Tolerance over for NADH/NAD plus ubalance foregriber aldring og anti-aldringsinterventioner

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

RESUMÉ

Redox-par koordinerer cellulær funktion, men konsekvenserne af deres ubalancer er uklare. Dette er noget forbundet med begrænsningerne af deres eksperimentelle kvantificering. Her omgår vi disse vanskeligheder ved at præsentere en tilgang, der karakteriserer fitness-baserede toleranceprofiler til redox par ubalancer ved hjælp af en in silikone præsentation af metabolisme. Med fokus på NADH/NAD1 redox-parret i gær, demonstrerer vi, at reduktive uligevægte genererer metaboliske syndromer, der kan sammenlignes med dem, der observeres i cancerceller.cistanche ekstrakt fordeleGærmutanters tolerance over for redoxuligevægt kan også forklare 30 procent af variationen i deres eksperimentelt målte kronologiske levetid. Desuden, ved at forudsige betydningen af ​​nogle metabolitter for at hjælpe med at modstå ubalancer, identificerer vi korrekt de næringsstoffer, der ligger til grund for patologimekanismer, levetidsbeskyttende molekyler eller kaloriebegrænsende mimetika. Tolerance over for redox-ubalancer bliver på denne måde en lyd, der giver en ramme til at genkende egenskaber ved aldringsfænotypen, mens den er i overensstemmelse med et biologisk rationale for at vurdere anti-aldringsinterventioner.

INTRODUKTION

Forskning i redox-homeostase udvidede sig betydeligt i løbet af de sidste to årtier og omformede løbende klassiske forestillinger om oxidativ cellulær skade (Halliwell og Gutteridge, 2015). Blandt de mest paradigmatiske molekylære midler, der ligger til grund for denne homeostase, opstår forholdet mellem redoxpar, som for de konjugerede former for glutathion, NADPH og NADH. Både glutathion og NADPH fungerer som essentielle rensende mekanismer for reaktive oxygenarter (ROS) i mitokondrier, mens NADPH og NADH kobler henholdsvis anabolske og katabolske veje med cellens redoxtilstand.

Klik venligst her for at vide mere

Alligevel er nye mekanismer, der forbinder NADPH/NADP*- og NADH/NAD*-par til redox-homeostase, fortsat anerkendt. For eksempel forklarer balancen af ​​NADPH/NADP plus delvist de pro-overlevelsesmæssige konsekvenser af AMP-aktiveret proteinkinase (She et al., 2014). Det forbinder også døgntidsmåling med redoxtilstande (Rey et al., 2016). NADH/NAD plus-forholdet menes i øjeblikket at være involveret i koordineringen af ​​mitokondriel og nuklear funktion, den epigenetiske regulering af DNA-reparation og cellulær identitet og tuning af energimetabolisme til miljøvariabler (Canto et al., 2015; Gomes et al. al. 2013). I ikke-patologiske tilstande svinger NADH/NAD*-forholdet med iltspænding, hvor hypoxiske tilstande og højere ilttilgængelighed tilsvarende forekommer samtidig med reduktive og oxidative afvigelser (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Men den voksende interesse for redox-parforhold kommer hovedsageligt fra deres implikationer i patologi.cistanche genghis khanForekomsten af ​​ROS i både den reduktive (hypoksiske, tilbøjelige NADH) og den oxidative (hyperoxiske, NAD plus tilbøjelige) sanser er blevet relateret til afvigelser fra et optimalt redoxpotentiale, der sikrer den bedste ydeevne af mitokondrierne (Aon et al., 2010) Clanton, 2007). Hvad angår kræft, kan nedsat NADH/NAD plus ligge til grund for dødeligheden af ​​glioblastomer (Gujar et al., 2016) og fremme tyktarmskræftprogression (Hong et al., 2019), men det kan også redde nogle sunde fænotyper i forskellige grader i celler fra andre tumortyper (Garrido og Djouder, 2017).

Cistanche kan anti-aging

NADH er også blevet et interessepunkt i Torontos biologi. I denne sammenhæng resulterede forøgelsen af ​​NAD plus-puljen i den delvise vending af aldring og andre relaterede patologiske fænotyper på tværs af organismer (Das et al., 2018; Mendelsohn og Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), og senescerende og neoplastiske celler har vist sig at have ubalancer i NADH/NAD plus-forholdet (Braidy et al., 2011; Schwartz og Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Ydermere er NADPH's nyopdagede roller og det nye koncept for NADH/NADH som en masterregulator af redox-homeostase og senescens alle i tråd med den metaboliske stabilitetsteori om aldring (Demetrius, 2004). Denne teori foreslår, at årsagen til aldring er sårbarheden af ​​steady-state niveauer af redoxpar til tilfældige miljøforstyrrelser på enzymreaktionshastigheder, og giver flere interessante forudsigelser, der gælder for mennesker.

