Vejen til fremskridt i prækliniske undersøgelser af aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme: et perspektiv på gnavere og HiPSC-afledte modeller, del 5

Fordele ved hiPSC-afledte cellulære systemer og sygdomsmodeller

Forbedret sygdomsmodellering og lægemiddelopdagelsesplatforme

Potentialet for hiPSC-baserede in vitro-modeller til at være meget informative for NDD'er med en undersøgelse af human genetisk komponent er høj.

Forholdet mellem menneskelig genetik og hukommelse er et meget omdiskuteret emne, især i det moderne samfund, hvor vi fokuserer på personlig udvikling og læring. Selvom vores genetiske information bestemmer vores grundlæggende egenskaber ved fødslen, er hukommelsen forskellig fra faste egenskaber såsom vores højde og hudfarve. I stedet kan det dyrkes og forbedres, og det spiller en vigtig rolle i dagligdagen.

Først og fremmest viser videnskabelig forskning, at hukommelsen ikke er direkte relateret til genetiske gener. Selvom nogle mennesker er født klogere end andre, kan hukommelsen i det lange løb gradvist forbedres gennem læring og kultivering. I vores læringsproces fra folkeskole til universitet er vi nødt til konstant at bruge og forbedre vores hukommelse for at forbedre vores akademiske præstationer. For eksempel husker vi problemer og løsninger gennem gentagen gennemgang og øvelse, hvilket er med til at træne vores hukommelsesevne.

For det andet hjælper en sund livsstil også vores hukommelse meget. Fysisk sundhed har stor indflydelse og effekt på hukommelsen, såsom tilstrækkelig søvn, en sund kost og moderat motion. Vi starter med vores egen krop og holder os sunde gennem træning og en sund livsstil, som vil gøre vores hukommelse klarere og skarpere.

Endelig kan vi også udvide vores hukommelsesevne ved hele tiden at udvide vores horisont og deltage i forskellige nye ting. For eksempel kan vi prøve at lære et nyt sprog og deltage i sociale aktiviteter som rejser, og disse oplevelser kan skabe flere minder i vores sind.

Kort sagt er forholdet mellem menneskelig genetik og hukommelse komplekst og mangfoldigt, og selvfølgelig vil der være tilsvarende forskelle baseret på personlige genetiske forskelle. Men vi bør ikke ignorere, hvad vi kan gøre: at forbedre vores hukommelse og selvledelsesevne gennem kontinuerlig læring, sund livsstil og konstant udvidelse af vores horisont er den bedste måde for os at overvinde genetiske forskelle. Det kan ses, at vi skal forbedre vores hukommelse, og Cistanche kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche er en traditionel kinesisk medicin med mange unikke effekter, hvoraf den ene er at forbedre hukommelsen. Effektiviteten af ​​Cistanche kommer fra dets forskellige aktive ingredienser, herunder garvesyre, polysaccharider, flavonoidglycosider osv. Disse ingredienser kan fremme hjernens sundhed på mange måder.

Klik på Kend for at forbedre korttidshukommelsen

Evnen til at korrelere NDD-kandidatgener til cellulære fænotyper, såsom RNA- og proteinekspressionsprofiler, morfologiske ændringer og biokemiske signaturer i hiPSC-afledte celler, letter undersøgelser, der adresserer, hvordan de humane genetiske komponenter af komplekse NDD'er, såsom AD og PD, udtrykkes på et cellulært niveau.

Desuden tillader hiPSC'er inkorporering af den genetiske kompleksitet af underliggende patientgenetiske baggrunde i modellen, som ofte er negeret (f.eks. kemiske modeller) eller oversimplificeret (f.eks. monogenetiske variantdyremodeller).

Det er velkendt, at starten, progressionen og sværhedsgraden af ​​neurodegeneration bestemmes af komplekse genetiske faktorer og samspillet mellem flere genetiske varianter med relativt små effekter.

Dette medfødte genetiske landskab fanget i patient-afledte hiPSC-modeller giver os mulighed for at undersøge genetiske determinanter og biologiske faktorer, parret med evnen til at generere modulære, high-fidelity in vitro NDD-modeller, for at bygge videre på vores nuværende forståelse af sygdomsbiologi.hiPSC-teknologi repræsenterer i øjeblikket det eneste tilgængelige menneskelige menneske. -baserede modeller, hvor patientens fulde genetiske landskab fanges.

