Total Glycosider Of Cistanche Deserticola fremmer neurologisk funktionsgendannelse ved at inducere neurovaskulær regenerering via Nrf- 2/Keap-1-vej hos MCAO/R-rotter

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng og Yong Jiang

Baggrund:Den traditionelle kinesiske medicin Cistanche deserticola er blevet rapporteret at være gyldig for hjerte-kar- og cerebrovaskulære sygdomme. Dets aktive komponenter til beskyttelse af iskæmisk slagtilfælde er imidlertid ikke klare. Vi havde til formål at udforske de aktive komponenter iC. deserticolamod iskæmisk slagtilfælde såvel som dets potentielle mekanismer.Metoder:Vi undersøgte de hjernebeskyttende virkninger af ekstrakter fraC. deserticola, totale glycosider (TG'er), polysaccharider (PS'er) og oligosaccharider (OS'er) i en rottemodel af okklusions-reperfusion af den midterste cerebrale arterie (MCAO/R). 2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-farvning blev brugt til at vurdere cerebralt infarktvolumen, og Evans blue assay blev anvendt til at vurdere blod-hjernebarrieren (BBB) ​​permeabiliteten. Derefter udtrykkene CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 og Nrf{{ 12}} blev analyseret ved hjælp af western blotting eller immunfluorescens, og aktiviteterne MDA, SOD, CAT og GSH-Px blev analyseret ved hjælp af kits.Resultater:TGs-behandling reducerede bemærkelsesværdigt neurologiske deficit-score og infarktvolumener, fremmede angiogenese og neural ombygning og opretholdt effektivt blod-hjerne-barriere-integritet sammenlignet med modelgruppen. Desuden reducerede TG'er signifikant MDA-niveauer og øgede antioxidantaktiviteter (SOD, CAT og GSH-Px) i hjerner. I mellemtiden nedregulerede TG'er bemærkelsesværdigt Keap-1 udtryk og lettede Nrf-2 nuklear translokation. Tværtimod blev der ikke observeret nogen beskyttende virkninger for PS'er og OS'er grupper.Konklusion:TG'er er de vigtigste aktive komponenter afC. deserticolamod MCAO/R-induceret cerebral skade, og beskyttelsen sker hovedsageligt via Nrf-2/Keap-1-vejen.

Nøgleord: Cistanche deserticola, cerebral skade, totale glykosider, polysaccharider, oligosaccharider, Nrf-2/Keap- 1-vej

INTRODUKTION

Slagtilfælde anses for at være en væsentlig årsag til død og handicap i verden (Donnan et al., 2008). Næsten 87 procent af alle slagtilfælde udløses af iskæmisk slagtilfælde (Ovbiagele og Nguyen-Huynh, 2011). I øjeblikket er det mest effektive middel og det eneste FDA-godkendte lægemiddel, der anvendes til behandling af iskæmisk slagtilfælde, rekombinant vævsplasminogenaktivator. Et stort antal apopleksipatienter reagerer imidlertid ikke på dette lægemiddel på grund af dets snævre terapeutiske tidsvindue og en alvorlig risiko for hæmoragiske komplikationer (Lee et al., 2012; Schellinger og Kohrmann, 2014). En stor udfordring ved trombolytisk behandling er iskæmi/reperfusion (I/R) skade, som betragtes som hovedårsagen til hjerneskade og funktionsdestruktion. Reperfusion efter cerebral iskæmi øger risikoen for hjerneblødning, samtidig med at det fører til neurovaskulær skade og producerer overskydende reaktive oxygenarter (ROS), som beskadiger blod-hjerne-barrieren (Alluri et al., 2015). Adskillige undersøgelser har bekræftet, at forstyrrelsen af ​​BBB er en væsentlig årsag til patogenesen af ​​iskæmisk slagtilfælde (Cao et al., 2016b).

BBB består hovedsageligt af endotelceller, pericytter, astrocytter, neuroner og basalmembraner. Kernekomponenterne i BBB er cerebrale mikrovaskulære endotelceller, der er forbundet med tætte forbindelser, og dermed begrænser eksogene molekyler ind i hjernen. De patologiske ændringer af tight junctions – især occludin, claudin-5 og zonula occludens-1 (ZO-1) – påvirker BBB-funktionen signifikant under et iskæmisk slagtilfælde, især barrierepermeabilitet (Liu et al. al., 2014; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). I I/R-perioder er overdreven ROS en af ​​hovedfaktorerne, der fører til direkte skade på hjerneneuroner (Ding et al., 2014). ROS-overproduktion fører til nedbrydning af visse junctions og BBB-forstyrrelser, hvilket resulterer i, at eksogene molekyler trænger ind i hjernen gennem BBB, hvilket fører til forværring af hjerneskade (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Derfor er beskyttelse af BBB med antioxidanter blevet betragtet som en potentiel måde at forhindre reperfusionsskade.

