELISPOT analyser. TIL'er eller PBMC'er blev udpladet med 100,000 celler pr. brønd i ELISPOT-plader coatet med antiIFN-Abs (1-D1K, Mabtech). Celler blev restimuleret med HPV-16 E6 og E7 PepMix (JPT) peptidpuljer, peptidpuljer, der repræsenterede udvalgte onkogene mutationer, eller indikerede individuelle peptider ved 5 ug/ml for pools eller 10 ug/ml for peptider i 22 timer før udvikling ELISPOT plader i henhold til producentens anvisninger (Mabtech). Til en positiv kontrol blev der anvendt 5 ug/ml phytohæmagglutinin-L. Ex vivo ekspansionskultur. PBMC'er blev udpladet med en peptidpulje, der repræsenterede udvalgte onkogene mutationer ved 5 ug/ml. Frisk medium indeholdende 10 IE/ml IL-2 blev tilsat på dag 4, 7 og 10. På dag 14 blev PBMC'er restimuleret til brug i enten ELISPOT eller cytokinsekretionsassays. TCR-sekventering. TIL'er eller PBMC'er blev restimuleret med 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) eller KRASG12V-peptid, og IFN--secernerende celler blev fluorescensmærket ved hjælp af Human IFN-Secretion Assay-kittet i henhold til producentens instruktioner (Miltenyi Biotec) . Enkelte IFN- +-celler blev sorteret i en 96-brøndplade ved hjælp af en FACSAria (BD Biosciences), og RNA-Seq blev udført ved hjælp af en Illumina Miseq for at identificere parrede TCR og kæder. Til identifikation af den E6-specifikke CD4+ TCR-klon blev IFN--secernerende celler sorteret som ovenfor, og TCR- og TCR-sekvenser blev amplificeret ved indlejret, multiplekset PCR, som tidligere beskrevet (49). PCR-produkter blev indsendt til Sanger-sekventering (ETON Biosciences). Til TCR-frekvensanalyse blev PBMC'er før og efter 14-dag ex vivo ekspansion med angivne peptider sendt til Adaptive Biotechnologies. HPV-ekspressionsanalyse. RNA blev isoleret fra Hu-56 primære tumorceller og tumorcellelinje og indsendt til bulk RNA-Seq. Paired-end sekventeringslæsninger blev kortlagt ved hjælp af BWA (v0.7.12) (50) til HPV's komplette genom (GenBank accessionsnr. NC_001526.2) og dets tilsvarende transkriptom. Den resulterende sekvensjusteringskortfil blev konverteret til et sorteret binært justeringskort og indekseret, efterfulgt af optælling af kortlagte læsninger ved hjælp af SAMtools (v1.2) (50). Hel-eksom-sekventering. Hel-exom-sekventering og RNA-Seq blev udført på La Jolla Institute for Immunology Sequence Core ved hjælp af henholdsvis Agilent hel-exom-indfangning og Illumina-kits. FFPE-bioprøver blev distribueret af Moores Cancer Center til Tempus til næste generations sekventering sammen med matchet reference-DNA ved hjælp af perifere blodprøver. Sekvenslæsninger fra exome-sekventering af tumoren og normale prøver blev justeret til referencegenomet GRCh38 ved hjælp af SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Exome-varianter blev identificeret ved hjælp af SpeedSeq Somatic, og varianter blev annoteret ved hjælp af SNPeff (v4.3i) (52). RNA-Seq og hel-exome sekventeringsdata for dette manuskript er blevet uploadet til NCBI BioProject, accessionsnummer PRJNA924789. T-celle retroviral transduktion. TCR-nukleotidsekvenser blev syntetiseret og klonet i MSGV1 retrovirus-rygraden under anvendelse af en BioXP 3200 (Codex). Sekvensen var kodonoptimeret til ekspression i humane celler. De humane TCR konstante regioner blev udskiftet med muse TCR konstante regioner med substitutioner for at øge overfladeekspression og fremme præferenceparring (53, 54). Humane PBMC'er blev isoleret fra buffy coats. CD4+ eller CD8+ T-celler blev fjernet ved magnetisk selektion, og den negative fraktion indeholdende alle resterende lymfocytter blev dyrket i et T-cellemedium med 50 ng/ml anti-CD3 Ab (OKT3) i 2 dage.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

