Del Ⅰ: Nyreorganoider genereret fra erythroide stamceller fra patienter med autosomal dominant polycystisk nyresygdom

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice, & et al.

Introduktion

Autosomal dominant polycystisknyre sygdom(ADPKD) er den hyppigste genetiske årsag til kronisk nyresygdom (CKD) på verdensplan, og det er en af ​​de mest udbredte arvelige monogene lidelser, der påvirker en population anslået til 1:400-1000 [1].ADPKD (Autosomal dominant polycystisknyre sygdom) er forårsaget af mutationer i generne PKD1 (type 1 polycystisk nyresygdom) og PKD2 (type 2 polycystisk nyresygdom), der koder for henholdsvis polycystin-1(PC1) og polycystin-2 (PC2), resulterer i ændringer i cilia og cystedannelse. Begge proteiner modulerer adskillige molekylære veje såvel som vævsmorfogenese og funktion. De nøjagtige molekylære mekanismer, der ligger til grund for cystogenese, forbliver dog uklare. Det er blevet godt accepteret, at en kimlinjemutation efterfulgt af en somatisk mutation (andet hit) i den normale allel er nødvendig for cystogenese [2,3]. Baseret på resultater fra orthologe musemodeller er det desuden blevet påvist, at en yderligere nyreskade (tredje-hit) er nødvendig for hurtig og alvorlig cystevækst i modne nyrer [4,5]. Det ser ud til, at hos mennesker forekommer de fleste andre hits under nyreudviklingen, hvilket fører til cystisk dannelse og vækst selv in utero. Derfor kan sværhedsgraden og hastigheden af ​​progression af nyresygdom som følge af PKD1 (type 1 polycystisk nyresygdom) og PKD2 (type 2 polycystisk nyresygdom) mutationer være påvirket af flere faktorer, herunder tidspunktet for inaktivering af generne, nyreudvikling. stadie, miljøpåvirkning, tilstedeværelse af samtidige nyrelæsioner og mangfoldighed af genetiske mutationer.

Selvom der har været utallige data vedrørende de patofysiologiske mekanismer af ADPKD (autosomal dominant polycystisknyre sygdom) indsamlet fra undersøgelser, der anvender orthologe og ikke-ortologe musemodeller, er kun en håndfuld undersøgelser med fokus på humane cellulære modeller af cystogenese tilgængelige [6]. I 2007 omprogrammerede Takahashi et al.[Z med succes somatiske celler til pluripotente stamceller med embryonale egenskaber, idet de kaldte dem "inducerede pluripotente stamceller" (iPSC'er). Siden da er mange somatiske cellekilder blevet omprogrammeret til iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) fra enten dyre- eller menneskevæv (hiPSC'er)[Z], med voksne fibroblaster, der repræsenterer hovedkilden til sidstnævnte. I 2013, Freedman et al.[8] inducerede hiPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) fra fibroblasterne af ADPKD (autosomal dominant polycystisknyre sygdom) patienter og fandt reduceret ciliær ekspression af polycystin-2, hvilket understøtter brugen af ​​sådanne celler til at undersøge patofysiologi af polycystisk sygdom (PKD). For nylig rapporterede Chen et al i 2016, at de havde opnået hiPS-celler fra erythroide stamceller [9].

I løbet af de sidste par år er der sket betydelige fremskridt i genereringen af ​​3-dimensionelle organoider fra iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) [Z,10-12]. Primærnyretubulære epitelorganoider kan stamme fra nyrevæv såvel som fra urin, og disse organoider er et vigtigt værktøj til personlig sygdomsmodellering, som vist af Schutgens et al. [13]. I efterfølgende undersøgelser har Freedman et al.[14] var i stand til at genererenyreorganoider afledt af en kommercielt tilgængelig hiPS-cellelinje, der etablerer en protokol til at generere de celletyper, der er til stede i den meta-nefriske masse, der giver anledning til alle strukturer af nefronen. Derefter ved at vælte PKD1 (type 1 polycystisknyresygdom) eller PKD2 (type 2 polycystisk nyresygdom) gener, observerede disse efterforskere cystedannelse franyretubuli. I lyset af alle disse avancerede og innovative teknologier sigtede vi på at opnå iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) fra de cirkulerende erythroide stamceller fra ADPKD (Autosomal dominant polycystisknyre sygdom)patienter og teste udviklingen af ​​nyreorganoider in vitro for at rekapitulere de trin, der er involveret i organogenese, og forsøge at fremkalde nogle patofysiologiske hændelser relateret til tidlig cystogenese.