Udover nedbrydningen af ​​BBB kan I/R resultere i neurovaskulær skade og neuronal død (Jung et al., 2010). Under et slagtilfælde kan øget neuronal celledød skyldes oxidativt stress (Chi et al., 2018), og talrige undersøgelser har vist, at ROS forværrer slagtilfælde og neurologiske skader (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Selvom kliniske forsøg ikke har fået tilfredsstillende resultater, er neurobeskyttelse stadig en lovende strategi til behandling af akut iskæmisk slagtilfælde (Moretti et al., 2015). Derfor er det en fordel for patienter med slagtilfælde at finde effektive neurobeskyttelsesmidler til behandling af slagtilfælde.

Traditionel kinesisk medicin (TCM) tager foranstaltninger til at gribe ind mod kroppens indre ubalance (Gaire, 2018). På grund af den komplekse patogenese af iskæmiske slagtilfælde spiller den multifaktorielle virkning af TCM og dets aktive bestanddele en kritisk rolle i behandlingen af ​​slagtilfælde. Cistanche deserticola YC Ma, udbredt i tørre eller halvtørre områder i hele Mongoliet og det nordvestlige Kina, har været en meget brugt TCM-urt til behandling af forskellige sygdomme såsom glemsomhed og depression i mere end 1,000 år i Kina . Modernefarmakologiske undersøgelser viste, at råekstrakterne fraC. deserticolaviste flere farmakologiske aktiviteter, såsom forbedring af indlærings- og hukommelsesfunktion, neurobeskyttelse, forbedring af immunitet, antioxidant-, anti-aldrings- og antitræthedseffekter (Ko og Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Kemisk analyse af C. deserticola viste, at dens hovedbestanddele omfatter phenylethanoidglycosider, iridoidglycosider, polysaccharider og oligosaccharider (Jiang og Tu, 2009). De aktive komponenter af C. deserticola til hjernebeskyttelse er dog ikke særlig klare.Den neurobeskyttende egenskab af C. deserticola indebærer dets terapeutiske potentiale i kognitivt relaterede sygdomme som slagtilfælde og depression, samt Alzheimers sygdom (Wang et al., 2017). Dog forskning om virkningen afC. deserticolapå slagtilfælde, herunder dets aktive komponenter og virkningsmekanismer, er meget begrænset. I det aktuelle arbejde undersøgte vi den beskyttende effekt af tre ekstrakter fra C. deserticola, totale glycosider (TG'er, phenylethanoid glycosider og andre glycosider), polysaccharider (PS'er) og oligosaccharider (OS'er) på cerebrale I/R-skader. Vores resultater kan bidrage til den nøjagtige kliniske anvendelse afC. deserticolaog tilvejebringe et kandidatmiddel til iskæmisk slagtilfældeterapi.

MATERIALER OG METODER

Kemikalier og reagenser

Stænglerne af Cistanche deserticola blev købt fra Alashan, Indre Mongoliet, og identificeret af en af ​​forfatterne (P.-F. Tu). TG'er, PS'er og OS'er blev fremstillet i henhold til vores tidligere rapporterede metode (Gao et al., 2015). Kvantitativ analyse af TG'er blev udført ved højtydende væskekromatografi (HPLC) som tidligere beskrevet (Li et al, 2019), og dets kromatogram er vist i figur 1. Hovedkomponenterne i TG'er er echinacosid, tubulosid A, acteosid, iso- acteosid og 2'-acetylacteosid; deres indhold er henholdsvis 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g og 12,045 mg/g. Indholdet af PS'er og OS'er er henholdsvis 69,42 procent og 65,24 procent, som bestemt ved henholdsvis HPLC og phenol-svovlsyreanalysen (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

Standardreferencerne for echinacosid (A0282), tubulosid A (A0942), acteosid (A0280), iso-acteosid (A0281) og 2'-acetylacteosid (A0943) blev købt fra Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Kina). Renheden af ​​alle standarder er mere end 98 procent. Nissl-farve H&E-sæt blev købt fra Boster (Wuhan, Kina). Edaravone (T0407-1) blev købt fra Target Mol (Shanghai, Kina). Kanin anti-rotte MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) og mus anti-rotte CD31 (ab24590) blev købt fra Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Kanin-anti-rotte Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) og Occludin (BS72035) blev købt fra Bioworld Technology (Nanjing, Kina). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) var kilden til kanin-anti-rotte Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) blev købt fra Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Sekundære antistoffer blev leveret af Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, Kina). Hoechst 33258 blev opnået fra Beyotime (Jiangsu, Kina).

