Abstrakt:Brug afCistanche DeserticolaParasitisering af to værtsplanter (haloxylonammodendron og atriplex canescens) som testmaterialer bestemte denne undersøgelse polysaccharidindholdet i C. Deserticola fra forskellige værter ved anvendelse af phenolsulfursyremetoden. Transkriptomsekventering og analyse af haloxylon-cistanche ogAtriplex-Cistanche Associationsblev udført ved hjælp af Illumina Novaseq 6000 -sekventeringsplatform. Forskningen fokuserede på at undersøge transkriptomforskelle i C. Deserticola fra forskellige værter, screening af nøgleanzymatiske gener involveret i polysaccharidmetabolisme og validering af de valgte gener gennem QRT-PCR-verifikation. Denne undersøgelse sigter mod at give et teoretisk grundlag for at udforske nye værtsplanter og genetisk forbedring af C. Deserticola. Resultatet viste, at polysaccharidindholdet, der findes i Atriplex quadriptera-C.Deserticola, var bedre end den, der var til stede i haloxylon ammodendron-C. Deserticola. Gennem sammenlignende analyse af transkriptom blev 14089 differentielt udtrykte gener (DEG'er) screenet fra de kødfulde stængler af Atriplex quadriptera-C. Deserticola og Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Resultaterne af KEGG -berigelsesanalyse afslørede, at disse DEG'er var mest fremtrædende beriget i veje relateret til kulhydratmetabolisme, galactosemetabolisme, aminosyremetabolisme og fedtsyremetabolisme. Endvidere blev der opnået i alt 26 grader fra fire veje relateret til polysaccharidmetabolisme, blandt hvilke ekspressionsniveauerne af fructosidase -gen og -galactosidase -genet i haloxylon ammodendron -C. Deserticola var signifikant højere end dem i Atriplex Quadriptera-C. Deserticola. Ekspressionsniveauerne af UDP-glucose dehydrogenase-genet og mannose -1- phosphat guanylattransferase-genet i atriplex quadriptera-C. Deserticola var signifikant højere end dem i haloxylon ammodendron-C. Deserticola, som kan være de vigtigste enzymgener til regulering af forskellen mellem polysaccharidmetabolisme i C. Deserticola.

Nøgleord Cistanche Deserticola; Transkriptom -sekventering; værter; Forskel på polysaccharidmetabolisme

Cistanche Deserticola

 

Cistanche Deserticola YC MA, primært fordelt iGansu, Xinjiang, Ningxia og Indre Mongoliet, er en traditionel kinesisk medicinsk urt for nylig inkluderet i"Medicinal og madhomolog"katalog. Det har forskellige sundhedsmæssige fordele, såsomTonificering af nyre Yang, nærende essens og blod og fremme tarmbevægelser, hvilket gør det bredt anvendt imedicin, sundhedsydelser og fødevareindustrien[1]. På grund af detsHeterotrofisk natur, Cistanche Deserticolaparasiterer forskellige værtsplanter medHaloxylon ammodendronog den nyligt introduceredeSemi-Evergreen buskAtriplex canescens(Pursh) Nutt.at være dens primære værter.

Polysaccharider er de vigtigste aktive stoffer til evalueringCistanche Deserticolakvalitet. Under forskellige værtsbetingelser,Akkumulering og metabolisk sammensætningafCistanchePolysaccharider varierer markant [2]. Medicinsk forskning har vist detCistanchePolysaccharider besidderAntioxidant, neurobeskyttende, immunregulerende og hukommelsesforbedrendefarmakologiske effekter, hvilket effektivt lindrerAlzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og leverdepression-induceret miltmangel[3]. Med fremskridt i moderneEkstraktionsteknikker og multispektrumanalyseteknologier, TheIndhold, sammensætning og strukturelle egenskaberafCistanchePolysaccharider belyses gradvist og udvider deres applikationer.

