Behandling af diabetisk nefropati: kulilte

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Del Ⅱ: Kulilte lindrer senescens ved diabetisk nefropati ved at forbedre autofagi

Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & et al.

ABSTRAKT

Mål: Ælddom, karakteriseret ved permanent cyklusstop, spiller en vigtig rolle idiabetisk nefropati(DN). Mekanismen for nyreældning er dog stadig uklar, og behandlingen rettet mod den skal udforskes yderligere.

Materialer og metoder: DN (diabetisk nefropati) mus blev induceret af HFD og STZ, og 3 typer nyreceller blev behandlet med høj glucose (HG) for at etablere in vitro model. Ældre-relaterede og autofagi-relaterede markører blev påvist ved qRT-PCR og Western blot. Yderligere blev autofagi-hæmmere og co-immunpræcipitation brugt til at afklare mekanismen forCarbonmonoxid (CO). Derudover blev det specifikke forhold mellem autofagi og senescens udforsket ved immunofluorescens triple co-lokalisering og ELISA.

Resultater: Vi afslørede, at alderdom fandt sted in vivo og in vitro, som kunne vendes af CO (Carbonmonoxid). Mekanistisk viste vi, at CO (Carbonmonoxid) hæmmede dysfunktionen af ​​autofagi i DN (diabetisk nefropati) mus delvist ved at dissociere Beclin-1-Bcl-2-komplekset. Yderligere resultater viste, at autofagi-hæmmere blokerede forbedringen af ​​CO (Carbonmonoxid) om alderdom. Derudover afslørede dataene, at autofagi regulerede nedbrydningen af ​​alderdomsrelateret sekretorisk fænotype (SASP), inklusive -1, Il-6, Tgf- og Vegf. Konklusioner: Disse resultater tydede på, at CO (Carbonmonoxid) beskytter DN (diabetisk nefropaty) mus fra nyreældning og funktionstab via forbedret autofagi, delvist medieret af dissocierende Beclin-1-Bcl-2-kompleks, som muligvis tilskrives nedbrydningen af ​​SASP. Disse resultater bringer nye ideer til forebyggelse og behandling af DN (diabetisk nefropati) og reguleringen af ​​alderdom.

Klik for at Cistanche DHT for nyrefunktion

KLIK HER FOR AT DEL Ⅰ

4|DISKUSSION

Akkumulerende senescentceller anses i stigende grad for at være ondartede zombieceller, der er modstandsdygtige over for død, med evnen til at fremkalde vævsdysfunktion og fremme aldersrelaterede sygdomme. Forskere rapporterede, at transplantation af senescent precursor-fedtceller i 6-måned gamle mus forårsagede et dosisafhængigt fald i kropsfunktion.2 Omvendt forbedrede fjernelse af senescent celler en række aldersrelaterede sygdomme såsom T2D,30osteoarthritis31, og Alzheimers sygdom.32Vores resultater viste forekomsten af ​​alderdom i DN (diabetisk nefropati) mus og 3 typer nyreceller udsat for HG. Disse resultater og tidligere forskning antydede konsekvent tilstedeværelsen af ​​senescens i DN (diabetisk nefropati). Det er interessant, at blandt de 9 slags væv fra 27-måned gamle SD-rotter var nyreældning den tidligste og mest alvorlige, hvilket indikerer, at nyren var modtagelig for ældning.33 Baseret på disse fund spekulerede vi i, at behandlingerne rettet mod ældning celler kan beskytte mod DN (diabetisk nefropati). Nylige begrænsede beviser viste, at CO (Carbonmonoxid) lindrede lægemiddelinduceret senescens af endotelceller. På samme måde leverede vi resultater, som CO (Carbonmonoxid) signifikant nedregulerede en stor del af senescent fænotype og genfandt følgelig nyrefunktionen i DN (diabetisk nefropati) mus. Mens CO (Carbonmonoxid) har vist sig at udøve renobeskyttelse mod iskæmi-reperfusion og nyretransplantationsmus via anti-inflammatoriske, anti-apoptose og andre klassiske veje,4 vores undersøgelse foreslog en ny mekanisme, som CO (Carbonmonoxid) bibringer forbedring fra nyreældning af DN (diabetisk nefropati) mus.

