Effekt af kinesisk urtemedicin Cistanche på tidlig embryo-føtal udvikling

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3 *

[Abstrakt]Brug grisEmbryonerfra in vitro-befrugtning til forskning og sammenligning. Effekten af at tilføjeKinesiskmedicinIngredienserCistancheog Astragalus til udviklingen aftidlige embryoneri mediet NCSU-23 blev bevist. Eksperimentet viste, at: (1) Volumenforholdet på 0,10%Cistancheog 0,10% Astragalus blev tilsat til kultur bouillon, ogCistancheadditionsgruppe Blastocysthastigheden (15,76 %) var signifikant højere end for den tomme gruppe (9,26 %) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0,05), hvilket angiver, atCistanchedeserticolakan fremme betydeligttidlig embryonaludvikling. 2) Når koncentrationen (V/V) afCistancheer 0,05% og 0,10%, blastocysthastigheden (17,02% og 16,75%) er signifikant højere end den tomme gruppe (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">KinesiskmedicinCistanchei kulturmediet på 2-cellestadiet var blastocystudviklingshastigheden (13,81 %) signifikant højere end på 4-cellestadiet (7,53 %) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchefør spaltning (13,67%) ) Er lidt højere, men forskellen er ikke indlysende (P>0,05).

På grund af forskellene i udviklingsmiljøet in vivo og in vitro,Embryonervil blive beskadiget af frie radikaler under in vitro-kulturen hos tidlig grisEmbryoner, der forårsager cellemetabolismeforstyrrelser eller skade på DNA, RNA og proteiner [1]. For yderligere at forbedre udviklingshastigheden for in vitro-befrugtning med frossen sæd undersøgte dette eksperiment at tilføje en vis koncentration afCistancheog Astragalus for at forbedreembryoudviklingsmiljø in vitro.

1. Materiale og metoder

1. 1 Kulturforhold:

In vitro-modning af svineocytter, in vitro-befrugtning og in vitro-dyrkning af tidlige embryoner blev alle udført i en inkubator med 5 % CO2 og en maksimal mættet fugtighed på 39 °C.

1.2 Reagenser og dyrkningsmedium:

Oocytmodning basalvæsken er NCSU-23, oocytvaskevæsken er PVA-TL-HEPES-væske, befrugtningsvæsken er Tris-buffer (mTBM) indeholdende 0,1% BSA, og sædvaskevæsken er Dubeccos med 0,1% BSA. Fosfatbufret saltvand (DPBS), sædoptøningsvæske er BTS, cumulusvæske er 1 mg / ml hyaluronidase PBS, oocytoperationsvæske er HEPES-bufferet NCSU-23, og tidlige embryoner basisk kulturvæske suppleres med 0,4% BSA NCSU-23, tilsæt (V / V) 0,05% ~ 0,15% Cistanche efter behov, brug BTS til optøning af sæd. Før brug forvarmes og ligestilles i mere end 4 timer i en inkubator, der indeholder 5 % CO2-luft og en maksimal mættet fugtighed på 39 °C [2].

1.3 Kogemetoden for kinesisk medicin Cistanche:

Cistanche-opløsning: Tag 5 g og læg det i et 100 ml bægerglas, tilsæt ultrarent vand og nedsænk det i ultrarent vand, kog på høj ild, og hold det kogende i 20 minutter, og saml derefter suppen; gentag ovenstående proces, saml 3 gange i træk, konstant volumen til 100 ml, 0,22 μm filterreserve. Astragalus-opløsning: Tag 5 g og læg det i et 100 ml bægerglas, tilsæt ultrarent vand og nedsænk det, kog på høj ild, og hold det kogende i 20 minutter, og saml derefter den medicinske suppe; gentag ovenstående proces, saml 3 gange i træk, indstil lydstyrken til 100 ml, filtrer 0,22 μm ekstra.

Kinesisk medicinNaturlægemidler:Cistanche

1.4 In vitro-modning af svineocytter:

Æggestokkene hos søer blev indsamlet fra Beijing Pengcheng Food Slaughterhouse, anbragt i 0,9% normal saltvand indeholdende antibiotika ved ca. 38 °C, transporteret tilbage til laboratoriet inden for 4 timer og vasket med normalt saltvand tre gange. Brug en 10 ml sprøjte med en 12-gauge nål til at ekstrahere oocytter med 2-6 mm diameter follikler på overfladen af æggestokken. Vask 3 ~ 4 gange i TL-HEPES-opløsning og 3 ~ 4 gange i NCSU-23, der er blevet ligestillet i en kuldioxidinkubator i mere end 4 timer. Overfør 20 ~ 30 oocytter som en gruppe til 100 μL, tilsæt 10% PFF, 10 IE / ml HCG, 10 IE / ml PMSG, 10 ng / ml EGF NCSU-23 dråber og kultur i ca. 22 timer, Skift medium til NCSU-23 dråber med 10% PFF, 10 ng / ml EGF og fortsæt med at dyrke i 44 ~ 46 timer [3].