Med hensyn tilMolekylær biologisk forskningpåCistancheArter, transkriptomsekventeringsundersøgelser har hovedsageligt fokuseret påCistanche TubulosaogHaloxylon-Cistanchekomplekse systemer.For eksempel,Hou et al.[4] udførteTranscriptome-sekventering i fuld længde og genekspressionsprofileringafCistanche TubulosaBrug afPacbio og BGISEQ -500 RNA-Seq Technologies, identificere237.772 Unikke udskrifterog screening af nøgleenzymgener involveret iPhenylethanoid glycosidbiosyntese. Tilsvarende,Feng et al.[5] udførtTranskriptomiske og metabolomiske analyseraf Haustoria og tilstødende væv fraHaloxylon rødder ogCistanchekødfulde stængler, afslører værtenes rolle i ophobningen afCistanchemetabolitter. Deres undersøgelse understregede, atVærtsplanten påvirker ikke kun udbyttet afCistanchemen også dens kvalitet. Dog forskning påCistancheParasitisering af forskellige værtsplanter forbliver begrænset.

Atriplex canescens, a dybt rodfæstet og meget stressbestandigt plante, adskiller sig fra den traditionelleHaloxylon værtog stammer frahalvtørre plateauer i det centrale USA. I de senere år er det blevet introduceret og forfremmet som enny vært tilCistanche DeserticolaDyrkningiNordvestlige Kina. En Qing et al.[6] analyseret og sammenlignetPolysaccharidakkumulering afCistancheParasitisering af haloxylon og atriplex canescensi det samme produktionsområde, fundetBetydelige forskelle i polysaccharidindholdmellem de to værtsbetingelser.

Således sigter denne undersøgelse mod atsekvens de kødfulde stængler afCistanche DeserticolaParasitisering af haloxylon og atriplex canescens, analyse afDifferentialekspression af nøgleenzymgener involveret i biosyntese af polysaccharid. Resultaterne vil give enTeoretisk fundament for yderligere forskning påCistanchePolysaccharid-biosyntesemekanismer, berige transkriptomiske undersøgelser af atriplex-Cistanchesystemer og fremme innovation i høj kvalitetCistancheGermplasm -ressourcer.

 

Materialer og metoder

1.1 Eksperimentelle materialer

Cistanche DeserticolaPrøver parasitiseringHaloxylon ammodendronogAtriplex canescensblev samlet fraCistancheDyrkningsbase iXiquan Town, Jingtai County, Gansu -provinsen(breddegrad36 grader 5 'n, længdegrad103 grad 42 'e). BeggeHaloxylonogAtriplex canescensblev dyrket i det samme miljø. Prøverne blev kategoriseret somHaloxylon-Cistanche(Prøve a)ogAtriplex-Cistanche(Prøve h),med tre replikater for hver kategori (fem planter pr. Replikat). Prøveudtagning blev udført imarts 2024, og prøverne blev identificeret somCistanche Deserticolakødfulde pærer forbiProfessor Guo YehongfraLandbrugshøjskolen, Gansu Landbrugsuniversitet.

EfterPrøveudtagningsretningslinjer for Shanghai Oe Biotech Co., Ltd., TheCistancheFødlige stængler blev skyllet med ultrapurvand, og overskydende fugt blev fjernet ved hjælp af filterpapir. Tynde skiver blev taget fraøverste, midterste og bundaf hver stilk, blandet grundigt og placeret i kryogene hætteglas. Prøverne varhurtigt frosset i flydende nitrogenfor2 timerinden du overføres til en-80 grad frysertil opbevaring [7].

1.2 Eksperimentelle metoder

1.2.1 Oprettelse af standardkurve og bestemmelse af polysaccharidindhold

A 10 mg filmdragereprøve afD-glucose-standardblev nøjagtigt vejet og opløst i en100 ml volumetrisk kolbemed destilleret vand til at fremstille en100 ug · ml⁻¹ Stamopløsning. Kalibreringsløsninger af{{0}}. 2, 0. 4, {{6}. 6, 0. 7, 0. 8 og 0,9 mlaf stamopløsningen blev overført til10 ml stoppede testrør, fortyndet med vand til1. 0 ml, og derefter blandet med1.. 0 ml på 6% phenolopløsningog5 ml koncentreret svovlsyre. Efter hvirvelning blev opløsningerne opvarmet i et kogende vandbad til20 minutter, derefter afkølet i et is-vandbad til10 minutter. A blank kontrolblev forberedt ved hjælp af1. 0 ml destilleret vandI stedet for glukoseløsningen. Absorbansen blev målt ved482 sømved hjælp af enUV-Vis spektrofotometerog aStandardkurveblev genereret medKoncentration (x) som den vandrette akseogAbsorbans (Y) som den lodrette akse.