Klik for at cistanche bivirkninger og fordele for nyrerne

Metoder Patientvalg

Blodprøver blev indsamlet fra to ikke-beslægtede kvindelige patienter (PT1 og PT2) klinisk diagnosticeret med ADPKD (Autosomal dominant polycystisk nyresygdom) (PT1:66 år gammel, eGFR 43,8 ml/min pr. 1,73 m2 og PT2:56 år gammel, eGFR 60,2 ml min pr. 1,73 m2), fulgt op ved Polycystisk Nyresygdom. Ambulatorie hos Nefrologiafdelingen ved Federal University of Sao Paulo (UNIFESP) og en anden prøve blev indsamlet fra en rask kvinde, som fungerede som en kontrol til at stabilisere og normalisere teknikken. ADPKD-diagnosen (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) var baseret på positiv familiehistorie og på tilstedeværelsen af ​​nyrecyster i henhold til de ultralydsdiagnostiske kriterier af Pei et al.[15].(Familiens stamtavler er vist i S1A Fig.). Begge patienter havde cystiske nyrer og lever (magnetiske resonansbilleder er vist i S1B Fig). Undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af universitetets etiske rådgivende udvalg (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199.-0079-10/2018). Efter et interview for at forklare formålet med undersøgelsen underskrev både patienter og den raske kontrol den informerede samtykkeerklæring.

Ekspansion af erythroide progenitorceller isoleret fra fuldblod Blodprøver blev opsamlet i et vacutainerrør indeholdende EDTA (som antikoagulant) ved stuetemperatur. Erythroid-stamceller (EP)-celler blev derefter separeret gennem en RosetteSep-metode (15216; Stem Cell Technologies), som fjernede uønskede celler, såsom modne RBC'er og blodplader, mens den ønskede EP-population blev bibeholdt. På grund af den lave koncentration af EP'er i fuldblod blev cellerne ekspanderet og dyrket i et specifikt dyrkningsmedium indeholdende cytokiner og kosttilskud (X-Vivo medium, Lonza). EP-celler blev identificeret ved flowcytometri under anvendelse af transferrinreceptoren (CD71) og glycophorin A(Gly A) som markører mærket med GFP (S2 Fig.).

Omprogrammering af erythroide stamceller

Udvidede EP-celler blev opsamlet og nukleoficeret ved hjælp af en Epi5 Episomal iPSC (inducerede pluripotente stamceller) omprogrammeringskit (Thermo Fisher) indeholdende en optimeret blanding af fem omprogrammeringsfaktorer (okt-4, Sox2, Lin28, L-Myc, og Klf4). Transfektion (elektroporation) blev udført med episomale vektorer (virusfri, ikke-integrerende) fra et Lonza Nucleo-faktorkit. Efter transfektion blev celler udpladet i ReproTeSR-specifikt dyrkningsmedium til omprogrammering (Stem Cell Technologies) under standard cellekulturbetingelser (37C, 95 procent CO og 5 procent O).

Karyotyping

For at verificere, om omprogrammeringsprocessen bevarede kromosomal integritet, blev karyotypeanalyse udført på Genetic Department ofUNIFESP. Celler blev behandlet med 100 ul colchicin (0,08 ug/ml) i 5 ml iPs. cellekulturmedium til at inducere cellecyklusstandsning, som blev efterfulgt af tilsætning af en 0,075 M hypotonisk KCI-opløsning for at inducere nuklear hævelse; celler blev derefter fikseret med en blanding af methanol og eddikesyre (3:1). Metafase-kromosomer blev høstet, og Wright-farvning blev brugt til den cytogene analyse af G-bånd (S3 Fig.).