1.5 Sædkata capacitation og in vitro-befrugtning:

MTBM-opløsningen fremstilles uden koffein og BSA, og den ligestilles i 48 timer i en inkubator med 5 % CO2 og en maksimal mættet fugtighed på 39 °C, idet pH-værdien justeres inden for området 7,2 ~ 7,8; Tilsæt koffein og BSA 44 timer før brug, og fortsæt med at udligne. Sæden blev testet for kvalitet, og 10 ml blev centrifugeret ved 900 r/min i 3 minutter, 10 ml DPBS-opløsning indeholdende 0,1% BSA blev tilsat til suspension og centrifugeret ved 900 r/min i 3 min [3]; efter at 1 ml TBM-opløsning blev suspenderet, blev den vippet 60 ° Opstrøms energihøstningsbehandling udføres i en inkubator med 5% CO2-luft og en maksimal mættet fugtighed på 39 ° C i 1 time [3 ~ 5]. Oocyt-cumulus-cellekomplekset, der modnes til 44 ~ 46, anbringes i oocytvaskeopløsningen indeholdende 0,1% hyaluronidase, og cumuluscellerne fjernes ved pipettering, og derefter udsættes oocytterne. Vask 3 gange i den afbalancerede TBM, og læg til sidst hver 10-15 stykker i en gruppe på 50 μL TBM, og vent på sædcellerne [6, 7]. 50 μL opstrøms sæd fra kapacitans injiceres i en dråbe TBM-holdige oocytter, og der udføres befrugtning i 6 timer i en inkubator med 5 % CO2 og en maksimal mættet fugtighed på 39 °C.

1.6 Tidlig udvikling og påvisning af befrugtede æg:

Efter 6 timers befrugtning blev oocytterne behandlet med NCSU-23 bufret med driftsvæsken HEPES eller NCSU-23 med 0,4% BSA i embryokulturvæsken. 23 Skyl 3 gange, skift mediet til en afbalanceret 0,4% BSA NCSU-23 dråbe og inkuber i mere end 8 dage. Kontroller splithastigheden for hypotetiske befrugtede æg på 2. dag, kontroller morulahastigheden (+ blastocysthastigheden) på den 6. dag, og kontroller blastocysthastigheden på den 8. dag [8]. Alle blev undersøgt og optaget under kropsspejlet.

1.7 Eksperimentelt design:

1.7.1 Virkningen af traditionelle kinesiske lægemiddelingredienser Cistanche på tidlig embryonudvikling.

Wuzhishan gris[8] Efter kapacitansering, in vitro-befrugtning, er befrugtningen afsluttet, og efter spaltningen sker, udveksles embryonerne, indtil de tilsættes til 0,1% (V / V). Cistanche, 0,1% astragalus og NCSU-23 (0,4% BSA) uden vigtige ingredienser (blank gruppe) blev dyrket for at observere udviklingen af befrugtede æg og tidlige embryoner og bedømme virkningerne af de to traditionelle kinesiske medicinkomponenter på tidlig in vitro embryoudvikling Indflydelse.

1.7.2 Virkningen af koncentrationen af Cistanche på den tidlige udvikling af embryoner.

Wuzhishan svinesæd er kapaciteret og gennemgår in vitro-befrugtning. Efter befrugtningen er afsluttet, ændres væsken til henholdsvis 0% (tom gruppe), 0,05%, 0,1% og 0,1%. I 15% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA) observere udviklingen af befrugtede æg og bedømme indflydelsen af forskellige koncentrationer af kinesisk medicin komponent Cistanche på tidlig in vitro embryonudvikling.

1.7.3 Virkningen af Cistanche-tilsætningsperioden på den tidlige embryonudvikling.

Wuzhishan svinesæd er kapacitans og gennemgår in vitro-befrugtning. Efter befrugtningens afslutning splittes det befrugtede æg til 2-cellestadiet, og det befrugtede æg splittes til 4-cellestadiet, væsken udveksles og tilsættes separat. 0,1% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), observere udviklingen af befrugtede æg og bedømme effekten af tilsætning af cistanche på tidlig in vitro embryonudvikling på forskellige stadier.

1.8 Statistisk analyse:

Brug SPSS13.0 chi-square (χ2) test og envejsanalyse af varians.