TCR retrovirale supernatanter blev genereret ved cotransfektion af 293GP-celler med MSGV1-vektoren indeholdende den relevante TCR-sekvens og RD113-plasmid. To dage efter transfektion blev de retrovirale supernatanter høstet og enten brugt friske eller frosne ved -80 grader. Transduktioner blev udført på RetroNectin-coatede plader (Takara), som tidligere beskrevet (5). Muse TCR konstant region ekspression blev vurderet ved flowcytometri for at bestemme transduktion effektivitet. TCR-konstruerede T-celler blev ikke brugt tidligere end dag 7 efter initial stimulering. T-celle funktionelle assays. Vi dyrkede 5 × 104 TIL'er, transducerede T-celler eller J76 Jurkat-celler med 1 × 105 B-LCL'er pulseret natten over med angivne koncentrationer af peptid eller 5 × 103 tumorceller udsået den foregående dag i {{16} }brønd henholdsvis U-bund eller fladbund plader. Hvor det er angivet, blev anti-CD28-agonist (klon CD28.2, BioLegend) eller anti-PD-L1-blokerende (klon 29E.2A3, BioLegend) Abs tilsat til T-celle- og tumorcelle-samkulturer ved henholdsvis 5 og 10 ug/ml. Til cytokin- og aktiveringsmarkørassays blev 1 x celleaktiveringscocktail (BioLegend) indeholdende PMA og ionomycin brugt som en positiv kontrol. Til HLA-blokeringsundersøgelser blev 20 ug/mL af følgende Abs tilsat til peptidpulserede B-LCL'er mindst 2 timer før tilføjelsen af ​​T-celler: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend) eller muse-IgG2a-isotypekontrol (MOPC-173, BioLegend). Hvor det er angivet, blev tumorceller dyrket i 72 timer med 10 ng/ml rekombinant IFN- før tilsætning af T-celler. Supernatanter blev høstet efter 18-24 timer, IFN- blev målt ved ELISA (Thermo Fisher Scientific), og cellepelleter blev farvet til flowcytometri. Cytotoksicitetsassays blev udført ved co-dyrkning af T-celler med tumorceller ved angivne effektor-til-mål-forhold. Kort fortalt blev 5 x 103 tumorceller podet og dyrket natten over før tilsætning af T-celler i de angivne forhold. Målcellelyse blev bestemt ved hjælp af xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), som vurderede elektrisk impedans på grund af celleadhærens hvert 30. minut indtil slutningen af ​​eksperimentet. Dataene blev analyseret ved hjælp af xCELLigence RTCA-softwarepakken, og resultaterne blev rapporteret som celleindeks normaliseret til 1 på det tidspunkt, hvor T-celler blev tilføjet. MHC-II præsentationsassay. Syntetiske DNA-konstruktioner, der koder for følgende, blev genereret og klonet ind i MSGV1 under anvendelse af en BioXP 3200 (Codex): de N-terminale 25 aminosyrer af det humane HLA-B-gen, efterfulgt af de første 50 aminosyrer af HPV-16 E6 eller 25 aminosyrer af KRASG12V fusioneret til de C-terminale 55 aminosyrer af humant HLA-B, et T2A selvspalende element og den kodende sekvens af EGFP. Virale supernatanter blev genereret som beskrevet ovenfor, og autologe B-LCL'er blev transduceret på RetroNectin-coatede plader efter stimulering natten over på et leje af bestrålede (0,5 Gy) 3T3-celler, der udtrykker human CD40L (3T3-CD40L). Transduktionseffektivitet blev vurderet ved flowcytometrisk kvantificering af EGFP-ekspression. Transducerede B-LCL'er blev stimuleret med 3T3-CD40L i nærværelse af 200 IE/mL rekombinant human IL-4 (PeproTech) i 2 på hinanden følgende runder af 2-3 dage før samdyrkning med autologe TIL'er. Generering af DC'er til antigenpræsentationsassays. DC'er blev genereret ved hjælp af plastisk adhæsionsmetoden. Frosne PBMC'er blev optøet og udpladet i DC-medium (RPMI-1640 suppleret med l-glutamin, 5% varmeinaktiveret humant