iPSC (inducerede pluripotente stamceller) kolonikarakterisering

EP-celler blev omprogrammeret af episomale vektorer dannet typiske iPSC (inducerede pluripotente stamceller) kolonier og præsenterede en normal karyotype (S3 Fig.). iPSC-koloniens (inducerede pluripotente stamceller) egenskaber blev sammenlignet med dem for en etableret kontrol afledt af H9-linjecellen (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, tilgængelig fra Wicell Research Institute, USA)( Fig. 1B). Da iPSC'erne (inducerede pluripotente stamceller) præsenterede typisk morfologi, blev pluripotensmarkørerne identificeret ved immunfluorescens. Celler blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter fiksering blev prøverne vasket med PBS tre gange, blokeret i 5 procent PSA og 0,3 procent Triton-X-100/DPBS og inkuberet natten over med primære antistoffer (Cell Signaling, Ma, EUA), nemlig OCT4(1) :400 fortynding) som en test af pluripotens. Den næste dag blev et nyt objektglas forberedt, vasket i PBS og inkuberet med et Alexa Fluor sekundært antistof (1:200 fortynding, cellesignalering), og DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, USA) blev tilføjet til nuklear identifikation.

Fig 1. Generering og karakterisering af iPSC'er(inducerede pluripotente stamceller). iPSC'er blev omprogrammeret fra udvidede erythroid progenitor (EP) celler fra en sund kontrol (HC) og to forskellige ADPKD patienter (PT1 og PT2).

A. Skematisk trinvis frembringelse af nyreorganoider B. Ligheden af ​​iPSC (a. typisk billede af iPSC fra de kommercielle H9 embryonale celler. b. iPSC fra progenitor erythroidceller fra den raske kontrol)

C. Morfologi af iPSC-kolonier D. Karakterisering af iPSC-pluripotens observeret under et EVOS fl inverteret digitalt fluorescensmikroskop.

OCT4-antistofmærkning blev brugt som en pluripotensmarkør til at karakterisere pluripotensnaturen af ​​HC-, PT1- og PT2-kolonierne.

Cellekerner blev mærket med DAPI (skalabjælke for Fig. 1B: 200 μm; skalabjælke for Fig. 1C: 1000 μm; skalabjælke HC / PT2 for Fig. 1D: 1000 μm; skalabjælke PT1 for Fig. 1D: 200μm).

Kapaciteten af ​​iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) til at differentiere til alle tre kimlag

iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) blev dyrket i 6-brøndsplader belagt med Matrigel (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) i mTeSR1-kulturmedium (Stem Cell Technologies, BC, Canada). For at forhindre iPSC'erne (inducerede pluripotente stamceller) i at differentiere, blev kolonierne passeret manuelt ved mekanisk fragmentering med en pipettespids under et mikroskop, eller de blev dissocieret ved enzymatisk fordøjelse ved hjælp af Gentle Cell (Life Technologies) (S4 Fig.). Ved at bruge disse metoder blev iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) opretholdt i 22 serielle passager for at sikre, at cellerne korrekt inkorporerede omprogrammeringsfaktorerne. iPSC'erne (inducerede pluripotente stamceller) blev derefter stimuleret til at differentiere i de tre kimlag ved hjælp af et STEMdiff Trilineage Differentiation kit (Stem Cell Technologies). Efter fem dage blev celler høstet til analyse af linje-aldersspecifikke markører for mesoderm og endoderm, og efter syv dage blev de analyseret for ektoderm i henhold til STEMdiff Trilineage Differentiation-protokollen (S5 Fig).