Dyr

Sprague-Dawley-rotter (han, der vejer 250-300 g) blev opnået fra Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Kina) og anbragt i et airconditioneret rum holdt i en 12 timers lys/mørke-cyklus. Alle dyreforsøg blev udført af dyreforskningen ARRIVE guidelines (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Peking University Health Science Center (LA2019123).

Dyreforsøgsprotokoller

Rotterne blev udsat for MCAO/R, som tidligere beskrevet (Wang et al., 2018). Kort fortalt blev den venstre fælles halspulsåre (CCA), den ydre halspulsåren (ECA) og den indre halspulsåren (ICA) blotlagt, og en 3-0 nylon monofilamentsutur blev indsat fra ECA'en ind i ICA, indtil den nåede midten cerebral arterie (MCA). Efter 1,5 timers MCA-okklusion blev reperfusion simuleret ved at fjerne filamentet. Under den kirurgiske procedure blev kropstemperaturen for alle rotter holdt på 37,0 grader.

Lægemiddeladministration

Rotterne blev tilfældigt adskilt i seks grupper ved hjælp af SPSS-softwareversion 22.0 som beskrevet (Jiang et al., 2014): normal gruppe (NOR); modelgruppe (MOD); edaravongruppe (positivt lægemiddel, 6 ml/kg, EDI); TG'er-gruppe (280 mg/kg, TG'er); PSs-gruppe (280 mg/kg, PSs) og OSs-gruppen (280 mg/kg, OSs). TG'er, PS'er og OS'er blev administreret en gang om dagen efter MCAO/R i 14 dage. NOR- og MOD-grupperne blev behandlet med normalt saltvand. Dyrenes antal er vist i tabel 1.

Måling af vægt og modificeret neurologisk deficit-score (mNSS)

Kropsvægten blev overvåget på den 14. dag ved hjælp af en ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, USA). mNSS blev vurderet efter metoden beskrevet af FJ Wang (Wang et al., 2018), med mindre revisioner.

2, 3, 5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) farvning

Infarktvolumen blev målt som beskrevet tidligere (Wang et al., 2015). Kort sagt blev hjernerne opdelt i syv koronale blokke (2 mm). Disse sektioner blev farvet med 2 procent TTC (Coolaber, Beijing, Kina) ved 37 grader i 15 min. Infarktvolumen ( procent )=(ipsilateral iskæmisk hemisfærevolumen -kontralateral iskæmisk hemisfærevolumen)/kontralateral iskæmisk hemisfærevolumen × 100.

Nissl og H&E Farvning

Rotterne blev dybt bedøvet, og hele hjernen blev derefter hurtigt fjernet fra kraniet og fikseret under anvendelse af 4 procent paraformaldehyd og indlejret i paraffinvoks og skåret i skiver med en tykkelse på 7 µm. Sektionerne blev farvet med Nissl og H&E. I denne undersøgelse blev seks tilfældige 200 × 200 µm felter fanget i hver vævsprøve med et lysmikroskop. Antallet af Nissls lig blev talt med IPP-softwareversion 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Evans Blue Assay

Rotter blev injiceret med 2 procent EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) efter MCAO/R. To timer senere blev rotterne bedøvet, og hele hjernen blev derefter hurtigt fjernet og homogeniseret i acetone. Supernatanterne blev analyseret ved 620 nm af en 800 TS absorbanslæser (BioTek, USA).

Måling af aktiviteterne af katalase (CAT), superoxiddismutase (SOD), malondialdehyd (MDA) og glutathionperoxidase (GSH-Px)

Alle serumprøver blev centrifugeret ved 4,000 x rpm i 15 minutter ved 4 grader og derefter analyseret for at detektere aktiviteterne af MDA, CAT, SOD og GSH-Px efter producentens instruktioner (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Kina).