Efter en modificeret tilgang fraLi Jie et al. [8], 0. 2 g tørretCistanchepulverblev nøjagtigt vejet og placeret i en20 ml stoppet reagensglas. 10 ml 80% ethanolblev tilsat, og blandingen blev udsat forUltralydsekstraktion ved 80 grader (100 W, 40 kHz) i 30 minutter. Ekstrakten blev filtreret, mens den var varm, og proceduren blev gentaget en gang. Efter tørring af resten10 ml destilleret vandblev tilsat, og ultralydsekstraktion blev gentaget to gange. Filtraterne blev kombineret og fortyndet til20 mlmed destilleret vand.1.. 0 ml af denne løsningblev yderligere fortyndet til10 mlmed destilleret vand.

A 1. 0 ml alikvotaf de forberedteCistanchePrøveopløsning blev analyseret under anvendelse af den samme procedure som glukosestandarden. Absorbansen kl482 sømblev målt og polysaccharidindholdet afCistancheFra forskellige værtsplanter blev beregnet.

1.2.2 RNA -ekstraktion, cDNA -bibliotekskonstruktion og sekventering

Total RNA blev ekstraheret fraCistanche DeserticolaPrøver parasitiseringHaloxylon ammodendronogAtriplex canescensBrug afTiangen DP441 RNA Kit (Kina)efterTrizol -reagensprotokol. RNA -renhed blev vurderet med enNanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, USA), mens RNA -koncentration og integritet blev evalueret ved hjælp af enAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

Transkriptombiblioteker blev konstrueret ved hjælp afVAHTS Universal V6 RNA-Seq Library Prep Kit. Efter kvalitetskontrol medAgilent 2100 Bioanalysator, blev bibliotekerne sekventeret påIllumina Novaseq 6000 platform, der genererer150 bp parret ende læser.

1.3 Dataanalyse

1.3.1 Transkriptomenhed og funktionel annotation

Raw læser indFastq -formatblev behandlet ved hjælp afTrimmomatiskat fjernePloy-N læser og læsninger af lav kvalitet, resulterer iClean læser. Adaptersekvenser og regioner af lav kvalitet blev fjernet, og de rene læsninger blev samlet iContigs(udtrykt sekvensmærker) ved hjælp afTrinity -software. Den længste transkription fra hver klynge blev valgt som enUnigeneFor yderligere analyse.

Funktionel annotation af unigenes blev udført ved at sammenligne dem medNCBI ikke-redundant (NR) proteindatabase, schweizisk-prot og den evolutionære slægtsforskning af gener: ikke-overvåget orthologe grupper (Eggnog) databaseBrug afDiamond Software (e-værdi <1e -5). Eukaryotiske ortologe grupper (KOG) annotationblev udført for at identificere homologe gener. Derudover blev unigenes kortlagt tilKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) PathwaysTil metabolisk sti -annotation.Gen Ontology (GO) Klassificering og funktionel annotationblev udført ved hjælp af kortlægninger fra den schweiziske-prot-database.

1.3.2 Genekspressionsanalyse og identifikation af differentielt udtrykte unigenes (DEG'er)

Genekspressionsniveauer blev kvantificeret ved hjælp afButterfly 2At justere rene læsninger til Unigenes. Ekspressionsværdier blev beregnet somFragmenter pr. Kilobase transkription pr. Million kortlagt læsninger (FPKM)Brug afExpress -software. Differentialekspressionsanalyse blev udført ved hjælp afDESEQ2 -software, medNegativ binomial distribution (NB) -testBruges til signifikansforsøg. Differentielt udtrykte gener (degs) blev defineret som dem medQ-værdi <0. 05ogFold Change (FC)> 2.

1.3.3 QRT-PCR-validering af differentielt udtrykte gener

Nøgleenzymgener involveret iPolysaccharid -biosyntesemedBetydelig differentiel ekspressionblev valgt tilKvantitativ realtid PCR (QRT-PCR) validering. RNA-prøver blev kvalitetskontrolleret, og OD-værdier blev målt før omvendt transkription. cDNA -syntese blev udført ved hjælp afTransscript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Supermix til QPCR Kit. Det syntetiserede cDNA blev fortyndet10- fold, og QRT-PCR blev udført ved hjælp af enFluorescerende QPCR -systemunder forskellige cykelforhold.ACTB (beta-actin) blev brugt som et internt referencegenog relative genekspressionsniveauer blev beregnet ved hjælp af2⁻ΔCT -metode.