I betragtning af alle disse implikationer har mange undersøgelser undersøgt fænomenologien af ​​redox-parforhold enten ved passivt at rapportere deres niveauer eller ved aktivt at modificere dem. Eksperimentelle manipulationer er dog udfordrende. De mest traditionelle anklager dybe eksperimentelle forbehold (Sun et al., 2012) og nyere savner stadig visse biologiske omstændigheder, fordi de er begrænset til temperatur- og pH-intervaller (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Desuden er det eksperimentelt dyrt at overvåge den brede vifte af fænotyper efter ændring af coenzympuljer ved metabolittilskud (Hou et al., 2010) og mutationer eller overekspression af NAD(H)-forbrugende enzymer (Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). Der er således behov for alternative strategier til at håndtere kontrollen af ​​redox-homeostase gennem manipulation af redox-par, samt vores forståelse af de biologiske konsekvenser af denne kontrol.

In silico-modeller bliver en praktisk forskningsstrategi, når eksperimentelle tilgange er begrænsede, med den fordel at muliggøre en fuld mekanistisk redegørelse for de observerede fænomener. Genom-skala metaboliske modeller, som kan studeres gennem flux balance analyse (FBA) (Orth et al, 2010) er blevet en standard i systembiologi til at studere konsekvenserne af metaboliske forstyrrelser på cellulær funktion (metoder S1). Blandt andre bidrag har de hjulpet med opdagelsen af ​​nye antibiotika og kemoterapeutika, designet af bakteriestammer, der er optimeret til industriel produktion af stoffer af interesse, og en bedre forståelse af menneskelige metaboliske sygdomme (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al., 2009). Brugen af ​​FBA har den yderligere fordel, at den giver indsigt i metaboliske fænomener uden påvirkning af ikke-metaboliske forstyrrende faktorer (genetiske, epigenetiske, mekaniske osv.). Således er metaboliske modeller i genomskala særligt velegnede til at undersøge de metaboliske konsekvenser af afvigelser fra redox-homeostase.

Her bruger vi FBA til at undersøge balancen af ​​redox-par på en genom-skala rekonstruktion af den encellede eukaryot Saccharomyces cerevisiae, hvorved vi karakteriserer de metaboliske og levetidsrelaterede konsekvenser af en kontrolleret forstyrrelse af den tilgængelige NADH/NAD plus flux på tværs af forskellige genetiske baggrunde. Mere specifikt afslører vores resultater, at tolerance over for denne ubalance fører til en specifik metabolisk omdirigering, der minder om patologi, og forklarer også mere end en fjerdedel af den intra-specifikke variabilitet i post-mitotisk levetid. Derudover hjælper denne ramme os med at skitsere en beregningsprotokol (som vi også anvender på dyre- og menneskelige metaboliske modeller) til at identificere metabolitter og enzymer med potentiale som terapeutiske mål i forbindelse med aldersrelaterede patologier.

RESULTATER

En fitness-baseret toleranceprofil karakteriserer redox-parforstyrrelser

For at repræsentere en ubalance mellem de konjugerede former for et redoxpar inkorporerede vi en kunstig reversibel reaktion - "ubalancereaktionen" - i genomskala-rekonstruktionen af ​​det tilsvarende metaboliske netværk (STAR-metoder). Reaktionen oxiderer eller reducerer parret under hensyntagen til specifikke cellulære rum (f.eks. cytosol, mitokondrier osv.), og dens aktivitet kan fikseres til enhver ønsket hastighedsværdi. For enhver af disse værdier kan man beregne en vækstrate ("fitness"), som fungerer som en proxy for gærcellens tolerance over for den pågældende tilstand. Endelig defineres en toleranceprofil ved at beregne væksthastigheden for et område af ubalanceværdier (figur 1A; bemærk, at reduktive/oxidative forhold er repræsenteret i henholdsvis blåt/rødt i hele manuskriptet).