Molekylær karakterisering af alle tre kimlinjer ved qRT-PCR

Total RNA fra kulturer af de tre kimlag blev ekstraheret ved hjælp af et GE RNA Spin Mini-kit (GE Healthcare, USA) og derefter konverteret til cDNA ved hjælp af et High Capacity Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA) i henhold til producentens instruktioner. Kvantitativ realtids-PCR(gRT-PCR) blev udført under anvendelse af et SYBR Green PCR-kit (Applied Biosystems, USA) i henhold til producentens protokol. mRNA-ekspressionsniveauer blev beregnet ved hjælp af 2^Ct-metoden. Hydroxymethylbilansyntase (HMBS) og glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) blev brugt som interne kontroller, og ekspressionen af ​​OCT4 blev brugt som en kvantitativ kontrol. Ekspressionen af ​​SOX17 blev brugt til at identificere differentiering til endoderm, CXCR4 blev brugt til at identificere differentiering til mesoderm, og PAX6 blev brugt til at identificere differentiering til ektoderm (S6 Fig.). Alle primersekvenser er specificeret i S1-tabel, og effektivitetskurven blev evalueret for hvert primerpar.

Immunfluorescens for de forskellige kimlag

iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) blev induceret til at differentiere på dækglas i plader med seks brønde. Efter differentiering blev dækglasset fjernet fra de originale brønde og overført til en ny plade, hvor cellerne blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd og derefter vasket med PBS, som beskrevet ovenfor. Der blev anvendt primære antistoffer mod OCT4(1:400; Cellesignalering),CXCR4(1;100;Cellesignalering),PAX6(1:100;Thermo Fisher) og SOX17 (1:100;R&D-systemer). Fluorescens blev vurderet vha. et Alexa Fluor sekundært antistof (1:200; Cellesignalering).

Nyreorganoid differentiering fra iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller)

Renalorganoider blev genereret ved at følge protokollen beskrevet af Cruz et al. [6] med nogle tilpasninger. Kort fortalt blev 50,000 iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) fra HC- og to ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) brugt til at producere suspensioner af enkeltceller med Accutase-løsning (Stem Cell Technologies). Enkeltceller blev suppleret med 10 uM Rho-kinaseinhibitor (Y27632, Stem Cell Technologies eller Stemgent). Efter 16 timer blev dyrkningsmediet erstattet med 1 ml mTeSR1 plus 2,5 procent Matrigel plus 10 μuM Y27632. Efter 20 timer blev mediet kun erstattet med 1 ml mTeSRI; 14 timer senere blev dyrkningsmediet udskiftet, og celler blev induceret med 6 uM CHIR99021 (AT104; Stamcelle eller Stemgent GSK-3b hæmmer/Wnt pathway agonist) plus Advanced RPMI (Thermo Fisher) plus Glutamax(Life Technologies) plus 10 ug/ml antibiotikum (Ampicillin; 1:1000; Gibco ). Til sidst, 36 timer senere, blev dyrkningsmediet erstattet med DRB-medium indeholdende Advanced RPMI(Thermo Fischer) plus Glutamax(Thermo Fischer) plus B27 Supplement (17504-044; Life Technologies) plus antibiotika. DRB-mediet blev skiftet hver tredje dag i 28 dage. Denne periode (28 dage) var nok til at organoiderne kunne ses ved mikroskopi.

Molekylær karakterisering af organoider ved RT-PCR

Semi-kvantitativ genekspression blev evalueret ved RT-PCR under den embryogene proces, hvor totalt RNA blev oprenset fra cellestrukturerne dannet på dagene 0(iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller)) og ved 14, 21, 28 og 35 dage efter differentieringsinduktion. Ekspressionen af ​​WT1 (nyre under udvikling), AQP1 (proksimalt rør) og ECAD (cysteepitelmarkør) blev evalueret. GAPDH blev brugt som en intern kontrol. Udtrykket af OCT4 blev brugt som en kvantitativ standard.

Resultater

At opnå iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) fra erythroide stamceller (EP'er)

Den anvendte protokol til at opnå nyreorganoider fra erythroide progenitorer er opsummeret. EPs ekspansion resulterede i 1x10 graders celler efter ca. 20 dage (S2A Fig), og ca. to måneder senere blev EP'er identificeret ved deres ekspression af markørerne CD71 og Gly A. Effektiviteten af ​​separationsmetoden afslørede ekspression; 88 procent af cellerne var CD71-positive, og 57,4 procent var Gly A-positive (S2BFig).