Western blotting-analyse

Hjernevæv (100 mg) opsamlet fra hver rotte blev homogeniseret og lyseret i RIPA-lysebuffer og derefter analyseret for at påvise proteinkoncentrationen under anvendelse af et BCA-kit (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Totalt vævsproteiner blev fyldt på 10% SDS-PAGE-geler og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret ved hjælp af 5 procent skummetmælk, derefter inkuberet natten over med primære antistoffer ved 4 grader. Membranen blev derefter inkuberet med et sekundært antistof. Western blot-analyse blev analyseret under anvendelse af Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Kina).

Immunfluorescensanalyse

Immunfluorescensfarvning for CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 og Keap-1 blev udført. Primære antistoffer mod Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 og Keap-1 blev fortyndet til 1:200 og 1:100, henholdsvis. Det sekundære antistof af Alexa Flur 488 mus anti-kanin IgG og rhodamin (TRITC) gede anti-kanin IgG blev begge fortyndet til 1:200. Kernerne blev farvet af Hoechst 33258. Billeder blev optaget ved hjælp af Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Proteinekspressionen blev analyseret ved hjælp af IPP-softwareversion 6.0.

Statistisk analyse

Alle data blev beskrevet som middel ± SD. SPSS-softwareversion 22.0 blev udført til statistisk analyse. Envejs ANOVA blev brugt ved sammenligning af forskellige grupper. P < 0.05="" blev="" anset="" for="" at="" være="" den="" statistiske="">

RESULTATER

TG'er øger kropsvægten og reducerer hjerneskader hos MCAO/R-rotter

Efter 14 dages helbredelse med TG'er, PS'er, Oss og EDI blev kropsvægten, neurologiske underskud og infarktvolumener af I/R-rotter evalueret. Resultaterne viste, at kropsvægtene i MOD-gruppen var stærkt reduceret, mens de reducerede vægte i TG'er, PS'er og EDI-grupper blev øget (figur 2A). Neurologiske underskudsscore blev væsentligt sænket af EDI og TG'er (figur 2B). Hjerneskiverne i NOR-gruppens rotter var dybrøde, og der var ingen infarkter, mens rotterne i MOD-gruppen viste et stort ipsilateralt hjerneinfarkt. Efter TGs-behandling var infarktvolumenerne signifikant reduceret (figur 2C, D). Behandlingen med PS'er og OS'er viste ingen tydelig effekt på ovenstående indekser. Ovenstående data viste, at TG'er markant kunne lindre den I/R-inducerede cerebrale skade, men PS'er og OS'er kunne ikke.

TG'er forbedrer histopatologiske skader hos MCAO/R-rotter

For at bestemme nogle af virkningerne af TG'er, PS'er og OS'er-behandlinger på histopatologiske skader blev H&E-farvning udført for at afsløre patologisk skade. De histomorfologiske strukturer af hjerner i NOR-gruppen blev arrangeret regelmæssigt. Morfologiændringerne i TGs-grupperne var mindre end dem i MOD-gruppen. PS'er og OS'er-behandlingsgrupperne viste imidlertid ingen signifikant forbedring af morfologiændringerne (figur 3).

TG'er dæmper neuronal skade efter I/R-inducerede rotter

Nissl-farvning viste de histopatologiske ændringer af neuroner i penumbraen i det iskæmiske område. Som vist i figur 4 havde de normale neuroner en klar nukleolus og intakt struktur. I MOD-gruppen havde neuronerne forstørrede intercellulære rum. De nissl-kroppe var forsvundet, krympede og dybt farvede. Disse ændringer blev dog sjældent observeret i EDI-, TGs- og PSs-grupperne. Disse resultater illustrerede, at TG'er og PS'er signifikant kunne svække iskæmi/reperfusionsinduceret neuronal skade.

TG'er dæmper BBB-afbrydelse efter I/R-behandlede rotter

Evans blue assay er en klassisk metode til at undersøge ændringen af ​​BBB permeabilitet. Forsøgsresultaterne viste, at øget Evans-blåt blev observeret i MOD-gruppen, mens der var et signifikant fald i Evans-blåt i TG'erne og EDI-behandlede rotter. Desuden var der ingen signifikant forskel mellem PS'er og OS'er terapigrupper (figur 5). Disse resultater antydede, at TG'er signifikant kunne dæmpe BBB-forstyrrelser.