Toleranceprofiler udviser typisk en maksimal vækst omkring nul-ubalancepunktet, hvor stort set enhver afvigelse (dvs. reaktionens værdi, der ikke er nul), fører til nedsat kondition. Dette understreger det faktum, at for at metabolisme skal fungere, skal aktiviteten af ​​de reaktioner, der tuner et redox-parforhold i én forstand, være proportional med aktiviteten af ​​dem, der tuner det i den anden. Mere specifikt, cytosoliske ubalancer af NADH/NADt i S.cistanche levetid forlængelsecerevisiae, der vokser på glukose og aerobe forhold, giver en profil med en maksimal vækst, der er væsentligt forskudt mod den oxidative side på et punkt i ubalanceprofilen, hvor ~50 mmol/DW/time af NADH omdannes til NADH (Figur 1B). Når vi i stedet overvejede ubalancen i mitokondrierne, observerede vi et maksimum ved punktet af nul ubalance (figur 1C), et mønster, som vi på samme måde observerede i andre profiler (figur S1). Generelt bliver reduktive forhold

Figur 1. En toleranceprofil karakteriserer responsen på redox-ubalancer

(A) Øverst. Vi introducerede en kunstig reaktion i den metaboliske rekonstruktionsmodel af en organisme (i dette tilfælde gær) for at interkonvertere de to konjugerede former af et redox-coenzym (her NADH/NADH-parret). Under hver af en række ubalancebetingelser, dvs. hastighedsværdier for den kunstige reaktion, anvender vi fluxbalanceanalyse til at beregne væksthastigheden. Bund. De forudsagte værdier for vækst er plottet mod hastighedsværdierne for ubalance, som afgrænser toleranceprofilen; en proxy for metabolismens tolerance, når den står over for den valgte forstyrrelse.cistanche nz(B) Toleranceprofil i gær forbundet med ubalancer lokaliseret i cytosolen.

(C) Toleranceprofil i gær associeret med ubalancer i mitokondrierne. Blå/rød skygge repræsenterer henholdsvis reducerede og oxiderede ubalanceregimer, og grå prikker angiver værdier, der svarer til ingen ubalance eller ekstreme reduktive/oxidative ubalancer, der ikke producerer nogen vækst. skadelige og dødelige hurtigere end oxidative regimer. I to tilfælde (de konjugerede par af cytosolisk NADH eller mitokondrielt thioredoxin) forbedrer mild kunstig oxidation af parret væksten (figur S1).

NADH/NAD* forstyrrelser forårsager metaboliske syndromer, der minder om patologi

Gærs energimetabolisme uden ubalance svarer til en karakteristisk aerob metabolisme i nærvær af glukose (de undersøgte vækstbetingelser), hvor glykolyse er koblet med tricarboxylsyrecyklussen (TCA) og oxidativ fosforylering. Pentosephosphatvejen oxiderer glucose og giver ribose-5P til nukleotidsyntese og NADPH-født reduktiv kraft til anabolisme, mens anaplerotiske veje forlader TCA-cyklussen, svarende til glutaminmetabolismen, bruges moderat til primært at fodre pyrimidin og aminosyresyntese. FBA sætter os i stand til at kvantificere ændringer i disse veje, og hvordan de i sidste ende detaljerer de metaboliske egenskaber, der ligger til grund for et bestemt ubalanceregime.

Specifikt viser figur 2A, hvordan reduktive ubalancer af cytosolisk NADH/NADH producerede en stigning i glykolytisk flux, et fald i aktiviteten af ​​TCA-cyklussen og elektrontransportkæden og en stigning i glutaminmetabolismen. Denne pseudohypoxiske metaboliske signatur - i nærvær af oxygen - ligner anaerob metabolisme, hvor glykolyse er koblet med alkoholisk eller mælkesyrefermentering til skade for mitokondrielle veje; den oxygenholdige del af pentosephosphat-vejen er lukket ned, og glutaminmetabolismen, en mere aktiv, kan blive omdirigeret til at producere pyruvat ud over at bidrage til anabolisme. Især fanger denne fænotype nogle træk ved paradoksale udbyttemetabolismer observeret i forskellige typer kræftceller (Warburg-effekten) (Potter et al., 2016).

Figur 2. Fluxer af de vigtigste veje for energistyring, der ligger til grund for toleranceprofilen i gær (A) Cytosolic NADH/NAD-ubalance (øverst) og fluxværdier for fem repræsentative veje (nederst); i/glykolyse (Glykolyse, kerne), ii/Krebs cyklus (TCA, pink), ili/pentosephosphat (Penphos, grøn), iv/oxidativ fosforylering (Oxphos, grå) og glutaminmetabolisme (Glutamin, lilla). De repræsenterede fluxvektorer er resultatet af gennemsnittet af fluxen af ​​alle reaktioner af den bestemte vej.

(B) Samme som (A) med hensyn til mitokondriel ubalance. Bemærk tilstedeværelsen af ​​negative fluxer i glykolyse (panel A, nederst) repræsenterer øget glukoneogenese. Se hovedteksten for detaljer.