Efter at have verificeret, at cellerne var EP'er, blev de transficeret med omprogrammeringsfaktorer (okt-4, Sox2, Lin28, L-Myc og klf4) og blev derefter opretholdt i et specifikt medium til omprogrammering (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) i cirka fem dage. iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) udviklede typiske cellulære egenskaber ved at danne kolonier med en morfologi, der adskiller sig fra den af ​​ikke-omprogrammerede celler, der er til stede i den samme cellekultur. Celler blev overvåget, indtil vi observerede typiske iPSC (inducerede pluripotente stamceller)-lignende kolonier, der lignede kolonierne af kommerciel H9 cellelinje (Eig 1B). iPSC (inducerede pluripotente stamceller) kolonier blev også genkendt af deres relativt større størrelse, tæt cellepakning, veldefineret homogen form og regelmæssige kanter. Identifikation blev lettet af den lave grad af koloniovervækst fra differentierede celler i et feeder-frit omprogrammeringsmedium (Eig 1C). Der blev ikke fundet nogen påviselige forskelle blandt iPSC-kolonier fra HC- og ADPKD-patienter (Autosomal dominant polycystisk nyresygdom) (PTl og PT2) med hensyn til kolonimorfologi og pluripotensmarkører, som vist i fig. 1D.

iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) blev yderligere karakteriseret ved deres evne til at differentiere i de tre kimlag. Typiske billeder af progressionen af ​​kimlagsudvikling i celler fra HC er vist i S5 Fig. Udvikling af de tre kimlag blev verificeret ved typisk morfologi (Eig 2A) og ved immunfluorescensmærkning for differentieringsmarkører, nemlig FOXA2 for endo-derm , glatmuskelaktin(SMA) for mesoderm og SOX2 for ectoderm(Eig2B-2D). Negative kontroller for antistofferne er vist i S7. Fig. 2E viser genekspressionsniveauerne for specifikke markører for endoderm (SOX17), mesoderm (CXCR4) og ectoderm (PAX6), som påvist ved RT-PCR.

Fig 2. Karakterisering af de tre kimlag. Sund kontrol (HC) og ADPKD1 patienter (PT1 og PT2).

A. Typisk morfologi af de tre kimlag. Kimlag blev karakteriseret ved immunfluorescensfarvning under anvendelse af specifikke antistoffer. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mesoderm (SMA) og D. Ectoderm (SOX2). Cellekerner blev farvet med DAPI. De sidste kolonner viser flettede billeder.

E. Genekspression af OCT4 indikerer pluripotens af iPSC'er, SOX17 var en markør for endoderm, CXCR4 var en markør for mesoderm og PAX6 var en markør for ektoderm (n=2).

OCT4-ekspression af iPSC'er blev brugt som en intern kvantitativ kontrol. OCT4-ekspression var ikke-detekterbar i celler i de tre kimlag (skala: 200 μm).

Generering af nyreorganoider fra iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller)

Tredimensionelle nyrestrukturer blev genereret fra iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) afledt af HC og begge ADPKD-patienter (Autosomal dominant polycystisk nyresygdom) efter trin, der rekapitulerer embryonal udvikling. Fig. 3 viser de trin, der er nødvendige for at opnå de respektive embryonale strukturer. iPSC (inducerede pluripotente stamceller) kolonier (Eig 3A) blev dissocieret med Accutase (Fig. 3B) for at opnå enkelte iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) (Fig3C). I betragtning af den normale embryogene proces, ville kolonierne forventes at differentiere til en blastula og derefter en gastrula, men den spontane differentiering af iPSC'er (inducerede pluripotente stamceller) i kultur er stadig en udfordring, da celler spontant gennemgår apoptose [16]. For at omgå dette uønskede resultat blev en ROCK-inhibitor af signalering (10μM Rho-kinase-hæmmer Y27632) tilsat 16 timer efter enkeltcellestadiet. Hæmning af ROCK-vejen forhindrer celler i at udløse dødsvejene, hvilket giver dem mulighed for at overleve og tilpasse sig til at fortsætte mod differentieringsprocessen. iPSC'erne (inducerede pluripotente stamceller) voksede derefter, indtil de nåede epiblaststadiet, som er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​sfæroide hulrum (fig 3D). Dernæst blev en potent GSK-3b-hæmmer/Wnt-vejagonist (CHIR99021) tilføjet, som blev efterfulgt af tilsætning af DRB-medium for at inducere epitel-mesenchymal overgang (Fig. 3E og 3E) og til sidst mesenkym-epitelovergang( fig. 3G); disse trin muliggjorde epitelisering og sekventiel dannelse af præ-tubulære aggregater og nyrevesikler (Eig 3H), hvilket i sidste ende muliggjorde dannelsen af ​​renale tubulære organoider (fig. 3D). Alle disse in vitro embryogenesetrin var ens for celler afledt fra både HC- og ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom).

