Den hæmmende effekt af curcuminderivat J147 på melanogenese og melanosomtransport ved at facilitere ERK-medieret MITF-nedbrydning del 1

Den terapeutiske anvendelse af curcumin og kemisk modificeret curcumin (CMC) til at undertrykke melanogenese og tyrosinaseaktivitet er blevet anerkendt. J147 er en modificeret version af curcumin med overlegen biotilgængelighed og stabilitet. Der er dog ingen rapport om virkningerne af J147 på pigmentering in vitro og in vivo. I vores undersøgelser undersøgte vi de hypopigmentære virkninger af J147-behandling på melanocytter og undersøgte den underliggende mekanisme. De nuværende undersøgelser antydede, at J147 undertrykte både basal og -MSH-induceret melanogenese, såvel som nedsat melanocytdendritforlængelse og melanosomtransport. J147 spillede disse roller hovedsageligt ved at aktivere den ekstracellulære signalregulerede proteinkinase (ERK) vej. Når det først var aktiveret, resulterede det i MITF-nedbrydning og yderligere nedregulerede ekspressionen af ​​tyrosinase, TRP-1, TRP-2, Myosin Va, Rab27a og Cdc42, hvilket i sidste ende hæmmede melaninsyntese og melanosomtransport. Ydermere blev de hypopigmentære virkninger af J147 påvist in vivo i en zebrafiskmodel og UVB-induceret hyperpigmenteringsmodel i brune marsvin. Vores resultater antydede også, at J147 ikke udviste nogen cytotoksicitet in vitro og in vivo. Tilsammen bekræftede disse data, at J147 kan vise sig at være ganske nyttig som et sikrere naturligt hudblegemiddel.

Cistanchehar også funktionen affremme af kollagenproduktionen, som kan øge hudens elasticitet og glans og hjælpe med at reparere beskadigede hudceller. CistanchePhenylethanol Glycosiderhave en væsentlig nedregulerende effekt påtyrosinaseaktivitet, og effekten på tyrosinase er vist at være konkurrencedygtig og reversibel hæmning, hvilket kan give et videnskabeligt grundlag for at udvikle og udnyttehvidteingredienseri Cistanche. Derfor har cistanche en nøglerolle i hudblegning. Det kanhæmmer melaninproduktionenfor at reducere misfarvning og sløvhed; og fremme kollagenproduktion tilforbedre hudens elasticitetog udstråling. På grund af den udbredte anerkendelse af disse virkninger af cistanche, mangehudblegningprodukter er begyndt at infundere urteingredienser såsom Cistanche for at imødekomme forbrugernes efterspørgsel og dermed øge den kommercielle værdi af Cistanche i hudblegningsprodukter. Sammenfattende er cistanches rolle i hudblegning afgørende. Dens antioxidantvirkning og kollagenproducerende effekt kan reducere misfarvning og sløvhed, forbedre hudens elasticitet og glans og dermed opnå en blegende effekt. Den brede anvendelse af Cistanche i hudblegningsprodukter viser også, at dens rolle i kommerciel værdi ikke kan undervurderes.

Nøgleord: J147, hypopigmentære effekter, melanosomtransport, ERK-vej, MITF-nedbrydning

Klik på Cistanche Tubulosa for blegning

For flere oplysninger: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

INTRODUKTION

Hudpigmentering afhænger af både melaninsyntese og fordeling i epidermislaget. Melanin produceres hovedsageligt omkring kernen af ​​melanocytter og lagres i melanosomer (Tian et al., 2021). Efter modning migrerede melanosomer langs mikrotubuli og actinfilamenter til cellernes dendritspidser og til sidst til de nærliggende keratinocytter for at afslutte distributionsprocessen (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi og Fukuda, 2012). Under normal fysiologisk status beskytter melanin menneskets hud mod ultraviolet (UV) skade, giftige kemikalier og andre miljøfaktorer (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Men overdreven produktion og akkumulering inducerer hyperpigmentering og er forbundet med hudlidelser som post-inflammatorisk melanoderma, melasma og solar lentigines, hvilket fører til en bemærkelsesværdig psykosocial byrde (Pillaiyar et al., 2017). Derfor er det nødvendigt at udvikle effektive og sikre hudblegemidler.