AB-serum og 100 U/mL hver penicillin-streptomycin) i 2 timer ved 37 grader. Ikke-klæbende celler blev fjernet ved vask med varm PBS, og klæbende celler blev dyrket i DC-medium suppleret med 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) og 500 U/mL IL-4 (PeproTech) i 6 dage . Vi tilsatte 1 ug/mL KRASG12V-peptid eller 20 ug/mL KRASG12V- eller WT KRAS-protein (Abcam) direkte til umodne DC'er natten over. Den næste dag blev DC'er høstet og co-dyrket med TCR-konstruerede T-celler i et 1:1-forhold natten over, før CD137-opregulering blev vurderet ved flowcytometri. Retroviral transduktion af tumorceller. Den kodende sekvens af human CIITA blev syntetiseret (Integrated DNA Technologies) og klonet ind i MSGV1 af Gibson Assembly. De kodende sekvenser af HLADRB5*01:01 og kæder adskilt af en P2A-sekvens blev syntetiseret (Integrated DNA Technologies) og klonet ind i en modificeret pHAGE lentiviral vektor opstrøms for en T2A-sekvens efterfulgt af en trunkeret CD34-reportersekvens af Gibson Assembly. Retrovirale supernatanter blev genereret med MSGV1 som beskrevet ovenfor. Lentivirale supernatanter blev genereret ved cotransfektion af 293T-celler med pHAGE, tat, rev, gag/pol og vsv-g plasmider. Virale supernatanter blev opsamlet 24 timer senere og koncentreret ved centrifugering i Amicon Ultra 5-rør (MilliporeSigma). Tumorceller blev udpladet, og 1 dag senere blev mediet erstattet med retroviral eller lentiviral supernatant suppleret med 10 ug/ml polybren. Fire timer senere blev den virusholdige supernatant aspireret og erstattet med et dyrkningsmedium. MHC-II+- og CD34+-tumorceller blev sorteret ved hjælp af en FACS Fusion-cellesorteringsmaskine (BD Biosciences). Flowcytometri. Celler blev mærket med fluorokrom-konjugerede monoklonale Abs til følgende antigener: anti-human CD3-PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4-PE-Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8-APC (Hit8a, Tonbo) , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) og anti-muse TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Døde celler blev farvet med enten DAPI eller LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer blev samlet og mærket af NIH Tetramer Core Facility. Celler blev farvet med 1 ug/ml tetramer i 1 time på is. Ab-farvning for overfladeantigener blev udført i 15 minutter på is. Til intracellulær cytokinfarvning (ICS) blev T-celler dyrket sammen med peptid-pulserede APC'er i 4-6 timer i nærvær af Brefeldin A. Celler blev permeabiliseret og farvet for intracellulære cytokiner med Cytofix/Cytoperm-kittet (BD Biosciences) efter overfladefarvning , i henhold til producentens anvisninger. Følgende fluorokrom-konjugerede Abs blev brugt til cytokinfarvning: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11) , BioLegend) og Granzyme B-PE (QA16A02, BioLegend). Data blev indhentet med et FACSCelesta flowcytometer (BD Biosciences) og analyseret med FlowJo v10.7 software. Statistikker. Statistiske analyser blev udført med Prism 8 (GraphPad Software). Til ICS-sammenligninger blev der brugt en uparret 2-halet t-test. Til sammenligning af HLA-blokerende Ab-Ab-medieret undertrykkelse af T-cellesignalering blev en 2-måde ANOVA brugt. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Studiegodkendelse. De afidentificerede humane prøver anvendt i denne undersøgelse blev opnået under informeret samtykke gennem UCSD IRB protokol 101391CX, "Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation." Skriftligt informeret samtykke blev givet af personerne i undersøgelsen.