TG'er fremmer angiogenese hos I/R-skadede rotter

Nyere undersøgelser viser, at angiogenese spiller en kritisk rolle i neurologisk funktionel genopretning og prognostisk udfald efter akut iskæmisk slagtilfælde (Yuen et al., 2015). For at evaluere virkningerne af TG'er, PS'er og OS'er på angiogenese blev CD31 og a-SMA brugt til at kvantificere kapillærtallene. Immunfluorescensfarvning viste, at MOD-gruppen forårsagede et bemærkelsesværdigt fald i udtryk for CD31 (figur 6A, B) og a-SMA (figur 6C, D) i penumbraen af ​​iskæmiske områder af I/R-rotter sammenlignet med de normale rotter . Dette resultat illustrerede, at I/R kunne forårsage vaskulær skade i cortex penumbra i iskæmiske hemisfærer. Imidlertid øgede TG'erne og EDI-behandlingen bemærkelsesværdigt kapillærtæthed, angiogenese og arteriogenese som indikeret ved øget udtryk af CD31 og a-SMA. Disse resultater tyder på, at TG'er kunne fremme angiogenese i den iskæmiske penumbra hos I/R-rotter, men PS'erne og OS'erne kunne ikke.

TG'er øger ekspressionen af ​​Tight Junction-proteiner i I/R-skadede rotter

BBB-forstyrrelser kan øge hjernens vandindhold og hævelse af væv, hvilket fører til hjerneskade. Tight junction-proteiner er vigtige strukturelle komponenter i BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). For at teste, om TG'er, PS'er og OS'er behandling efter slagtilfælde kan påvirke BBB-integritet, blev udtryk for ZO-1, claudin-5 og occludin udført ved immunfluorescensanalyse. Resultaterne indikerede, at udtrykkene af claudin-5, occludin og ZO-1 var synligt reduceret i MOD-gruppen. Imidlertid blev de væsentligt forøget efter 14 dages TGs-administration. PS'er og OS'er-grupper viste ingen signifikante ændringer i disse proteinekspressioner (figur 7). Disse data indikerede, at TG'erne kan regulere tight junction-proteinekspressioner og sandsynligvis opretholde BBB-integritet efter I/R-skade. TG'er øger Pericyte-dækning på kapillærer hos I/R-skadede rotter Pericyte-dækning på kapillærer spiller en afgørende rolle i at opretholde BBB-integritet (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Således testede vi, om pericytdækning kunne øges ved TG'er, PS'er og OS'er behandling. Immunfluorescensintensitetsanalyseresultater viste, at både PDGFRb- og CD31-ekspressioner var dramatisk reduceret i MOD-gruppen. Administration af TG'er til I/R-rotterne genvandt eller øgede endda ekspressionsintensiteterne af PDGFRb og CD31 signifikant, men ingen forskel blev observeret i PS'er og OS'er-behandlingsgrupperne (figur 8). Behandling af TG'er kunne således øge pericytdækningen betydeligt. Disse resultater bekræftede yderligere, at TG'er kan opretholde integriteten af ​​BBB efter I/R.

TG'er fremmer neural ombygning hos I/R-skadede rotter

Ifølge talrige undersøgelser kan neurogenese efter et slagtilfælde væsentligt forbedre funktionel restitution (Grefkes og Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), postsynaptisk densitet 95 (PSD-95)-proteiner og mikrotubuli-associeret protein 2 (MAP-2) blev brugt som markører til at undersøge neuronal plasticitet i den iskæmiske penumbra i cortex. For at vurdere virkningerne af TG'er, PS'er og OS'er-behandlinger på neurogenese i I/R-skadede rotter blev immunfluorescensen og western blottet for SYN-, PSD95- og MAP-2-ekspressioner udført. Som vist i figur 9 og 10 faldt SYN-, PSD95- og MAP-2-ekspressionsniveauerne i I/R-rotter efter 14 dages reperfusion sammenlignet med NOR-rotterne, mens TG'erne og PS'erne kunne kurere betydeligt. regulere deres udtryksniveauer. OSs-gruppen havde ingen signifikant ændring sammenlignet med MOD-gruppen. Dataene indikerede, at TG'erne og PS'erne var i stand til dramatisk at fremme neural ombygning efter I/R-skade.