I modsætning hertil udviste energimetabolismen, der ligger til grund for oxidativ tolerance (med hensyn til cytosolen, figur 2A) en mere aerobisk-lignende konfiguration, men med særegenheder, såsom en særlig aktiv polyaminmetabolisme; og ekstreme egenskaber, herunder øget gluconeogenese, oxidativ phosphorylering og TCA-cyklusaktivitet, samt en meget høj (op til 12-fold det normale niveau) flux gennem pentosephosphatvejen. Sidstnævnte kan ikke desto mindre være en artefakt af forskelle i biomasse-pseudo-reaktionen under meget høj (tidligere 55 mmol/gDW/h) oxidativ ubalance (se metoder S1).

Når ubalancereaktionen er lokaliseret i mitokondrierne, producerede reduktionen af ​​NADH igen en vis pseudohypoxisk adfærd med en forskel (figur 2B). Fluxen gennem glykolyse og glutaminmetabolisme steg med et samtidig tab af delene af TCA-cyklussen og pentosephosphatvejen. Men i modsætning til i det cytosoliske tilfælde steg oxidativ phosphorylering betydeligt. På den anden side var den oxidative side af mitokondrieprofilen mere idiosynkratisk: den glykolytiske aktivitet steg parallelt med den i TCA-cyklussen, men oxidativ fosforylering virkede for det meste ved lavere niveauer end normalt, og glutaminmetabolismen var af ringe betydning,

Metaboliske syndromer er resultatet af et kompromis mellem redoxbalance, biomasseproduktion og en ATP/NADH-afvejning

Vi identificerede flere nøgleelementer i spil, der formede de tidligere syndromer.cistanche penis størrelseDen oxidative forstyrrelse blev mødt med en forværret aerob respons som et kompromis mellem opretholdelse af vækst og buffering af ubalanceforstyrrelsen. Dette indebar omdirigering af flux gennem det maksimalt mulige antal reaktioner, der reducerede NAD plus, samtidig med at en global fluxfordeling blev bevaret, der var i stand til at generere biomassebestanddele. Disse to mekanistiske elementer (perturbationsbuffring og biomassemaksimering) er de mest relevante krav til optimeringsproblemet og tilstrækkelige til at beskrive toleranceprofilens oxidative regime.

Figur 3. Konkurrerende mekanismer forårsager den pseudohypoxiske adfærd af gær

(A) Balance mellem NADH-, ATP- og biomasseprækursorproduktion favoriserer reaktionsmoduler, der producerer så meget ATP og så lidt NADH som muligt for at kompensere for konsekvenserne af reduktive regimer, f.eks. brugen af ​​glykolyse i forhold til TCA. Bemærk her, at lilla pile repræsenterer ATP-produktion, gule pile repræsenterer NAD(H)-produktion, og hvide cirkler angiver dannelsen af ​​biomasseprækursorer, (B) En NADH-tilbøjelig NADH/NADt-forstyrrelse (x-akse) er overlappet med en kunstig ADP phosphoryleringsreaktion (y-akse), der med kraft indfører reduktiv kraft i form af ATP i det ubalancerede stofskifte. En grøn farvegradient repræsenterer forholdet mellem glykolytisk og Krebs-cyklusflux normaliseret med dens normale værdi (op til 100-fold). Det kan forstås, at ADP-phosphorylering reducerer den pseudohypoxiske fænotype og forsinker hvile.

Den reduktive side krævede dog en ekstra indsigt. Efterhånden som mere og mere NADH sekvestreres til NADH-reaktioner, der bruger NADt og er direkte eller indirekte nødvendige for at producere biomassebestanddele, bliver mere og mere begrænset, så energimetabolisme skal omdirigeres for at muliggøre en forhøjet omdannelse af NADH til NAD' og for at begrænse reduktion af NAD' til NADH. Dette er stadig utilstrækkeligt til at imødegå forstyrrelsen, da den meste reduktionskraft i form af NADH i det væsentlige er ubrugelig til mange metaboliske mål, reaktioner og vækst: energien lagret i NADH skal omallokeres til ADP. Stofskiftet skal således prioritere reaktionsmoduler, der producerer så meget ATP og så lidt NADH som muligt; det skal stole på shunts og pathways, der har et højt ATP/NADH-udbytte, f.eks. glykolyse og oxidativ phosphorylering.

Disse resulterer blandt andet i reduceret TCA-cyklus og øget glykolytisk flux (Figur 3A). For yderligere at udforske virkningen af ​​denne ATP/NADH-afvejning overlappede vi en reduktiv NADH/NAD-forstyrrelse med en kunstig reaktion, der tillader fosforylering af ADP . Simuleringerne viste, at det forhøjede glykolyse- til TCA-cyklusfluxforhold, der karakteriserer reduktiv metabolisme, er afhængig af ATP/NADH-udbyttet

Figur 4. Tolerancescore som en prædiktor for kronologisk levetid i gær

(A) Toleranceprofiler opnået for gærmutanter; blå/røde sektorer af kurven repræsenterer det reduktive/oxidative regime af NADH/NADH-uligevægten.