Referencer

1. Hanahan D, Weinberg RA. Kræftens kendetegn: den næste generation. Celle. 2011;144(5):646-674.

2. Shamseddine AA, et al. Tumorimmunitet og immunterapi for HPV-relaterede kræftformer. Cancer Discover. 2021;11(8):1896-1912.

3. Simanshu DK, et al. Førende gennemgang af RAS-proteiner og deres regulatorer i human sygdom. Celle. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Et uventet stort polyklonalt repertoire af HPV-specifikke T-celler er klar til at virke hos patienter med livmoderhalskræft. Cancer Res. 2010;70(7):2707-2717.

5. Stevanović S, et al. Landskab af immunogene tumorantigener i vellykket immunterapi af viralt induceret epitelcancer. Videnskab. 2017;356(6334):200-205.

6. Bhatt KH, et al. Profilering af HPV-16-specifikke T-celle-responser afslører brede antigenreaktiviteter hos patienter med orofaryngeal cancer. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, et al. Tumorinfiltrerende BRAF V600E-specifikke CD4 + T-celler korrelerede med fuldstændig klinisk respons i melanom. J Clin Invest. 2018;128(4):1563-1568.

8. Veatch JR, et al. Endogene CD4+ T-celler genkender neoantigener hos lungecancerpatienter, herunder tilbagevendende onkogene KRAS- og ERBB2 (Her2)-drivermutationer. Cancer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, et al. Hukommelse T-celler rettet mod onkogene mutationer detekteret i perifert blod hos epitelkræftpatienter. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E, et al. T-celleoverførselsterapi rettet mod mutant KRAS i cancer. N Engl J Med. 2016;375(23):2255-2262.

11. Draper LM, et al. Målretning af HPV-16+-epitelkræftceller med TCR-genkonstruerede T-celler rettet mod E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431-4439.

12. Jin BY, et al. Konstruerede T-celler rettet mod E7 medierer regression af human papillomavirus-cancer i en murin model. JCI Indsigt. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS, et al. Biokemisk og funktionel karakterisering af mutante KRAS-epitoper validerer dette oncoprotein til immunologisk målretning. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY, et al. Intratumorale CD4+ T-celler medierer anti-tumor cytotoksicitet i human blærekræft. Celle. 2020;181(7):1612-1625.

15. Cachot A, et al. Tumorspecifikke cytolytiske CD4 T-celler medierer beskyttende immunitet mod human cancer. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, et al. T-celle receptor genterapi for humant papillomavirus-associeret epitelcancer: et første-i-menneske, fase I/II-studie. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759-2768.

17. Liu X, et al. Betinget omprogrammering og langsigtet udvidelse af normale celler og tumorceller fra humane bioprøver. Nat Protoc. 2017;12(2):439-451.

18. Veatch JR, et al. Neoantigen-specifikke CD4+ T-celler i humant melanom har forskellige differentieringstilstande og korrelerer med CD8+ T-celle-, makrofag- og B-cellefunktion. Kræftcelle. 2022;40(4):393-409.

19. Lowery FJ, et al. Molekylære signaturer af antitumor neoantigen-reaktive T-celler fra metastatiske humane kræftformer. Videnskab. 2022;375(6583):877-884.

20. Kreiter S, et al. Øget antigenpræsentationseffektivitet ved at koble antigener til MHC klasse I-trafiksignaler. J Immunol. 2008;180(1):309-318.

21. Zaretsky JM, et al. Mutationer forbundet med erhvervet resistens mod PD-1 blokade i melanom. N Engl J Med. 2016;375(9):819-829.

22. Gros A, et al. Genkendelse af humane gastrointestinale cancer neoantigener ved cirkulerende PD-1+ lymfocytter. J Clin Invest. 2019;129(11):4992-5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: et online cancercellelinjekatalog, der integrerer HLA-type, forudsagte neo-epitoper, virus og genekspression. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, opfindere; BioNTech US Inc., erhverver. T-cellereceptorkonstruktioner og anvendelser deraf. US patent nr. US202103040215A1. 4. november 2021.

25. Sharpe AH, Pauken KE. De forskellige funktioner af den PD1-hæmmende vej. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG, et al. Definition af HLA-II-ligandbehandling og bindingsregler med massespektrometri forbedrer forudsigelse af cancerepitop. Immunitet. 2019;51(4):766-779.

27. Silvius JR, et al. K-ras4B og prenylerede proteiner, der mangler "andet signaler", associerer dynamisk med cellulære membraner. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192-202.

28. Chang CH, Flavell RA. Klasse II-transaktivator regulerer ekspressionen af ​​flere gener involveret i antigenpræsentation. J Exp Med. 1995;181(2):765-767.

29. Rodig SJ, et al. MHC-proteiner giver differentiel følsomhed over for CTLA-4- og PD-1-blokade i ubehandlet metastatisk melanom. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, et al. Tumorinfiltrerende humane CD4+ regulatoriske T-celler udviser et særskilt TCR-repertoire og udviser tumor- og neoantigenreaktivitet. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G, et al. Landskabet af hjælpere og regulerende antitumor CD4+ T-celler i melanom. Natur. 2022;605(7910):532-538.