Bortset fra de bredt anerkendte p53/p21- og p16-veje, er senescens blevet beskrevet som værende reguleret af autofagi positivt. Disse resultater og tidligere forskning antydede konsekvent tilstedeværelsen af ​​senescens i DN (diabetisk nefropati) I overensstemmelse hermed blev reduktionen af ​​autofagi fundet i nyrer med aldring.5 Desuden var der en negativ korrelation mellem Atg5 og nyrernes aldring af DN (diabetisk nefropati) mus, hvilket tyder på potentialet af anti-ældning af autofagi i DN (diabetisk nefropati). Vores resultater viste, at dysfunktionen af ​​autophagy og autophagy flow in vivo og vitro var positivt forbundet med akkumulerede senescerende celler. Interessant nok, CO (Carbonmonoxid) er blevet anset for at være en effektiv autofagi-aktivator. I vores undersøgelse, CO (Carbonmonoxid) aktiverede autofagi, men nedsatte autofagosomer. De yderligere data viste, at CO (Carbonmonoxid) forbedret lysosomal funktion og autophagy flow ved transfektion af RFP-GFP-LC3. Ydermere begrænsede autofagi-hæmmere og siAtg7 forbedringen af ​​senescens af CO (Carbonmonoxid) in vitro, der understøtter, at CO (Carbonmonoxid) bremsede alderdom via autofagi.

Ikke nok med det, dissocieringen af ​​Beclin-1-Bcl-2 kompleks af CO (Carbonmonoxid) blev observeret i DN (diabetisk nefropati) mus. Så vidt vi ved, fungerer Beclin-1 som en autofagi-initiator, når den er adskilt fra Bcl-2. Afbrydelsen af ​​komplekset kan være et potentielt mål for autofagi aktiveret af CO (Carbonmonoxid). Desuden aktiverede det at slå Beclin-1 og Bcl-2-bindingsstederne ikke kun autofagi, men forbedrede ældning og levetiden for mus,21, hvilket tyder på den komplekse koordineret regulerede autofagi og senescens. Vores eksperimenter viste, at dette komplekse dissociationsmiddel ABT737 yderligere forbedrede aktiveringen af ​​autofagi og forbedring af senescens af CO (Carbonmonoxid) in vitro. I overensstemmelse med vores resultater har en forstyrrelse af interaktionen af ​​Beclin-1-Bcl-2-komplekset en positiv indflydelse på flere sygdomme, herunder beskyttelse mod hjerteskader hos diabetiske kardiomyopati-mus i 3 grader og udøver renobeskyttelse på mus, der er udsat for iskæmi-reperfusion.37 Disse observationer indikerede, at CO (Carbonmonoxid) kan aktivere autofagi ved at dissociere Beclin-1-Bcl-2-komplekset for at lindre senescens og nyreskader.

FIGUR 5 Aktiveret autofagi kan nedbryde SASP i DN (diabetisk nefropati) mus.

A, Immunhistokemiske billeder og kvantificering af p65-ekspression og nuklear translokation (n=3). Målestok: 50 μm. B, Western blot-analyse af GATA4 (n=3).

C, Repræsentative immunfluorescensbilleder af mTOR, LC3 puncta og LAMP2 co-lokalisering i nyren. Målestok: 25 μm.

DG, Repræsentative immunfluorescensbilleder viste den tredobbelte co-lokalisering af IL-1, IL-6, TGF- og VEGF med LC3 og LAMP2 (de røde pile), og de hvide pile indikerede placeringen med LC3. Målestok: 25 μm.

H, Det totale VEGF-proteinniveau (cellelysat og supernatant) i HPC behandlet med forskellige formuleringer (HG, ABT737: 1 mmol/L, rapamycin: 10 nmol/L og CORM-2).