I de senere år er melanincellebiologi blevet et bredere forskningsfelt, og adskillige vigtige proteiner, der bidrager til melanogenese og melanosomtransport, er blevet belyst, hvilket er vejen til at identificere melaninsyntesehæmmere. Tyrosinase er udelukkende nødvendig for melanogenese, og inhibering af tyrosinase-katalytisk virkning er den mest almindelige metode til at reducere melaninproduktionen (D'Mello et al., 2016). Adskillige kendte tyrosinasehæmmere, herunder arbutin og kojinsyre, er allerede blevet udviklet som kosmetiske tilsætningsstoffer (Ding et al., 2020). KIF5b og Rab27A-Melanophilin-Myosin Va-kompleks bidrager til den udadgående melanosomtransport (Ohbayashi og Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 regulerer dendritforlængelse, som er afgørende for melanosomoverførsel (Luo, 2000). Hæmningen af ​​disse ovennævnte proteiner kunne signifikant undertrykke melanosomtransport, hvilket er en vigtig mekanisme til udvikling af hudblegemidler. Microphthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF) er en master transkriptionsfaktor i melanogenese. Derudover regulerer MITF også melanosomtransport ved at inducere ekspressionen af ​​Rab27a og Cdc42 (Noguchi et al., 2016). Flere signalveje deltager i pigmentering ved at regulere ekspressionsniveauet af MITF. Aktivering af cAMP proteinkinase A (PKA) stimulerer pigmentering gennem cAMP respons element binding protein (CREB) afhængig opregulering af MITF ekspression (Rodríguez og Setaluri, 2014). Omvendt hæmmer aktivering af ekstracellulær signalreguleret proteinkinase (ERK) melanogenese ved at accelerere MITF-nedbrydning (Lv et al., 2020a). Der er udviklet adskillige anti-melanogene midler, som målretter mod tyrosinaseaktivitet, melanosomoverførsel eller melanogene-relaterede signalveje. Men få inhibitorer gennemgik undersøgelser in vivo og viste gode resultater (Pillaiyar et al., 2017).

Curcumin er en diarylheptanoid-forbindelse, der er isoleret fra rhizom af Curcuma longa (Zingiberaceae) og bruges som en gul smag eller pigment i fødevarer (Zheng J. et al., 2018). Undersøgelser har vist dets forskellige fysiologiske funktioner, herunder anti-inflammatoriske, antioxidative, anti-amyloid og anti-tumor aktiviteter (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Bortset fra disse hæmmer curcumin tyrosinaseaktivitet og undertrykker melanogenese i melanocytter (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Men den dårlige biotilgængelighed af curcumin begrænser dets anvendelse (Karthikeyan et al., 2020). For at løse dette problem er J147 udviklet som en potent forbindelse af curcuminderivat med større stabilitet og biotilgængelighed (Li et al., 2020). J147 har en neurobeskyttende effekt og er i øjeblikket i fase I kliniske forsøg for Alzheimers sygdom. Der er dog stadig ingen rapport om virkningerne af J147 på pigmentering in vitro og in vivo.

MATERIALER OG METODER

Reagenser

J147 (J302241), -MSH (M118985) og tyrosinase fra svampe (T128536) blev opnået fra Aladdin (Shanghai, Kina). Vi opnåede antistoffer mod Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) og p38 MAPK (sc-398546) fra Santa Cruz (CA, USA). Antistofferne mod MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) og ERK (4695) blev opnået fra Cell Signaling Technology (MA, USA). Antistofferne mod tyrosinase (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), cytokeratin (ab7753) og S100 (ab133519) blev opnået fra Abcam (Cambridge, UK). p38-hæmmer SB203580 (S1863), ERK-hæmmer PD98059 (S1805), BCA-proteinassaykit (P0012), cellelysebuffer (P0013) og -actin (AF5001) blev opnået fra Beyotime (Shanghai, Kina). RT-qPCR-sæt (RR036A) blev købt fra Takara Biomedical Technology (Beijing, Kina).

Cellekultur

MTT-assay

Cellelevedygtighed blev undersøgt ved MTT-assay (Yun et al., 2020). Kort fortalt blev cellerne podet i 96-brøndsplader og behandlet med J147 (1-8 μM) i 48 timer. Derefter blev cellerne vasket med PBS og erstattet med MTT-opløsning (20 μL). Efter inkubation i yderligere 4 timer blev supernatantopløsningen fjernet, og DMSO (200 μL) blev tilsat til hver brønd. Endelig blev den optiske absorbans ved 570 nm bestemt.