TG'er Alter Nrf-2 og bevarer-1 udtryk i I/R-skadede rotter

Oxidativ stress er en hovedpatogen mekanisme ved I/R-skade (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Undersøgelserne bekræftede, at Nrf-2 er en masterregulator af antioxidative responser (Thompson et al., 2015). For at undersøge Nrf-2- og Keap-1-medierede oxidative reaktioner efter I/R-skade, evaluerede vi den cytoplasmatiske ekspression samt nuklear translokation af Keap-1. I mellemtiden blev ekspressionen af ​​Nrf-2 i I/R-skadede rotters hjernevæv også analyseret (figur 10 og 11). Ifølge immunfluorescensanalysen blev Nrf-2 hovedsageligt lokaliseret ved cytoplasmaet i NOR-gruppen. I TGs-gruppen var ekspressionen af ​​Nrf-2 i cytoplasmatisk lokalisering nedreguleret, men opreguleret i kernen, og der blev også observeret en nedsat Keap-1-ekspression. Dataene viste, at hjernebeskyttelsen af ​​TG'er kunne være forbundet med moduleringen af ​​Nrf-2 og Keap-1

TG'er dæmper hjernevævsoxidativ stress hos I/R-skadede rotter

For at bekræfte de antioxidative virkninger af TG'er blev aktiviteterne af SOD, CAT, GSH-Px og MDA evalueret i I/R-skadede rotter. I figur 12 var indholdet af MDA markant øget i MOD-gruppen, og samtidig var aktiviteterne af SOD, CAT og GSH-Px faldet sammenlignet med de normale rotter. Omvendt førte TGs-behandling til et signifikant fald i indholdet af MDA og en stigning i aktiviteterne af SOD, CAT og GSH-Px. Disse resultater bekræftede yderligere antioxidationsaktiviteten af ​​TG'er.

DISKUSSION

Mange undersøgelser tyder på, at TCMC. deserticolahar omfattende biologiske aktiviteter, fx styrkelse af evnen til at lære, hukommelse og immunitet (Dong et al., 2007; Jiang og Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). Imidlertid forbliver de aktive komponenter af C. deserticola til neurobeskyttelse uklare. Det aktuelle arbejde sigter mod at screene de aktive komponenter fraC. deserticolamod iskæmisk slagtilfælde på MCAO/R-modellen. Tre ekstrakter fra C. deserticola (TG'er, PS'er og OS'er) blev brugt til at evaluere deres virkninger på MCAO/R-rotter samt mulige mekanismer.

Slagtilfælde er en almindelig akut cerebrovaskulær sygdom. Epidemiologiske undersøgelser viser, at slagtilfælde er mere almindeligt hos mænd end hos kvinder (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik og Bushnell, 2017). I vores eksperiment blev hanrotter således adopteret til testene. Vores resultater viste, at I/R-induktion accelererede oxidativt stress og infarktvolumen, bryder BBB og førte til nerve- og cerebrovaskulær skade. Efter screening blev TG'er fundet at reducere infarktvolumen og fremme neural remodellering og angiogenese. Desuden blev TG'er observeret at opretholde BBB-integritet efter I/R-skade. Tværtimod medfører PS'er og OS'er ingen væsentlig lindring af I/R-skade. Således betragtes TG'er som den største aktive fraktion afC. deserticolatil neurobeskyttelse, potentielt gennem at fremme neural ombygning, angiogenese og BBB-integritet via aktiverende Nrf- 2/Keap-1-vej.

Flere beviser tyder på, at etableringen af ​​effektiv kollateral cirkulation er væsentligt vigtig for at undgå dannelsen af ​​infarkt og iskæmisk penumbra, og er en kritisk behandling på et tidligt stadium af iskæmisk slagtilfælde (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Proliferationen af ​​vaskulære endotelceller og glatte muskelceller efter iskæmisk infarkt bestemmer etableringen af ​​kollateral cirkulation. Imidlertid har iskæmimodellerne et fælles fænomen - det vil sige, at oxidativt stress eksisterede bredt i hjernens mikrovaskulatur. Undersøgelsesdata har vist, at et stort antal antioxidanter kan forstyrre funktionen af ​​BBB og egenskaberne ved angiogenese (Mentor og Fisher, 2017). CD31 og a-SMA er markørerne for henholdsvis vaskulære endotelceller og glatte muskelceller (Saboor et al., 2016). At undersøge effekten på ovennævnte celleproliferation af ekstrakterne fraC. deserticola, undersøgte vi udtryk for CD31 og a-SMA i det cerebrale iskæmiske penumbra-homogenat. Vores data viste, at TG'er påfaldende forbedrede udtryk for CD31 og a-SMA. Der var dog ingen signifikante forskelle for PS'er og OS'er grupper. Derfor udledte vi, at TG'er kan reducere hjerneskade ved at fremme angiogenese ved at øge udtryk for CD31 og a-SMA, hvorimod PS'er og OS'er ikke gav en sådan beskyttelse mod hjerneskade. Disse resultater bekræftede yderligere, at kun TG'er kunne forhindre cerebral I/R-skade.