I, VEGF-proteinekspression i supernatanten af ​​HPC behandlet anderledes. J, VEGF-proteinfrigivelsesforhold for HPC (supernatant/totalt lysat) (n=6). *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>

Hvad mere er, kræver det specifikke forhold mellem autofagi og senescens yderligere belysning. Autophagy er en renseproces til at levere lukkede bestanddele til lysosomet til nedbrydning. Forskere påviste, at autofagi reducerede sekretionen af ​​Il-1, en vigtig SASP-komponent, gennem den nedbrydende vej. Overraskende nok blev co-lokaliseringen af ​​IL-1, LC3 puncta og LAMP2 observeret i nyrerne, hvilket tyder på nedbrydningen af ​​IL-1 af CO (Carbonmonoxid) behandling i DN (diabetisk nefropati) mus. Desuden er intracellulær I{{0}}, TGF- og VEGF, henholdsvis co-lokaliseret med LC3 puncta og LAMP2, hvilket indikerer skæringspunktet mellem autofagi og nedbrydningen af ​​SASP. Konsekvent blev den lægemiddelaktiverede autofagi bevist at reducere sekretionen af ​​IL-6 i chondrocytter,3", mens undertrykkelsen af ​​autofagi ved at slette Atg7 forårsagede øget eksport af IL-16.IL-6 og IL-8 i adipocytter og brystcancerceller.0 Imidlertid blev IL-1 rapporteret ikke at være et direkte substrat for autofagisk eliminering i makrofager1, hvilket tyder på, at SASP blev delvist nedbrudt af autofagi.

Bemærkelsesværdigt observerede vi, at SASP samlokaliserede med autofagosomer i nyren af ​​DN (diabetisk nefropati) mus (figur 5D-G, den hvide pil), hvilket indikerer, at SASP kan blive opslugt af autofagosomer, men undslipper lysosomer. Dette tilskrives potentielt sekretorisk autofagi ved, at autophagosomer ikke leveres til lysosomer, men i stedet fusionerer direkte med plasmamembranen, hvilket fører til frigivelse af cytosoliske komponenter (SASP) til det ekstracellulære rum. Imidlertid steg co-lokaliseringen af ​​SASP og autolysosomer meget i normal og CO (Carbonmonoxid)-intervenerede mus (figur 5D-G, den røde pil). Den mulige forklaring på dette fænomen er, at både autofagi-medieret sekretion og nedbrydning deltager i SASP-transport.3 Selvom reguleringen af ​​divergensen mellem udskillelse versus nedbrydning af det intracellulære indhold stadig mangler at blive fuldt ud forstået, fandt vi både CO (Carbonmonoxid)og autofagi-agonister blokerede eksporten af ​​VEGF i HPC behandlet med HG, hvilket tyder på, at aktiveret autofagi bidrog til SASP-nedbrydning. Derudover blev den nedsatte lysosomale funktion rapporteret at forårsage frigivelse af autolysosommaterialer i mikrogliacellen.4 CO (Carbonmonoxid)-induceret aktivering af autofagi og genoprettelse af lysosomal funktion kan føre til mere nedbrydning af SASP end sekretion.

Meget bevis viste, at udskilt SASP spillede en negativ rolle i nogle sygdomme. For eksempel blev SASP rapporteret at lette retinal vaskulær skade ved at overføre ældning i retinopati mus,4 inducere ældning og beskadige ikke-ældende galdeceller.46 Det er dog ukendt, om SASP er ansvarlig for DN (diabetisk nefropati) progression. Omics resultater viste, at inflammatoriske cytokiner blev opreguleret tidligt og især sent i DN (diabetisk nefropati).7 Konsekvent fandt vi, at masser af SASP blev udviklet i DN (diabetisk nefropati) mus, blandt hvilke IL-1 var øget mest signifikant sammenlignet med normale mus, og VEGF var co-lokaliseret med autolysosomer mest tydeligt i normal og CO (Carbonmonoxid)-intervenerede mus. Og behandlingen af ​​anti-IL-lgG svækkede nyreskader, herunder fibrose i db/db mus.48 Sletningen af ​​VEGF-B beskyttet mod DN (diabetisk nefropati) ved at reducere renal lipidakkumulering, mens overekspressionen af ​​VEGF-A i voksne mus forværrede nyredysfunktion og strukturændring.50Ovenstående data om reguleringen af ​​SASP antydede yderligere SASPs nøglerolle i DN (diabetisk nefropati). Vores undersøgelse viste også, at administrationen af ​​CO (Carbonmonoxid) hæmmede ekspressionen og udskillelsen af ​​SASP, hvilket efterfølgende forbedrede nyrefibrose og strukturelle ændringer. Derfor udledte vi, at blokeringsalderen for SASP-medieret senescens gennem nedbrydningsvejen for autofagi kan være en af ​​de mekanismer, hvorved CO (Carbonmonoxid) beskytter HFD plus STZ-induceret DN (diabetisk nefropati).