Måling af melaninindhold

Celler med en tæthed på 2 × 105 celler/ml blev podet i 6-brøndkulturplader. Efter 24 timers inkubation blev celler dyrket med forskellige doser af J147 (1, 2, 4 μM) og med eller uden -MSH (60 nM) stimulering. Efter 48 timers behandling blev cellerne høstet, og det totale melanin i cellepelleten blev opløst i 100 μL NaOH arbejdsopløsning (1 mol/L, 10 procent DMSO) ved 80 grader C i 1 time, og absorbansen blev målt til 405. nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Tyrosinaseaktivitetsanalyse

Cellulær tyrosinaseaktivitet blev undersøgt som beskrevet tidligere (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). Kort fortalt blev celler lyseret med cellelysebuffer efter vask tre gange, og derefter blev supernatanten til tyrosinaseaktivitetsassay opnået ved centrifugering af lysaterne. 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) indeholdende 10 ug proteiner blandet med 100 μL 0,1 procent L-DOPA. Pladen blev inkuberet ved 37 grader i 1 time, og derefter blev optisk absorbans ved 475 nm overvåget.

Den direkte effekt af J147 på tyrosinaseaktivitet blev testet af et cellefrit system som beskrevet tidligere (Lv et al., 2020a). Kort sagt blev reaktionen til bestemmelse af svampe-tyrosinase-aktivitet udført i en 96-brøndplade, og reaktionsblandingen indeholdt svampe-tyrosinase (10 enheder), L-tyrosin (0,03 procent, 50 μL) og 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) tilsætning med forskellige koncentrationer af J147. Efter inkubation ved 37 grader i 10 minutter blev absorbans ved 475 nm målt ved anvendelse af et mikropladespektrofotometer.

Masson-Fontana ammoniaksølvfarvning

For at påvise melaninpigment blev hudstykker og melanocytter fikseret i formalin og farvet efter standardprotokollen (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Kort fortalt blev objektglassene vasket 3 gange med deioniseret vand og derefter inkuberet i ammoniakalsk sølvopløsning ved stuetemperatur i 12 timer. Efter godt skylning i deioniseret vand blev objektglassene inkuberet i hypoopløsning i 5 min. Derefter blev objektglassene skyllet igen og modfarvet med en neutral rød plet i yderligere 5 min. Til sidst, efter grundig skylning, blev objektglassene observeret under et Nikon-Eclipse-Ti-mikroskop.

Immunfluorescens til melanosomoverførsel

Samkultursystemet af B16F10- og HaCaT-celler blev etableret på den konfokale skål, som beskrevet tidligere (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). Efter J147-behandlingen blev cellerne immunfarvet med anti-GP100 og anti-Cytokeratin ifølge standardprotokollen. Billeder blev taget fra Nikon-Eclipse-Ti mikroskopet.

Immunhistokemi for S-100

Immunhistokemi for S-100 blev udført som tidligere beskrevet (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). En kort beskrivelse var som følger: Objektglas blev blokeret med 5 procent BSA ved 25 grader C i 1 time og derefter inkuberet med anti-S-100 primært antistof ved 4 grader C natten over. Den næste dag blev objektglassene vasket 3 gange med TBST-opløsning og inkuberet med det sekundære antistof. Derefter blev objektglassene behandlet med aminoethylcarbazol for at fremkalde snittene og blev observeret under et mikroskop.

Omvendt transkription – PCR

Cellulært totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol-reagens og kvantificeret spektrofotometrisk. Derefter blev SuperScript II revers transkriptase brugt til at syntetisere enkeltstrengetcDNA efter fremstillingsinstruktionerne.Oligonukleotidprimere blev købt fra GenScript(Nanjing, Kina). Sekvenserne afMITFgen primere er 5′- AGAGCAGGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. Sekvenserne afGAPDHgenprimere er 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. PCR-produkter varadskilt ved elektroforese på 1 procent agarosegeler og påvistunder ultraviolet lys (Lee et al., 2013).

Vestlig blotting

Proteiner (40 ug) blev separeret med SDS-PAGE geler og overført til nitrocellulosefilter (NC) membraner ved hjælp af et elektroforetisk overføringssystem (Bio-Rad). NC-membraner blev blokeret med 3 procent BSA i TBST-opløsning ved stuetemperatur i 1,5 time. Derefter blev membraner inkuberet med primære antistoffer ved 4 grader natten over. Den næste dag blev blottene vasket 3 gange med TBST-opløsning og derefter inkuberet med peroxidase-konjugerede sekundære antistoffer ved 25 grader i 1 time og visualiseret ved at bruge forstærket kemiluminescens (Lv et al., 2020d).