(B) Sammenhæng mellem normaliseret tolerancescore (proportional med bredden af ​​ubalanceværdierne ved både oxidative og reduktive regimer, STAR-metoder) og kronologisk levetid. Korrelationen forklarer ~30 procent af den samlede varians (R'= 0. 29, p-værdi=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Som en alternativ måde at se denne sammenhæng på, opnåede vi et histogram af regressionshældningsværdier opnået fra ti tusinde tilfældigt genererede associationer mellem tolerancescore og levetid. Fra denne prøve finder vi kun 3 tilfælde, hvor sammenhængen mellem tolerancescore og levetidsdata er stærkere end den, der blev fundet (angivet med den røde lodrette linje).

(Figur 3B). Kraftig fosforylering af ADP reducerer denne pseudohypoxiske signatur selv i lyset af meget stærke NADH-tilbøjelige ubalancerater.

Tolerance forklarer eksperimentelle kronologiske levetidsforskelle mellem forskellige gærmutanter

Vi spurgte ved siden af, i hvilket omfang toleranceprofilen kunne fungere som en prædiktor for levetid, givet at redoxpar er blevet diskuteret som potentielle livstidsdeterminanter. En måde at studere dette på er at beregne pro-filen i forskellige mutanter (Figur 4A) og derefter kvantificere, hvordan den svarer til nøjagtige levetidsmål, normaliserede kronologiske levetider (CLS'er), tilgængelige fra eksperimentelt målte mutantoverlevelseskurver (Garay et al., 2014). CLS'er beregnes ud fra disse mutante overlevelseskurver som stigningen i stationær fase-overlevelse i forhold til vildtypen.

I FBA simuleres mutationer i specifikke gener ved at begrænse strømmen af ​​reaktionerne forbundet med dem gennem boolske regler, der relaterer hver kemisk reaktion til ORF'er, der oversættes til reaktionens enzym (STAR-metoder). For hver af disse mutanter beregnede vi en mutanttoleranceprofil (Figur 4A) og brugte summen af ​​de absolutte ubalanceværdier, ved hvilke væksthastigheden halveres (både i det reduktive og det oxidative regime) som en skalær score for tolerance (STAR) metoder).

Vores mutantsæt var dog begrænset af nogle restriktioner (STAR-metoder). Især var vi ude af stand til at skelne forskelle i tolerance under 10 ppm af vildtypens værdi uden at nå prohibitive beregningstider, og mange mutanter præsenterede både ubetydelige forskelle i levetid og ubetydelige forskelle i tolerance. Derudover anses det generelt for, at FBA ikke er i stand til at karakterisere gain-of-function deletioner, og ganske forudsigeligt oversteg ingen mutanttolerancer vildtypens.

Ud over disse begrænsninger var in silico-toleranceprofilerne i stand til at forklare -30 procent af den eksperimentelt målte levetidsvariabilitet (Figur 4B, R2= 0.29, N=41,p-værdi{{5 }}.2x 10-) med stor betydning:10,000 randomiseringer af dataparrene førte til kun 3 tilfælde med en større regressionshældning(Figur 4C).

Konventionelle næringsstoffer muliggør tolerance over for NADH/NADH-ubalancer

Til sidst undersøgte vi, om specifikke diætmetabolitter var særligt afgørende for responsen på redox-ubalance. Til dette formål brugte vi en ekstra funktion i FBA-modeller, som er muligheden for at få adgang til brugen af ​​en bestemt metabolit (defineret som forbrugshastigheden i steady-state, STAR-metoder). Vi undersøgte, hvordan denne hastighed ændrede sig med stigende værdier af reduktiv og oxidativ NADH/NAD plus ubalance.

Anvendelsen var ret lineær på begge sider af profilen og for de fleste metabolitter. Således tilpassede vi dette skiftende mønster til en lineær model og betragtede den (absolutte) hældning som en skalar, der repræsenterer den tilsvarende metabolits relevans for at tolerere redox-ubalance (figur 5A). Blandt de mest responsive næringsstoffer i iAZ900 bemærkede vi diætmetabolitter, der vides at spille en afgørende rolle i reguleringen af ​​gærlevetiden, såsom acetat (Burtner et al., 2009), såvel som mange, der øger levetiden eksperimentelt i gær, orme, eller endda humane celler (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016) inklusive malat, hydroxybutyrat, spermidin eller oxaloacetat (figur 5B-5D, tabel S1).