Muligheden for at anvende genom-redigeringsteknologier, såsom CRISPR-Cas9, ved hjælp af hiPSC'er muliggjorde også generering af isogene modeller til evaluering af præcise genetiske varianter. Ud over skalerbarhed er hiPSC'er selvfornyelige.

Således præsenterer hiPSC-afledte modeller et forreste lovende system til prækliniske undersøgelser. Desuden gør den menneskelige genetiske mangfoldighed fanget i patient-afledt hiPSCcapacity dem egnede til evaluering af "personaliseret medicin" tilgange.

Evnen til effektivt at screene individuelle reaktioner på behandlinger og identificere non-responders eller dårlige respondere før administration i et klinisk miljø understreger yderligere egnetheden af ​​hiPSC-afledte modeller til prækliniske vurderinger (figur 2).

Samlet set er den potentielle information, der genereres gennem prækliniske undersøgelser i hiPSC-modeller, robust, relevant for menneskelige forsøgspersoner og essentiel at implementere i design af kliniske forsøg (f.eks. stratificering af forsøgspersonerne) for at forbedre resultaternes nøjagtighed.

Overvindelse af begrænsninger for dyremodeller

hiPSC'er tilbyder en måde at overvinde mange af de problemer, der findes i nuværende dyrebaserede modeller, som tidligere diskuteret. For det første giver iPS-afledte modeller en menneskebaseret platform til at evaluere potentielle terapeutiske midler i det faktiske genetiske landskab af den menneskelige sygdom.

For det andet, ved at udlede celler fra patienter, omgås mange tekniske spørgsmål vedrørende den bedste måde at modellere humane sygdomsmutationer på, fordi modellen indeholder patientens unikke genetiske baggrund. For det tredje er hiPSC-celler let tilgængelige for genetisk og farmakologisk manipulation, hvilket muliggør strukturelle og funktionelle assays med høj kapacitet, der vurderer sygdomsfænotype.

Til dette formål udviklede vi for nylig en hiPSC-afledt DA neuronal model opnået fra en PD-patient med SNCA-triplikation for at vurdere en alt-i-en LV GT med det formål at reducere SNCA-niveauer. Vores LV-intervention reducerede med succes SNCA-niveauer og reddede sygdomsrelaterede fænotyper gennem generering af reaktive oxidative arter (ROS) og bevarelse af cellulær levedygtighed.140

For det fjerde, sammenlignet med standardgnavermodellen, kan genereringen af ​​in vitro hiPSC-baserede modeller opnås på en betydeligt kortere tidslinje, i størrelsesordenen 30 dage i modsætning til dyremodeller, der kan variere bredt fra måneder til år.

For det femte, og i overensstemmelse med det foregående punkt, er hiPSC-baserede modeller betydeligt billigere og energiforbrugende end gnavermodeller, især når man overvejer løbende husholdningsforpligtelser og infrastruktur, regler samt uddannelses- og overholdelseskrav. Stadig mere økonomisk præklinisk sygdomsmodellering øger tilgængeligheden for forskergrupper til at vurdere formodede terapier, forbedrer oversætteligheden og i sidste ende forbedre DMT-udviklingseffektiviteten.202

Alt i alt giver disse fordelehiPSC-afledte modeller en klar fordel i studiet af neurodegeneration, og sådanne modeller har potentialet til at generere nye opdagelser, der var utilgængelige i tidligere cellekultur- og dyresygdomsmodeller.

De undersøgelser, der er gennemgået her, viser nødvendigheden og værdien af ​​inkorporeringen af ​​2D- og 3D-hiPSC-baserede modeller i NDD-mekanistiske undersøgelser, der belyser faktorer involveret i sygdomsårsag og patogene veje, såvel som i translationelle og lægemiddelopdagelsesundersøgelser, såsom identifikation og validering af terapeutiske mål. .

Tilsammen repræsenterer hiPSC-afledte NDD-modeller et spring fremad inden for medicinsk forskning gennem forbedret sygdomsmodellering, der er betydeligt mulig, med relativt kortere eksperimenter, der er omkostningseffektive og måske vigtigst af alt, nøjagtige og velegnede til modellering af menneskelige sygdomme.

Figur 2. Skematisk af forbedret DMT-lægemiddeludviklingspipeline for NDD'er gennem øget inkorporering og/eller substitution af hiPSC-afledte modeller Udvikling af enhver formodet DMT begynder med opdagelsesfasen, som omfatter både identifikation af relevante genmål og sygdomsmekanismer.