Virkninger af cistanche ekstrakt

2. Resultat i analyse

2. 1 Indflydelsen af traditionelle kinesiske mediciningredienser på tidlig embryonal udvikling

Som vist i tabel 1 var morulahastigheden i Cistanche- og Astragalus-gruppen ikke signifikant forskellig fra den tomme gruppe (P>0,05). Blastocysthastigheden for de to grupper var højere end for den tomme gruppe, og blastocysthastigheden for Cistanche-gruppen var forskellig fra den tomme gruppes. Betydningsfuld (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">

2.2 Indflydelsen af koncentrationen af den kinesiske lægemiddelingrediens Cistanche på den tidlige embryonale udvikling

Som vist i tabel 2 har tilsætningen af Cistanche i en volumenkoncentration på 0,05% til 0,10% i embryokulturvæsken en bedre fremmende virkning på WZSP frossen sædvæske in vitro-befrugtningsembryoner, og blastocysternes udviklingshastighed er signifikant forskellig fra den blindprøvegruppes (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">

2.3 Virkningen af at tilføje en periode med kinesisk medicin ingrediens Cistanche på den tidlige embryonale udvikling

Som vist i tabel 3 har tilsætningen af Cistanche ved en volumenkoncentration på 0,10% i 2-cellestadiet efter test og analyse en bedre fremmende virkning på WZSP's frosne sædvæske in vitro-befrugtningsembryo, og der er ingen signifikant forskel fra tilsætningen før spaltningen (P>0,05). Der var dog en signifikant forskel sammenlignet med tilsætningen af 4 celler (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">

3. Drøftelse

Sammenlignet med den normale udviklingEmbryonerin vivo, udviklingsmiljøet for IVF befrugtetEmbryonerer væsentligt anderledes. Under processen medembryovækst og opdeling, en stor mængde Nr., Frie Radikaler og nogle giftige stoffer produceres, hvilket er ugunstigt for embryovækst. Normalt kan udvikling af embryoner i kroppen eliminere disse ugunstige faktorer gennem metabolisme i det indre miljø; disse ugunstige faktorer vil altid ophobes i embryovækstmiljøet ved in vitro-befrugtning. Den traditionelleKinesiskmediciningrediensCistanchekan have den funktion, at den ikke reducerer koncentrationen og eliminerer visse frie radikaler med henblik på yderligere at forbedre udviklingshastigheden for in vitro-befrugtning med frossen sæd. Eksperimentet undersøgte at tilføje en vis koncentration afCistancheog Astragalus. Resultaterne bekræftede, at Astragalus ikke havde nogen effektiv effekt på at forbedre in vitro-kulturmiljøet. En ordentlig koncentration afCistanchehar en vis fremmende virkning påtidligt embryoudvikling, men når koncentrationen afCistancheoverstiger en vis koncentration, har den også en hæmmende virkning påembryoudvikling.

Vi undersøgte yderligere de forskellige virkninger afCistanche, en traditionelKinesiskmedicinkomponent, på forskellige stadier, og eksperimentet viste, attidlige embryonerhar en højere udviklingshastighed i den senere fase, nårcistanchetilføjes på 2-celletrinnet. Den mulige årsag skyldes receptorens ydre miljø. Nitrogenoxid (NO) er et signalmolekyle og cytotoksisk faktor med en bred vifte af biologiske aktiviteter. Effekten af NO påtidligt embryoudviklingen skal spores tilbage tiltidlig embryonaludviklingsstadium, som kan være forårsaget af en af årsagerne til 2-celleblok (2-celleblok) i pattedyrs embryokultur, og in vitro-blok af svin forekommer i 4-cellestadiet [9]. Tilføjelsen af traditionelleKinesiskmediciningredienser kan eliminere de frie radikaler af NO til en vis grad og lindre de ugunstige faktorer afembryovækst [10].

Cistanche

Referencer

[1] Comport M. Tre modeller af frie radikaler-induceret celle infury[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72( 1/2) :1- 56.

[2] Pan Dengke. Undersøgelse af de faktorer, der påvirker udviklingen af svineomatiske celler klonetEmbryoner[D]. Beijing: China Agricultural University, 2005.

[3] Zhang Yunhai. Forskning i produktion af svin klonetEmbryonerved hjælp af somatisk celle nuklear overførselsteknologi [D]. Beijing: China Agricultural University, 2005.

[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun, et al. Virkninger af tilsætning af kvægserum og follikulær væske fra svin under modning på nuklear modning af svineoocytter ogtidlig embryonaludvikling efter in vitro-befrugtning [J]. Heilongjiang Husdyrhold og veterinærmedicin, 2002, (8):1- 3.