 

Tabel 1 Primersekvenser

Gen ID	Gennavn	Fremadrettet primer (5 '-3')	Omvendt primer (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	GatAGTGGCTACAACATCCACTT	CCTCCTCTTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Ugdh	AaagatcttccAgttcgtaagc	ACCAATTCGTTGATGCTACC
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	Saca	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	Cactggcatcgacgaggaaag
-	Actb	Caatggatgatgatatcgccgcgt	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Dataanalyse

Hierarkisk klyngeanalyse afDifferentielt udtrykte gener (DEGS)blev udført ved hjælp afR (v3.2.0)At visualisere genekspressionsmønstre på tværs af grupper og prøver. GO (Gene Ontology) Berigelsesanalyse ogKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway berigelse analyseblev udført ved hjælp afRbaseret påHypergeometrisk distribution. De markant berigede funktionelle udtryk blev vist ved hjælp afsøjlediagrammer, boblepladser og berigelsescirkelpladser.

2 resultater og analyse

2.1 Polysaccharid -indholdsbestemmelsesresultater

Den lineære regressionsligning opnået fra absorbansmålingerne var:

y {{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. 1636 \ quad (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

med en lineær række20–90 ug · ml⁻¹. Præcisionen, gentageligheden, stabiliteten og prøveudvindingsgraden var{{0}}. 38%, 0. {{3}%, 0,53%og 99,67%henholdsvis.

Den måltePolysaccharidindholdiCistanche DeserticolaPrøver fra forskellige værtsplanter var:

Haloxylon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Transkriptomsekventering og datasamling

Transkriptomsekventering afSeks prøvergenererede i alt41,77 g rene data. De gyldige data pr. Prøve varierede fra6,89 g til 7,04 g, medQ30 -basisprocenter mellem 95,38% og 95,91%og enGennemsnitligt GC -indhold på 45,13%.

I alt61.423 Unigenesblev samlet med en samlet længde på65.962.858 bpog engennemsnitlig længde på 1.073,91 bp.

2.3 Genfunktionel annotation

I alt61.423 Unigenesblev opnået fra sekventering afCistanche DeserticolaPrøver parasiterer to forskellige værtsplanter. Annotationsresultaterne er som følger:

30.689 Unigenes (49,96%)blev annoteret iNR (ikke-redundant) proteindatabase.

18.698 Unigenes (30,44%)blev annoteret iSwiss-Prot-database.

3.998 Unigenes (6,51%)blev annoteret iKEGG -database.

17.188 Unigenes (27,98%)blev annoteret iKog (eukaryotiske ortologe grupper) database.

25.280 Unigenes (41,16%)blev annoteret iEggnog (Evolutionary Genealogy of Genes: Ikke-overvågede ortologe grupper) Database.

16.210 Unigenes (26,39%)blev annoteret iGO (Gen Ontology) Database.

16.153 Unigenes (26,30%)blev annoteret iPFAM (Protein Families) database.

Blandt disse,21.650 Unigenesvar længere end1 kb.

Homologiske analyse baseret påNR -databaseafslørede, at de tre mest mest beslægtede arter var:

Paulownia Fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium quinoa (7,1%)

 

 

Tabel 2 Annotationsoplysninger omCistanche DeserticolaGenfunktion

Database	Annotationsgennummer	Andel (%)
Nr	30,689	49.96
Schweizisk-Prot	18,698	30.44
Kegg	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
Eggnog	25,280	41.16
GÅ	16,210	26.39

 

 

2.4 Gå og kegg funktionel annotation og klassificering

DeGO (Gen Ontology) Databaseblev brugt til yderligere at kommentere de unigenes, der blev identificeret iNR -databaseresulterer i i alt16.210 Unigenes. Disse unigenes blev kategoriseret iTre hovedfunktionelle grupper:

Biologisk proces (BP)

Molekylær funktion (MF)

Cellulær komponent (CC)

IBiologisk proces (BP) kategori, de mest rigelige unigene -klynger var:

"Cellulær proces" (11.023 Unigenes)