Visse næringsstoffer var mere relevante for tolerance over for NAD-reduktion, andre for NADHoxidation, og nogle få for begge disse regimer. De vigtigste diætmetabolitter for reduktiv tolerance var i rækkefølgen acetat, beta-hydroxybutyrat (BHB), glutamat og glutamin (figur 5B), i mellemtiden var den vigtigste til at tolerere NADH-oxidation acetat, NADP plus, putrescin og spermidin (Figur 5D). Blandt dem, der deltog fra tolerance på begge sider af profilen, var den mest relevante i rækkefølgen acetat, glutamat, oxaloacetat og oxoglutarat (figur 5C).

Vi overvejede metaboliske modeller i andre organismer for yderligere at bekræfte, hvilke næringsstoffer der er determinanter i responsen på ubalancer (metoder S1, se også figur S2 for, hvordan strømninger af hovedvejene ændres). Alle disse top-bidragydere ændrede sig, omend ikke meget, med alfa-ketosyrer, redoxpar, visse vitaminer og visse aminosyrer, der var væsentligt nødvendige for at kontrollere NADH/NADt-forstyrrelser i C.elegans og den menneskelige genopbygning. Den mest udbredte reaktion på redoxubalance i disse organismer vedrører metabolitter, der medierer pH-homeostase, såsom acetat, bicarbonat, biphosphat, natrium, vand og andre lignende. På samme måde adskiller relevansen af ​​glutamat, glutamin, aspartat, threonin, serin og glycin dem fra andre aminosyrer og de fleste metabolitter. Mellemstore, oxiderede syrer som oxoglutarat, malat og oxaloacetat spiller også konsekvent en rolle i tolerancen, som har tendens til at gøre biotin og nogle folater (se tabel S1 for en komplet liste).

DISKUSSION

Vi foreslår her en alternativ tilgang til at forstå de brede biologiske konsekvenser af ændringer i redox-par. Denne tilgang er baseret på in silico metaboliske modeller og introducerer forestillingen om toleranceprofilen som et mål, der kvantificerer den cellulære modstandsdygtighed over for disse ændringer.

Figur 5. Homøostatiske næringsstoffer i gær

(A) Eksempel på brugsprofil for et næringsstof med dets tilsvarende reduktive (blå) og oxidative (røde) lineære regression karakteriseret ved hældninger henholdsvis m og m. (i absolutte værdier). Vi inkluderede den cytosoliske toleranceprofil i baggrunden som reference.

(B) Lineære regressionshældninger (m,) af de øverste 4 homøostatiske næringsstoffer i den reduktive betydning af NADH/NAD plus forstyrrelse.

(C) Lineære regressionshældninger af top4-næringsstofferne, der er homøostatiske i begge betydninger af forstyrrelsen; Blå: Reduktiv lineær regressionshældning; Rød: Oxidativ lineær regressionshældning.

(D) Lineære regressionshældninger (m.) af de øverste 4 homøostatiske næringsstoffer i den oxidative betydning af NADH/NAD plus forstyrrelse.

De metaboliske justeringer, der ligger til grund for profilen, afslører tilstedeværelsen af ​​en pseudohypoxisk fænotype forbundet med de reduktive NADH-regimer. Denne fænotype minder om nogle tilsyneladende paradoksale energimetabolisme med lavt udbytte observeret i kræftformer (Warburg-effekten) og genkendes også i gær (Crabtree-effekt) og bakterielle (overløbsmetabolisme) celler (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter et al.,2016). Muligheden for, at denne adfærd kan være forårsaget af ressourceallokeringsbegrænsninger, der opstår ved forholdsvis høje vækst- eller glukoseoptagelseshastigheder, er blevet fremført i de seneste år (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Imidlertid er den pseudohypoxiske fænotype, vi observerer, uafhængig af væksthastighed og glukoseoptagelse, og faktisk forekommer den samtidig med lave vækstrater (STAR-metoder). Vi har vist, at dens årsag ligger i en grundlæggende ATP/NADH-afvejning, et rationale, der understøttes af en nylig eksperimentel undersøgelse (Maldo-nado og Lemasters, 2014).

Desuden tyder vores fluxanalyse på, at ATP-vedligeholdelse kan blive negativt påvirket af reduktiv NADH/NAD plus uligevægt. Øget NADH menes at være en korrelation af nedsat ATP tilgængelighed, da svækkelse af oxidativ fosforylering kan resultere i både en stigning i NADH/NAD plus og et fald i ATP/ADP. Vi viser, at ekstrinsisk genererede NADH-ubalancer kan være en årsag til nedsat energitilgængelighed gennem ortogonale metaboliske mekanismer, selv mens oxidativ fosforylering virker over normale niveauer. Dette er meget vigtigt i forbindelse med aldringsforskning, da nedsat energitilgængelighed og ATP/ADP-forhold er et bevaret kendetegn for cellulær aldring og aldersrelaterede patologier (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013 ) og kan fremme akkumuleringen af ​​giftigt affald og tabet af proteostase (et andet kendetegn ved aldring) ved at reducere proteinomsætningen og dermed øge proteinets halveringstid (Anisimova et al., 2018).