Iskæmisk slagtilfælde kan opfattes som et resultat af cerebral iskæmi forårsaget af svækkelse af den neuronale plasticitet eller ombygning af hjerneområder. Størstedelen af ​​apopleksipatienter lider af neurologiske mangler. Aktivering af neurogenese er en lovende strategi for patienter med slagtilfælde for at forbedre deres neurologiske funktioner (Cramer og Chopp, 2000). Neurogenese deltager direkte i genopretning af neurologisk funktion efter hjerne-I/R-skade (Zhang et al., 2019). Tidligere forskning viser, at TG'er kan forbedre overlevelsesraten for hippocampale pyramideceller og inducere neurogenese (Lian et al., 2017). Oxidativ stress forårsager tab af neuroner under mange sygdomme, såsom Parkinsons, slagtilfælde og så videre (Duan og Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transkriberer masser af gener relateret til neurobeskyttelse i deres promotorregion, hovedsageligt inklusive SOD, MDA, CAT og g glutamylcysteinligaser osv. (Satoh et al., 2006). SYN-, PSD-95- og MAP-2-proteiner, som er tæt forbundet med synaptisk dannelse og neurotransmission, kan betragtes som markører for forskning i neuronal plasticitet i den iskæmiske penumbra-region. Efter at have studeret fandt vi ud af, at kuren med TG'er signifikant kunne øge udtryk for PSD95, SYN og MAP-2, hvilket indikerer, at den cerebrale beskyttelse af TG'er var korreleret med den forbedrede neuronale plasticitet under I/R. Det er dog en skam, at der ikke er nogen åbenlys forskel for PS'er såvel som OS'er grupper. Disse resultater indikerede, at TG'er kunne forbedre neuroplasticitet efter cerebral I/R-skade.Billedforskning af apopleksipatienter viste, at BBB-dysfunktion kan opfattes som en slående egenskab ved den peri-iskæmiske hjerne (Bang et al., 2007). TJ'erne, som er sammensat af cytoplasmatiske proteiner, transmembrane proteiner og forbindelsesadhæsionsmolekyler mellem kapillære endotelceller, er meget vigtige for at opretholde BBB-integritet (Ye et al., 2019). Blandt dem er ZO-1, claudin-5 og occludin de vigtigste proteiner i TJ'er. Flere beviser indikerer, at den øgede permeabilitet af BBB induceret af iskæmi generelt korrelerer med ændringerne af ZO-1, claudin-5 og occludin (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018). I dette arbejde viste resultaterne, at selvom TG'er signifikant kunne øge udtryk for ZO-1, claudin-5 og occludinproteiner i MCAO-induceret hjernevæv, gjorde hverken PS'er eller OS'er det. BBB består af cerebrale endotelceller og er tæt forbundet med pericytter (Nyul-Toth et al., 2016). Pericytter er afgørende for BBB-integritet (Bell et al., 2010). Iskæmisk slagtilfælde udløser pericytes død og løsrivelse fra hjerneens endotelceller i den akutte fase, hvilket destabiliserer mikrovaskulaturen og ændrer BBB-egenskaber (Zechariah et al., 2013). Vores data viste, at TG'er kunne øge pericytdækningen på kapillærer og øge ekspressionsniveauerne af ZO-1, claudin-5 og occludin. Disse fænomener beviste, at TG'er effektivt kunne beskytte BBB-integritet efter cerebral I/R-skade. Sammenfattende kan TG'er dæmpe cerebral skade på flere måder, såsom at fremme angiogenese, forbedre neuronal plasticitet og opretholde integriteten af ​​BBB.

Vi undersøgte derefter signalvejen for at udforske mekanismen, der ligger til grund for TGs hjernebeskyttelse. Processen med I/R-skade er multifaktoriel, og derfor er adskillige mekanismer involveret i patogenesen. Oxidativ stress er en grundlæggende risikofaktor, der bidrager til I/R-inducerede hjerneskader (Suda et al., 2013), såsom BBB-strukturskade, vaskulær endothelial dysfunktion og forværring af iskæmisk neuronal skade (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2019; Priestley et al., 2019). Således er oxidativ stress blevet et attraktivt terapeutisk mål ved I/R-induceret hjerneskade. Fase 2-enzymer, som medieres af nuklear faktor E2-relateret faktor-2 (Nrf-2), er blevet betragtet som et vigtigt middel, hvorved neuroner beskytter sig selv mod oxidativt stress (Suzuki og Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Flere beviser indikerer, at aktivering af Nrf-2 under I/R er et potentielt terapeutisk mål for neurobeskyttelse (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, som en vigtig regulator af endogene antioxidantforsvar, medierer niveauet af hæmoxygenase 1 (HO-1) og andre antioxidantenzymer, såsom NAD(P)H quinonoxidoreduktase 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH og MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Desuden spiller Nrf-2 en vigtig regulatorrolle i angiogenese. Nærværende undersøgelse viser, at Nrf-2 kan forbedres og aktiveres væsentligt i processen med vaskulær udvikling (Wei et al., 2013).