Efterfølgende sygdomsmodeller udformes i den tidlige prækliniske fase for at udforske den cellulære sygdoms patofysiologi og validere lægemiddelmål, samt tidlig screening og optimering af tidlige CGT-IP'er/DMT'er. Progressiv udvikling af DMT'er, herunder yderligere modeludvikling og målvalidering, samt undersøgelse af off-target-effekter, sker i den midt-prækliniske fase.

Efterhånden som DMT skrider frem, opnås yderligere information vedrørende farmakokinetisk og farmakodynamisk aktivitet i den senprækliniske fase. Den øgede brug af hiPSC-afledte modeller i disse faser repræsenterer en attraktiv forbedring af den eksisterende lægemiddeludviklingspipeline af flere årsager; de er nemlig omkostningseffektive, alsidige og vigtigst af alt overvinder de mange af de medfødte begrænsninger af eksisterende dyremodeller af NDD'er.

På dette stadium kan IND-ansøgninger indsendes for formodede DMT'er, som i øjeblikket indeholder 4 kritiske mål, der skal opfyldes med enhver ny DMT, især CGT-IP'er: (1) målvalg, (2) lede sammensatte udvikling og optimering, (3) indledende og eskalerende doseringsregime, og (4) etablering af gennemførlighed og ROA.

Hver af disse kan adresseres nøjagtigt og passende med substitution af hiPSC-baserede modeller i prækliniske undersøgelser. DMT'er kan derefter modtage FDA-godkendelse til at påbegynde kliniske forsøg.

Inkorporeringen af ​​hiPSC-baserede modeller i en yderligere fase 1a kan inkluderes, hvilket letter forbedret kandidatscreening i rekrutteringsfasen og identifikation af potentielle non-responders eller dårlige respondere baseret på prækliniske genetiske undersøgelser.

DMT'er med påviselig sikkerhed i fase 1a går derefter gennem fase 1, 2 og 3 kliniske forsøg, hvorefter dem med en signifikant positiv effekt modtager regulatorisk godkendelse af New Drug Application (NDA) og frigives til forbrugerbrug med fortsat lægemiddelovervågning for at identificere eventuelle tidligere uidentificerede ugunstige resultater over tid.

Begrænsninger af hiPSC-afledte in vitro-modeller Tid og reproducerbarhed

Dyrkningsteknologierne for hiPSC'er dukkede op i løbet af det sidste årti, og deres anvendelighed til sygdomsmodellering og præklinisk vurdering af formodede DMT'er er relativt ny.

Som med enhver ny teknologi skal flere begrænsninger overvejes, når man forsøger at genskabe de biologiske karakteristika af NDD'er nøjagtigt. Først og fremmest kan dyrkning af hiPSC'er og generering af nøjagtige og pålidelige cellemodeller være dyrt, arbejdskrævende og tidskrævende. I gennemsnit koster det $10,000 til USD 25,000 at validere hiPSC-linjer på en passende standard til medicinsk forskning.203

Processerne med omprogrammering, differentiering og modning forlænges. Cellulær omprogrammering af startervæv til hiPSC'er kan tage mindst 20 til 30 dage,151 og efterfølgende cellulær differentiering og modning varierer afhængigt af den ønskede cellulære type og anvendte metode; generering af modne neuroner, astrocytter og mikrogliacan kræver f.eks. alt fra 6 til 15 uger,204 4 til 9 uger, henholdsvis 205.206 eller 5 til 9 uger, 164.207.

Som et resultat heraf foretrækker forskere ofte brugen af ​​progenitorceller som stabile mellemprodukter til eksperimenter, da de i store træk er repræsentative for målcelletypen og kan genereres i en hurtigere tidsramme.204 Således kan tidsbegrænsningerne og omkostningerne, der kræves for at etablere hiPSCmodel-systemet, muligvis giver anledning til bekymring for mange forskningsgrupper.

Derudover er den tid, der kræves til udvikling af nøglesygdomsassocierede cellulære fænotyper i hiPSC-afledte celler, også en overvejelse ved modellering af NDD'er. Mens det tager årtier af en patients liv at præsentere kliniske og patologiske symptomer, blev sygdomsrelaterede molekylære fænotyper i hiPSC-afledte modeller opdaget omkring 2 måneder efter modning.208

Ikke desto mindre stammer begrænsningerne fra den begrænsede levetid for hiPSC-baserede modellers kultur, der muligvis ikke er tilstrækkelig til at udvikle et komplet billede, der ligner sygdommen på celle- og vævsniveauer.