Bestemmelse af melaninindhold i zebrafiskmodel

Kort fortalt blev synkroniserede embryoner opsamlet og opstillet med pipette (tre til fire embryoner pr. brønd med 200 μL embryomedium i 96-brøndsplader). Derefter blev J147 og PTU opløst i 0,1 procent DMSO og blev tilsat til embryomediet fra 35 til 60 timer (25 timers eksponering). Indflydelsen af ​​J147 på melanogenesen af ​​zebrafisk blev observeret under stereomikroskopet (Zheng J. et al., 2018).

Fænotype-baseret evaluering og UVB-induceret hyperpigmentering marsvin model

8 brune marsvin (6 uger, ca. 250-300 g) blev købt fra Institute of Laboratory Animal Science (Beijing, Kina). Disse marsvin blev holdt alene i et rum med konstant temperatur og fugtighed under en 12-h lys/mørke cyklus. De separate områder (1 cm diametral cirkel) på ryggen af ​​hvert dyr blev udsat for 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Shanghai, Kina) én gang dagligt i 1 uge for at etablere hyperpigmenteringsmodellen. Derefter blev vehiklet (PEG400/EtOH=7:3) og J147 (1 procent) givet til de hyperpigmenterede områder (20 μL opløsning pr. cirkel) to gange om dagen i 3 uger. Graden af ​​pigmentering blev evalueret ved at beregne ΔL-værdien i henhold til L-værdien målt med spektrofotometeret (YS3010, 3nh, Shenzhen, Kina), som følger: ΔL=L (ved hver dag målt)-L (på dag 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Alle dyreprocedurer i denne undersøgelse blev godkendt af dyrepleje- og brugsudvalget på Changzhou University.

Statistisk analyse

RESULTATER

J147 Nedsat melanogenese og antallet af dendritter i B16F10-celler

Strukturen af ​​J147 er vist i figur 1A. For det første blev et cellelevedygtighedseksperiment udført for at undersøge, om J147 var cytotoksisk for B16F10-celler. Som vist i figur 1B blev der ikke observeret nogen cytotoksiske virkninger af J147 ved et doseringsområde på 1-8 μM efter 48 timer. Derefter undersøgte vi indflydelsen af ​​J147 på melaninsyntese. Som vist i figur 1C inhiberede J147 basal melaninsyntese. -MSH fremmer markant melanogenese i melanocytter. Stigningen i melanogenese induceret af -MSH blev vendt efter J147-behandling. Konsekvent viste Masson-Fontana ammoniaksølvfarvning, at J147 bemærkelsesværdigt reducerede melaninindholdet i B16F10-celler med eller uden -MSH (Figur 1D). Derudover blev antallet og længden af ​​dendritter og melaninkoncentrationen i dendritter også faldet sammenlignet med ubehandlede celler (figur 1D). Resultaterne antydede, at J147 reducerede melanogenese og dendritdannelse uden cytotoksiske effekter.

J147 hæmmede den cellulære tyrosinaseaktivitet og ekspressionen af ​​tyrosinase, TRP-1, TRP-2

Tyrosinasefamilien af ​​proteiner (tyrosinase, TRP-1 og TRP-2) deltog i melanogenese. Blandt disse er tyrosinaser nøgleenzymer, der regulerer melaninbiosyntesevejen (D'Mello et al., 2016). For at bestemme, om J147 påvirker tyrosinaseaktivitet, brugte vi først L-DOPA-oxidationsmetoden til at bestemme virkningerne af J147 på cellulær tyrosinaseaktivitet. J147 (1-4 μM) viste sig at udøve dybtgående hæmmende virkninger på cellulær tyrosinaseaktivitet på en dosisafhængig måde i B16F10-celler (figur 2A). Dernæst blev en svampetyrosinaseaktivitetsanalyse udført for at bestemme de direkte virkninger af J147 på tyrosinaseaktivitet. Som vist i figur 2B blev der ikke observeret nogen inhiberende virkninger, hvilket indikerer, at J147 ikke påvirkede de enzymatiske aktiviteter af svampetyrosinase (figur 2B). Som vi ved, styres melanogenese af aktiviteten og mængderne af disse tyrosinaser. For at undersøge, om de anti-melanogene virkninger af J147 er korreleret med ekspressionen af ​​tyrosinase, blev der udført western blot-analyse. Som vist i figur 2C blev niveauerne af tyrosinase-ekspression signifikant reduceret efter J147-behandling med eller uden -MSH, og de samme resultater blev observeret i TRP-1- og TRP-2-ekspressionen. Disse observationer indikerede, at J147 hæmmede cellulær tyrosinaseaktivitet og melanogenese ved at reducere ekspressionsniveauerne af tyrosinase, TRP-1 og TRP-2.