Vi sigter dernæst efter at bestemme gyldigheden af ​​vores ramme som en forudsigelse for levetid og af diætmetabolitter, der buffer redox-ubalancerne. Tolerance forudser cellulær levetid, med nogle begrænsninger på grund af det tilgængelige datasæt. Ved at kontrollere for disse begrænsninger (Garay et al., 2014), finder vi, at de resulterende korrelationer stadig er tilstrækkeligt bevis på en sammenhæng mellem variansen af ​​tolerance og CLS.

I modsætning til vores forventninger er den mest tydelige lektie fra vores analyse af diætmetabolitter, at hovedstoffet, der driver responsen på ubalancen, ikke er særligt afhængig af NADt-redningsnetværket. Faktisk er de øverste "homeostatiske næringsstoffer" mellemprodukter af TCA-cyklussen og andre dele af det centrale stofskifte, hvis virkning er langt mere gennemtrængende end NAD-prækursorers. Derudover er relevansen af ​​reaktioner, der reducerede eller oxiderede NAD(H), mens de fungerede som broer mellem redoxparret og de vigtigste metaboliske veje, langt overlegen i forhold til NADt-redningsbegrænsende enzymer (såsom nikotinamidmononukleotidadenyltransferase).

For eksempel scorer oxaloacetat og oxoglutarat i gærmodellen blandt de fire mest effektive metabolitter, der ligger til grund for tolerance under både reduktive og oxidative forhold, en konsekvent egenskab, der bekræfter tidligere eksperimentelle resultater (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009) . Andre væsentlige metabolitter omfatter hydroxybutyrat, som konsekvent har vist sig at øge levetiden, regulere NAD og mediere reaktionen på sult (Edwards et al., 2014; Newman og Verdin, 2014), og spermidin, som tilhører familien af ​​polyaminer og er kendt for at spiller roller i aldersrelaterede processer, autofagi og DNA-beskyttelse (Eisenberg et al, 2009; Minois et al.2011: Pietrocola et al.2015).

Vi brugte C.elegans og menneskelige modeller til at styrke den tidligere evaluering og afslørede et bredere billede, der er centreret omkring pH-homeostase, redox-par og TCA-cyklussen. Dette tyder på, at de måder, hvorpå pH (Burtner et al., 2009) og NADH-ubalance (Ayer et al., 2014) bestemmer alderdom i celler, er dybt sammenflettet. Ud over pH er de mest gennemgående og vigtige næringsstoffer til at regulere NADH/NAD plus ubalance alfa-ketosyrerne oxaloacetat og oxoglutarat, deres aminerede former og andre mitokondrie-relaterede metabolitter som malat, pyruvat og fumarat, dvs. redoxbalancekontrol er TCA-cyklussen.

Den dag i dag forbliver de mekanismer, hvorigennem aminosyrer og TCA-cyklus-mellemprodukter påvirker levetiden i gær og C. elegans, uklare. Metabolitter som malat, oxaloacetat, fumarat, valin, serin eller threonin kan faktisk øge organismers levetid, men de processer, der fører til disse effekter, er omdiskuterede og komplekse (Edwards et al., 2013, 2015). Vores resultater indikerer, at en fælles forklaring på alle disse pro-longevity fænomener ligger i virkningen af ​​næringsstofferne på cellernes kapacitet til at tolerere forstyrrelser i NADH/NAD plus-forholdet.

Man kan dog argumentere for, at nogle af de betragtede metabolitter forekommer selvindlysende, da de trods alt er involveret i reaktioner, der inter-konverterer NADH og NAD plus. Spørgsmålet er så, hvorfor andre metabolitter, der også ser a priori selvindlysende ud, ikke kommer frem i vores resultater. Svaret ligger i de mekanismer, der sikrer realistiske forudsigelser i FBA. For at et næringsstof skal være "homeostatisk" mod redoxubalance, skal det ikke kun øge NADH- eller NADt-produktionen, men stå centralt i en vej eller et modul med et højt ATP/NADH-udbytte og/eller kapacitet til at levere biomassebestanddele.

Til sidst er yderligere to indsigter fra vores resultater bemærkelsesværdige. På den ene side antyder de, at som reaktion på redox-ubalancer er metaboliske netværk klar til i stigende grad at producere og/eller forbruge nogle metabolitter, der af signalnetværk fortolkes som udelukker behovet for autofagi, antioxidant- og hormetiske reaktioner, såvel som mange, der overskrider eller tilskud har vist sig at øge levetiden og/eller på anden måde efterligne virkningerne af kaloriebegrænsning (CR), på en måde afhængig af de signalveje, der er impliceret i CR-medieret forlængelse af levetiden. Dette styrker tidligere beviser, der forbinder CR og NADH/NADH balance som en del af den samme levetidsforlængende og sundhedsfremmende proces (Lin et al., 2004).