Som tidligere beskrevet (Jiang og Tu, 2009) indeholder TG'er masser af bioaktive forbindelser, for eksempel echinacosid, tubulosid A, acteosid, iso-acteosid og 2'-acetylacteosid, og nogle af dem viste neurobeskyttende funktioner efter cerebral I/R skade (Peng et al., 2016). Echinacoside har masser af farmakologiske virkninger, såsom antioxidation, anti-ældning, neurobeskyttelse, anti-inflammation, fremme af cicatrization, hepatoprotection, fremme af knogledannelse og anti-tumor aktiviteter (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). For nylig er echinacosid blevet identificeret som en potent antioxidant i centralnervesystemet (Lu et al., 2016). Echinacosid kan reducere MDA-indhold og forbedre aktiviteterne af SOD og GSH Px ved iskæmi-hjerneskade, og molekylær docking-analyse viste, at echinacosid kan binde til Keap-1, hvilket fører til Nrf-2 nuklear translokation (Li) et al., 2018). Undersøgelsen af ​​Xia viste, at acteosid kunne reducere infarktvolumenet og hjernens vandindhold for at forbedre neurologiske underskud hos MCAO/R-rotter ved at afbøde oxidativt stress (Xia et al., 2018). Andre undersøgelser har vist, at iso-acteosid kunne øge aktiviteterne af cellulære antioxidantenzymer, SOD og CAT i H2O2-behandlede V79-4-celler (Chae et al., 2005). Baseret på ovenstående rapporter om de aktive forbindelser indeholdt i TG'er er det muligt at udlede, at TG'er kunne beskytte mod iskæmisk slagtilfælde via antioxidationsvejene.

Li rapporterede om de neurobeskyttende virkninger af phenylethanoidglycosider (PhG'er) på H2O2-induceret apoptose på PC12-celler via Nrf2/ARE-vejen (Li et al., 2018). Disse PhG'er blev signifikant undertrykt ved at udløse Nrf2 nuklear translokation og øge udtryk for HO-1, NQO1, glutamat-cystein-ligase-katalytisk underenhed (GCLC) og glutamat-cystein-ligase-modificerende underenhed (GCLM) (Li et al., 2018) ; Gong et al., 2019). Derfor tyder disse resultater på, at Nrf-2/ARE-vejen spiller en afgørende rolle i PhGs-medierede beskyttende virkninger på neuronale celler. Tilsvarende fandt vi i denne undersøgelse, at TG'er kunne reducere niveauet af MDA og øge niveauerne af SOD, CAT og GSH-Px i I/R-rotterne. I mellemtiden kunne TG'er opregulere Nrf2-ekspressionen i kernen, nedregulere det tilsvarende udtryk i cytoplasmaet og signifikant reducere Keap-1-ekspressionen. Derfor kan Nrf-2/Keap-1-vejen være involveret i TGs-medierede neurobeskyttende effekter. Yderligere validering af denne vej vil blive udført in vitro cellekultur med oxygen-glucose deprivation/reoxygenation skade modeller i fremtiden. I øvrigt,C. deserticolaekstrakter blev administreret i vores undersøgelse i 14 dage kontinuerligt. Da neurogenese hos voksne ville påvirke fortolkningen af ​​neurobeskyttende virkninger i løbet af 14 dages reperfusion, kan neurogenese ikke udelukkes i vores nuværende eksperimentdesign ved at udforske den neurobeskyttende effekt af CT'er. Dette er begrænsningen af ​​vores forskning.

Afslutningsvis er det TG'erne fraC. deserticolader kan forbedre angiogenese og neurogenese samt opretholde integriteten af ​​BBB i I/R-skade rotter, men ikke PS'erne og OS'erne. Effekterne kunne medieres af aktiveringen af ​​Nrf-2/Keap-1-stien.