J147 hæmmede melanosomtransport ved at regulere udtrykket af myosin Va, Rab27a og Cdc42

Menneskelig hudpigmentering bestemmes af melaninsyntese såvel som fordelingen af ​​melanin. I pattedyrmelanocytter fremstilles melanin hovedsageligt i cellekroppen ogvandrer langs aktinfilamenterog mikrotubuli til dendritter, og endeligtil de nærliggende keratinocytter for at afsluttefordelingenproces (Ohbayashi og Fukuda, 2012). Som vist iFigur 1D, J147 reducerede dendritdannelsen markant.Desuden var melaninkoncentrationen i dendritter ogsåreduceret, da melaninpigmentet blev aggregeret i det perinukleareregioner. Dernæst co-dyrkede vi B16F10- og HaCaT-celler tilundersøge om J147 påvirkermelanosom overførsel tilkeratinocytter ved konfokal mikroskopi. Fordelingen afmelanin blev set i HaCaT-cellerne i co-kulturenmodel (Figur 3A). I modsætning hertil, mens co-kultur modellen varbehandlet med J147 i 48 timer, melanosom granulære signaler indHaCaT-celler var signifikantreduceret (Figur 3A).

For yderligere at afklare den underliggende mekanisme for inhiberingseffekterne af melanosomoverførsel af J147 undersøgte vi flere afgørende faktorer involveret i melanosomtransport. KIF5b medierer udadgående melanosomtransport langs mikrotubuli, og Rab27a Melanophilin-Myosin Va-komplekset bidrager til melanosomtransport langs actinfilamenter i melanocytter (Reiner et al., 2020). Derudover stimulerer Cdc42 dendritdannelse i melanocytter, som også spiller en væsentlig rolle i melanosomtransport. Som vist i figur 3B var ekspressionen af ​​Cdc42, Myosin Va og Rab27a, men ikke KIF5b, signifikant reduceret efter J147-behandling i tilstanden med eller uden -MSH. Vores resultater indikerede, at J147 hæmmede melanosomtransport ved at reducere ekspressionen af ​​Myosin Va, Rab27a og Cdc42.

J147 Accelereret MITF-nedbrydning

MITF er en af ​​nøgleregulatorerne for melanogenese, og den kontrollerer gentranskriptionen af ​​tyrosinase, TRP-1, TRP-2, Cdc42 og Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019 ). Vi undersøgte først indflydelsen af ​​J147 på MITF-transskriptioner. Som vist i figur 4A øgede -MSH bemærkelsesværdigt MITF-transkription, men ingen ændring blev observeret efter J147-behandling, hvilket indikerer, at J147 ikke nedregulerer MITF-ekspression. Dernæst undersøgte vi, om J147 påvirker oversættelsen af ​​MITF. Som vist i figur 4B, efter -MSH-behandling, steg MITF-proteinniveauer, toppede efter 4 timer og begyndte at falde efter 8 timer (figur 4B). På en anden måde faldt proteinniveauerne af MITF ikke 4 timer efter J147-behandling, men efter 8 timer faldt MITF-proteinniveauerne hurtigt til upåviselige niveauer, hvilket indikerer, at J147 ikke påvirker translationen af ​​MITF, men markant accelererer MITF-proteinnedbrydning.

J147 undertrykt melanogenese gennem MEK/ERK-signalvejen

Mitogen-aktiverede proteinkinaser (MAPK) signalvej, herunder ekstracellulær signalreguleret proteinkinase (ERK), p38 og c-jun N-terminal kinase (JNK), spiller afgørende roller i pigmentering (Lee et al., 2013). ERK-phosphorylering er kendt for at lette nedbrydningen af ​​MITF og til sidst sprede de melanogene stimuli, som repræsenterer en væsentlig negativ feedback-mekanisme (Kwon et al., 2017). Funktionen af ​​p38 og JNK-vejen forbliver dog kontroversiel. Derfor undersøgte vi effekten af ​​J147 på MAPK-signalvejene. Som vist i figur 5A aktiverede J147 MEK/ERK og p38, hvorimod der ikke blev fundet nogen indflydelse i phosphoryleringen af ​​JNK-signalvejen.

For flere oplysninger: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501