"Metabolisk proces" (9.117 Unigenes)

ForCellular Component (CC) kategori, 17 underkategorierblev identificeret, hvor hver underkategori indeholdt mindst30 Unigenes. De største klynger var:

"Celle" (13.947 Unigenes)

"Cell Del" (13.918 Unigenes)

IMolekylær funktion (MF) kategori, de mest berigede funktionelle grupper var:

"Binding" (10.039 Unigenes)

"Katalytisk aktivitet" (8.490 Unigenes)

Fig.2 GO Funktionel annotation og klassificering af unigenes

 

Kegg Funktionel annotation og klassificering

UnderTranskriptom -sekventering, i alt3.998 Unigenesblev annoteret iKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Database. Disse unigenes blev klassificeret iSeks primære kategorier, med deres respektive unigene -tællinger og proportioner som følger:

Cellulære processer: 326 Unigenes (8.15%)

Miljøinformationsbehandling: 299 Unigenes (7.47%)

Genetisk informationsbehandling: 1.771 Unigenes (44.30%)

Menneskelige sygdomme: 14 Unigenes (0.35%)

Metabolisme: 1.465 unigenes (36.64%)

Organismale systemer: 123 Unigenes (3.07%)

Disse seks primære kategorier blev yderligere opdelt i20 sekundære klassificeringsniveauer. Blandt dem,Genetisk informationsbehandlinghavde den højeste andel, efterfulgt afMetabolisme. Inden forMetabolismeKategori, de mest rigelige veje var:

Kulhydratmetabolisme

Fedtsyremetabolisme

Flavonoid metabolisme

Fig.3 Kegg Metabolic Pathway Annotation of Unigenes

 

2,5 Differentialgenekspression og berigelseanalyse afCistanche Deserticolafra forskellige værter

Transkriptomsekventeringsdata blev filtreret ved hjælp afStandarddifferentialudtryksvalgskriterierhvilket resulterer i identifikation af14.089 Differentielt udtrykte gener (DEGS):

6.576 gener blev opreguleret

7.513 gener blev nedreguleret

A Volcano plotblev genereret for at visualisere den samlede fordeling af DEG'er.

ITop 30 GO berigelse Funktionelle klassifikationerAf DEG'er blev det observeret, at:

Sammenlignet medBiologisk proces (BP)ogCellulær komponent (CC)kategorier,Molekylær funktion (MF)udstillede en mere markant deg -berigelse.

De mest bemærkelsesværdige berigede DEG'er var forbundet medNukleinsyremetabolisme, proteinmetabolisme og nøgleenzymer i galactosemetabolisme.

Derudover blev DEG'er markant beriget iGO Betingelser relateret til polysaccharidmetabolismeinklusive:

Stivelsesmetabolisk proces

Glykogenbiosyntetisk proces

Sucrose katabolisk proces

Glucosidase -aktivitet

UDP-L-Rhamnose-syntaseaktivitet

Polysaccharid -hydrolaseaktivitet

Fig.4 Vulkansk kort over differentielt udtrykte gener

 

Kegg Pathway berigelseanalyse af degs iCistanche Deserticolafra forskellige værter

For yderligere at undersøgeDifferentielt udtrykte gener (DEGS)iCistanche Deserticolafra forskellige værtsplanter,Kegg Pathway berigelseanalyseblev udført. Analysen afslørede, at:

DEG blev kortlagt til 117 metaboliske veje.

DeTop 20 vejevisteBetydelig DEG -berigelse, med de mest berigede veje inklusive:

Fedtsyremetabolisme

-Linolensyre metabolisme

Galactose metabolisme

Lysinnedbrydning

En yderligere berigelsesanalyse afTop 20 metaboliske kategorier med de mindste Q-værdierindikerede, at DEG'er var signifikant beriget i:

Organismale systemer

Metabolisme

Genetisk informationsbehandling

Blandt disse kategorier,"Metabolisme"Havde det højeste antal berigede DEG'er og viste den mest markante berigelse. Derudover i de berigede metaboliske veje,Andelen af ​​opregulerede og nedregulerede unigenes var næsten lige ens.

Disse fund antyder detMetaboliske veje spiller en afgørende rollei den differentielle genekspression afCistanche Deserticolafra forskellige værtsplanter, især iLipid, kulhydrat og aminosyremetabolisme.