Samlet set tydede de nuværende resultater på, at CO (Carbonmonoxid) lindret renal senescens af DN (diabetisk nefropati) gennem forbedringen af ​​autofagi-medieret af dissocierende Beclin-1-Bcl-2-kompleks, som delvist blev tilskrevet nedbrydningen af ​​SASP. Vores undersøgelse kaster nyt lys over forebyggelse og behandling af DN (diabetisk nefropati) og regulering af renal senescens. Forventningsvis vil de specifikke virkninger af senescens på DN (diabetisk nefropati) er værdige til yderligere undersøgelse. På den anden side kan anti-ældningsmedicin blive et gennembrud i behandlingen af ​​DN (diabetisk nefropati) og andre aldersrelaterede sygdomme.

FIGUR 6 CO aktiverede autofagi delvist ved at dissociere Beclin-1-Bcl-2-komplekset.

A, Co (Carbonmonoxid)-immunpræcipitation af Beclin-1 og Bcl-2 og kvantificering af forholdet mellem Beclin-1 og Bcl-2 i nyren (n=3).

B, Western blot-analyse af en serie af autofagi-proteiner (LAPM2, p62 og LC3) i HBZY-1 behandlet forskelligt (HG, CORM-2 og Beclin-1-Bcl2 kompleks dissociationsmiddel ABT737) ( n=5).

C, Kvantificering af ekspressionen af ​​p53, p21 og p16 (n=5 eller 6).

D, SA- -gal-farvningsbillederne af 3 slags nyreceller behandlet forskelligt og statistiske resultater (n=3). Målestok: 50 μm. *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>

REFERENCER

1. Alicia RZ, Rooney MT, Tuttle KR.Diabetisk nyresygdom: udfordringer, fremskridt og muligheder. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-2045.

2. Consortium CKDP, Matsushita K, Vandervelde, et al. Sammenhæng mellem estimeret glomerulær filtrationshastighed og albuminuri med alle årsager og kardiovaskulær dødelighed i almindelige befolkningskohorter: en kollaborativ metaanalyse. Lancet.2010;375(9731):{{ 6}}. 3. Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, et al. Clearance af p16Ink4a-positive senescerende celler forsinker aldring-associerede lidelser.Nature. 2011;479(7372):232-236.

4. Kitada K, Nakano D, Ohsaki H, et al. Hyperglykæmi forårsager cellulær senescens via en SGLT2- og p21-afhængig vej i proksimale tubuli i det tidlige stadie af diabetisk nefropati. J Diabetes Complicat.2014;28(5):604-611.

5. Tsai YC, Kuo PL, Kuo MC, et al. Interaktionen mellem miR-378i-Skp2 regulerer celleældning ved diabetisk nefropati. J Clin Med. 2018;7(12):468.

6. Baker DJ, Childs BG, Durik M, et al. Naturligt forekommende p16(Ink4a)-positive celler forkorter en sund levetid. Natur. 2016;530(7589):184-189.

7. Al-Douahji M, Brugarolas J, Brown PA, Stehman-Breen CO (Carbonmonoxid), Alpers CE, Shankland SJ. Cyclinkinasehæmmeren p21WAF1/CIP1 er påkrævet til glomerulær hypertrofi ved eksperimentel diabetisk nefropati. Nyre Int. 1999;56(5):1691-1699.