Strategier, der tager sigte på at fremskynde differentiering og modningsprocessen, såsom inkorporering af Notch og g-secretase-hæmmere for at forkorte modningstiden,209 og neurogenin-2 (Ngn2) eller NeuroD1-overekspression158 har været delvist vellykkede og introducerede andre bekymringer fra ektopisk ekspression.

Andre begrænsninger er relateret til reproducerbarheden af ​​systemerne i gentagne eksperimenter og den iboende model-til-model variabilitet, herunder tilbageslag med hensyn til renheden af ​​de hiPSC-afledte kulturer og tilstedeværelsen af ​​uønskede heterogene cellulære populationer.210

Det er således vigtigt at tage højde for heterogenitet i cellepopulationer, når man bruger hiPSC-afledte sygdomsmodeller, især inDMT-screening og effektivitetsvurdering. Desuden er hiPSC-kulturer blevet rapporteret at udvise genomisk ustabilitet og er tilbøjelige til at erhverve genetiske aberrationer og mutationer under cellulær ekspansion og omprogrammering.211

Der skal også udvises forsigtighed ved brugen af ​​isogene linjer genereret af forskellige genom-redigeringsteknikker, da potentielle effekter uden for mål kan forekomme (f.eks. utilsigtet klonal variabilitet på tværs af isogene linjer og mutagenese uden for mål).212,213 Derfor er det vigtigt at evaluere med jævne mellemrum. den genomiske stabilitet af hiPSC'er for at sikre streng DMT-screening.

Udfordringer i at rekapitulere sporadisk NDD-patofysiologi og cellulære fænotyper

Kompleksiteten af ​​NDD'er og manglen på omfattende karakterisering og mekanistisk forståelse af deres cellulære fænotyper udgør en udfordring i evnen til at rekapitulere dem med cellulære modeller, herunder hiPSC-baserede systemer.

Årsagerne til NDD'er er komplekse og multifaktorielle, herunder polygene risikofaktorer (dvs. multiplegener og varianter), epigenetiske mærker, aldring, køn og miljøfaktorer, såsom oxidativ stress-triggere, hvoraf nogle er svære at fremkalde, specifikt i en endeløs liste af forskellige kombinationer, i et laboratoriesystem.

Ydermere stammer størstedelen af ​​hiPSC-afledte AD-PD-modeller fra patienter med familiære mutationer, der kun repræsenterer en meget lille del af de samlede tilfælde.214.215 Da mekanismerne, der understøtter de familiære versus sporadiske former, kan være forskellige, er der behov for at etablere modeller afledt af hiPSCs og fibroblaster opnået fra sAD eller sporadiske PD-patienter.

I retning af dette mål er der opstået initiativer fra patienters cellelagre i de seneste år; disse omfatter Applied StemCell (ASC), California Institute for Regenerative Medicine (CiRA), Cedars Sinai Induced Pluripotent Stem Cell Core, European Bank for Induced Pluripotent StemCells (EBiSC), Korean National Stem Cell Bank (KSCB), NationalInstitute of Aging (NIA) , National Institue of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) og WiCell Research Institute (WiCell) (tabel S2).

Den forventede vækst af disse samlinger vil lette etableringen af ​​hiPSC-afledte modeller, der er mere egnede til forskning af den almindelige sAD og sporadiske PD.

Ikke desto mindre producerer hiPSC-modeller afledt af sporadiske NDD-patienter passende cellulære fænotyper, der er karakteristiske for AD181 og PD216 ved miljømæssige manipulationer, såsom eksponeringer for neurotoksiner og kemisk induktion af oxidativt stress.

En nylig undersøgelse afslørede også ændringer i mitokondriel proteinekspression og forhøjet oxidativ stress i hiPSC'er genereret fra sAD-patienter, på trods af en markant mangel på Ab- og tau-patologi,217, hvilket tyder på, at hiPSC-modeller kan afsløre værdifuld indsigt i den nuancerede patofysiologi, der er specifik for sporadiske NDD-subtyper.

Ydermere anvendte en nylig undersøgelse af Meyer et al.218 hiPSC'er afledt af sAD-patienter og fandt, at MAPT, der koder for tau-proteinet, var signifikant forøget i sAD-afledte celler sammenlignet med raske kontroller.

På trods af disse udfordringer er nuværende hiPSC-afledte modeller således fremragende surrogater, der giver mulighed for at efterligne sygdoms patofysiologi og etablere guldstandard sygdomskarakteristika med den fulde genetiske underbygning i sporadiske patienter, som kan udnyttes som resultatmål for at forbedre efterfølgende sygdomsmodeller.

For more information:1950477648nn@gmail.com