32. Rock KL, et al. Præsenter dig selv! Ved MHC klasse I og MHC klasse II molekyler. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y, et al. Et melanosomalt membranprotein er et celleoverflademål for melanomterapi. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837-1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomale målretningssekvenser fra gp100 er essentielle for MHC klasse II-begrænset endogen epitoppræsentation og mobilisering til endosomale rum. Cancer Res. 2006;66(4):2423-2432.

35. Alspach E, et al. MHC-II neoantigener former tumorimmunitet og respons på immunterapi. Natur. 2019;574(7780):696-701.

36. Dengjel J, et al. Autophagy fremmer MHC klasse II-præsentation af peptider fra intracellulære kildeproteiner. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, et al. Ikke-klassiske antigenbehandlingsveje er nødvendige for MHC klasse II-begrænset direkte tumorgenkendelse af NY-ESO-1- specifikke CD4+ T-celler. Cancer Immunol Res. 2009;2(4):341-350.

38. Höhn H, et al. CD4+ tumorinfiltrerende lymfocytter i livmoderhalskræft genkender HLA-DR-begrænsede peptider leveret af humant papillomavirus-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715-5722.

39. Höhn H, et al. Human papillomavirus type 33 E7 peptider præsenteret af HLA-DR*0402 til tumorinfiltrerende T-celler i livmoderhalskræft. J Virol. 2000;74(14):6632-6636.

40. Lu YC, et al. Behandling af patienter med metastatisk cancer under anvendelse af et større histokompatibilitetskompleks klasse II-begrænset T-cellereceptor rettet mod cancerkimlinjeantigenet MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322-3329.

41. Tran E, et al. Kræftimmunterapi baseret på mutationsspecifikke CD4+ T-celler hos en patient med epitelkræft. Videnskab. 2014;344(6184):641-645.

42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Allele frequency net database (AFND) 2020-opdatering: guldstandard dataklassificering, open access genotypedata og nye forespørgselsværktøjer. Nucleic Acids Res. 2020;48(d1): D783-D788.

43. Schoenberger SP, et al. T-cellehjælp til cytotoksiske T-lymfocytter medieres af CD40-CD40L-interaktioner. Natur. 1998;393(6684):480-483.

44. Ahrends T, et al. CD4+ T-celler hjælper med at give et cytotoksisk T-celle-effektorprogram, herunder coinhibitorisk receptornedregulering og øget vævsinvasivitet. Immunitet. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST, et al. cDC1 primer og er licenseret af CD4+ T-celler til at inducere antitumorimmunitet. Natur. 2020;584(7822):624-629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. CD4+ T-cellehjælp i tumormiljøet er påkrævet for rekruttering og cytolytisk funktion af CD8+ T-lymfocytter. Cancer Res. 2010;70(21):8368-8377.

47. Haabeth OAW, et al. CD4+ T-celle-medieret afvisning af MHC klasse II-positive tumorceller er afhængig af antigensekretion og indirekte præsentation på værts-APC'er. Cancer Res. 2018;78(16):4573-4585.

48. Dudley ME, et al. Generering af tumorinfiltrerende lymfocytkulturer til brug i adoptiv overførselsterapi til melanompatienter. J Immunother. 2003;26(4):332-342.

49. Dash P, et al. Enkeltcelleanalyse af T-cellereceptorrepertoire. Metoder Mol Biol. 2015;1343:181-197.

50. Li H, et al. Sekvensjustering/kortformat og SAM-værktøjer. Bioinformatik. 2009;25(16):2078-2079.

51. Chiang C, et al. SpeedSeq: ultrahurtig personlig genomanalyse og fortolkning. Nat Metoder. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, et al. Et program til annotering og forudsigelse af virkningerne af enkeltnukleotidpolymorfismer, SnpEff: SNP'er i genomet af Drosophila melanogaster-stamme w1118; iso-2; iso-3. Flyv (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, et al. Inkorporeringen af ​​transmembrane hydrofobe mutationer i TCR øger dens overfladeekspression og T-celle funktionelle aviditet. J Immunol. 2012;188(11):5538-5546.

54. Cohen CJ, et al. Forbedret antitumoraktivitet af T-celler konstrueret til at udtrykke T-cellereceptorer med en anden disulfidbinding. Cancer Res. 2007;67(8):3898-3903.