På den anden side viser vores undersøgelse, at stofskiftet også som reaktion på de ændrede forhold gør brug af visse stoffer, der kan skade cellen kemisk, såsom acetat, putrescin eller acetaldehyd; samt nogle, der kan fremme tumorgenese gennem metaboliske omledninger, såsom glutamin, succinat og fumarat (Sciacovell et al., 2016). Dette kunne så til dels forklare de patologier, der er forbundet med redoxubalance og de makroskopiske processer, den er involveret i, såsom degenerative og onkologiske sygdomme: hvis redoxubalance skal bufferes med stoffer, der er giftige, så er disse stoffer sandsynligvis mekanismer for de patologier, der co. - opstår med redox ubalance.

Vi indser, at vores tilgang til redox-ubalance kan forstås som en usædvanlig variation af undersøgelsen af ​​metabolisk netværks robusthed, og at den kan anklage visse forbehold, der giver masser af plads til forbedring. Med hensyn til robusthed definerede undersøgelser, der anvender FBA, det traditionelt som en ændring af den objektive løsning (typisk vækst) som reaktion på varierende reduktioner i reaktionshastighederne, f.eks. (Edwards og Palsson, 2000), snarere end på en bestemt forstyrrelse (redox-ubalance). ) i metabolitterne, som vi gør. Med hensyn til begrænsningerne af vores analyse kan de være forbundet med iboende begrænsninger af FBA selv, som fraværet af regulatoriske gener. I sidste ende afhænger pålideligheden af ​​vores resultater af den forudsigelige kraft af de metaboliske rekonstruktioner: de nuværende gærmodeller er forudsigelige og avancerede, men de er ikke perfekte (Heavner og Price, 2015), og stadig er de langt bedre end selv de mest nøjagtige flercellede rekonstruktioner tilgængelige. På trods af alle disse bekymringer er der masser af beviser, der berettiger den stigende troskab af metaboliske modeller til naturlig adfærd.

I øjeblikket har den fremherskende forskning en tendens til at ignorere de potentielle negative konsekvenser af vilkårligt at reducere NADH/NADH-forholdet. Dette skyldes til dels de lovende fordele som følge af de milde reduktioner, der er opnået eksperimentelt, som omfatter reduktion af neoplastiske fænotyper, levetid og forlængelse af sundheden. Der er dog nye beviser, der anbefaler ekstrem forsigtighed med hensyn til disse positive resultater (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), såvel som en solid, eksperimentelt vedvarende teoretisk ramme, der forudsiger negative konsekvenser af faldende NADH/NADH-forhold ud over en tærskel (Aon et al.,2010). Vores NADH/NADt-ubalancetoleranceprofiler imødekommer dette nye billede, da milde oxidative afvigelser kan være gavnlige, men højere er lige så skadelige som den modsatte yderlighed.

Mere specifikt antyder vores toleranceprofiler, at udover at forårsage kemiske eller fysiologiske problemer, skal både lave og høje NADH/NADH-forhold også opfyldes med rene metaboliske ulemper, herunder nedsat energitilgængelighed og/eller biosyntetisk output. Ydermere, og som vi har påpeget, synes de begrænsede eksperimentelle observationer, der er tilgængelige på nogle af de spørgsmål, vi tager fat på, at minde om de resultater, vi rapporterer her.

Studiets begrænsninger

Resultaterne, der præsenteres her, vil forbedres, når de anvendte modeller bliver yderligere forfinet. Vores arbejde lider også under de iboende begrænsninger af FBA som teknik. For eksempel er dynamisk information slået fra, da de aktuelt tilgængelige versioner af dynamisk fluxanalyse er for reduceret i omfang. På samme måde mindsker manglen på implicitte energibegrænsninger i fluxbalance dens forudsigelse for høje vækstrater. Denne svaghed har motiveret tilføjelsen af ​​teknikker såsom CAFBA, som vi overvejede i manuskriptet. Endelig ville det være interessant at få adgang til regulatoriske oplysninger, som nemt kan kontrolleres og slås til eller fra. På nuværende tidspunkt er der ingen standardiserede tilgange til implementering af genregulering i FBA. Anvendelsen af ​​reaktionsaktivitetsscore til begrænsningsgrænser er lovende i denne henseende.

Denne artikel er uddraget fra iScience 24, 102697, 23. juli 2021