8. Wolf G, Schanze A, Stahl RAK, Shankland SJ, Amann K. p27(Kip1)Knockout-mus er beskyttet mod diabetisk nefropati: bevis for p27(Kip1)-haplotypeinsufficiens. Nyre Int. 2005;68(4):1583-1589.

9. BharathLP, Agrawal M, McCambridge G, et al. Metformin øger autofagi og normaliserer mitokondriel funktion for at lindre aldringsassocieret inflammation.Cell Metab.2020;32(1):44-55.e6. 10. Ma Y, Qi M, An Y, et al. Autofagi kontrollerer mesenkymale stamcelleegenskaber og alderdom under knogleældning. Aldrende celle. 2018;17(1):e12709.

11. Garcia-Prat L, Martinez-Vicente M, Perdiguero E, et al. Autophagy opretholder stamness ved at forhindre ældning. Natur. 2016;529(7584):37-42.

12. Hartleben B, Gödel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Autophagy påvirker glomerulær sygdomsmodtagelighed og opretholder podocythomeostase i aldrende mus. J Clin Invest.2010;120(4):1084-1096.

13. Tagawa A, Yasuda M, Kume S, et al. Nedsat podocytautofagi forværrer proteinuri ved diabetisk nefropati. Diabetes. 2016;65(3):755-767.

14. Motterlini R, Otterbein LE. Det terapeutiske potentiale af kulilte. Nat Rev Drug Discov.2010;9(9):728-743.

15. Abe T, Yazawa K, Fujino M, et al.Højtrykskulilte bevarer rottenyretransplantater fra apoptose og inflammation.Lab Invest.2017;97(4):468-477.

16. Kim DS, Song L, Wang J, et al. Kulilte hæmmer ø-apoptose via induktion af autofagi. Antioxid redox signal. 2018;28(14):1309-1322.

17. Lee S, Lee SJ, Coronata AA, et al. Kulilte giver beskyttelse ved sepsis ved at øge beclin 1-afhængig autofagi og fagocytose.Antioxid Redox Signal.2014;20(3):432-442.

18. WS J, Li Y, Yang P, Huang Y, Lu S, Xu F. Romanrolle afcarbonmonoxidi forbedring af neurologiske resultater efter hjertestop hos ældre rotter: involvering af inducerende mitokondriel autofagi.JAm Heart AssoC.2019;8(9):e011851.

19. Zheng M, Chen Y, ParkJ, et al. CO (Carbonmonoxid) forbedrer endothelial senescens induceret af 5-fluorouracil gennem SIRT1-aktivering. Arch Biochem Biophys.2019;677:108185.

20. Jiang C, Zhang S, Li D, et al. Nedsat ferritin-ophagy-flux induceret af kost med højt fedtindhold medierer hepatisk insulinresistens via endoplasmatisk retikulumstress. Food Chem Toxicol.2020;140:111329.

21. Fernandez AF, Sebti S, Wei Y, et al. Afbrydelse af beclin 1-BCL2 autofagi regulatoriske kompleks fremmer levetiden hos mus. Natur. 2018;558(7708):136-140.

22. Liu M, Liang K, Zhen J, et al. Sirt6-mangel forværrer podocytskader og proteinuri ved at målrette Notch-signalering. Nat Commun.2017;8(1):413.

23. Sturmlechner I, Durik M, Sieben CJ, Baker DJ, van Deursen JM. Cellulær senescens ved nyreældning og sygdom. Nat Rev Nephrol. 2017;13(2):77-89.

24. Bird TG, Müller M, Boulter L, et al. TGF-hæmning genopretter et regenerativt respons ved akut leverskade ved at undertrykke parakrin senescens. Sci Transl Med.2018;10(454):eaan1230.

25. Stolz A,Ernst A,DikicI. Lastgenkendelse og handel med selektiv autofagi. Nat Cell Biol.2014;16(6):495-501.

Bemærk:ovenstående er ikke en fuldstændig referenceliste