Tilstedeværelsen af ​​rørformede strukturer blev verificeret ved ekspression af specifikke markører ved immunofluorescens: NHE3 og AQP1 for proksimale tubuli (Eig4A) og NPHS2 for glomeruli (Eig 4B). I modsætning hertil blev AQP2-mærkning ikke påvist (Eig 4B), hvilket bekræfter, at dette metodologien tillod kun udviklingen af ​​den metanephric masse, men ikke af den ureteriske knop. Markøren ECAD blev ikke påvist i fravær af forskolin (fig. 4B).

For at verificere tilstedeværelsen af ​​specifikke markører udtrykt gennem hele processen med progenitor nyreudvikling, blev alle prøver (HC, PT1 og PT2) indsamlet på fem punkter af hele differentieringsprocessen: dag 0(iPSCs (induceret pluripotent stamme) celler)), dag 14, 21, 28 og derefter på dag 35 (7 dage efter cyste-induktion). Tidsforløbet for genekspression afslørede differentiering under embryogeneseprocessen, som vist i Fig. 5A-5C. Pluripotensmarkøren OCT4 blev udtrykt af iPSC'er (dag O), men dens niveauer blev reduceret over 14 dage og nåede meget lave niveauer efter differentiering. I modsætning hertil steg ekspressionen af ​​de specifikke markører for metanephric mesenchyme (WT1) og proximal tubuli (AQP1) progressivt, når differentieringsprocessen blev påbegyndt på dag 14 og nåede et plateau på dag 21. Fig. 5D viser ekspressionen af ​​ECAD, en cystogenese markør, på dag 35, dvs. 7 dage efter cyste-induktion med forskolin. I fravær af forskolin var ekspressionen af ​​ECAD meget lav, selv hos ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). Men når forskolin blev tilføjet (dag 28), udviste begge patienter øget ECAD-ekspression; men det samme mønster blev ikke observeret i HC organoid, som forblev med lave niveauer af ECAD-ekspression selv i nærvær af forskolin.

Tilstedeværelsen af ​​cyster dannet fra organoiderne stimuleret med forskolin var tydelig for ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom), som vist i Eig6. Det øverste panel viser billeder af organoiderne på dag 28 før tilsætning af forskolin (Eig6Aa). forskolin, der viser tilstedeværelsen af ​​cyste-lignende strukturer i prøver fra begge patienter (PT1 og PT2), men ikke i HC-prøven. Tilstedeværelsen af ​​cyster blev også verificeret ved immunfluorescensfarvning (fig. 6B). ECAD-mærkning blev ikke påvist i HC-organoidet, men det blev tydeligt observeret i organoiderne fra begge patienter. Interessant nok kan tilstedeværelsen af ​​en cyste lumen også observeres.

Fig 3. Generering af rørformede organoider.

Fasekontrastbilleder af genereringen af ​​epitelrørformede nyreorganoider efter 28 dage fra iPSC'er genereret fra HC-, PT1- og PT2-grupperne. I de første 36 timer blev iPSC'erne opretholdt i 3D-kultur.

Derefter blev de dissocieret, transformeret til enkeltceller og behandlet med Y-27632, som tillod cellulær reorganisering og overlevelse, hvilket producerede epiblast-sfæroider (d).

Derefter blev CHIR99201 og DRB tilføjet, hvilket aktiverede Wnt/-catenin-vejen og tillod differentiering til rørformede organoider (I).

Morfologien blandt sfæroider afledt af ADPKD-patienter og fra en HC-donor er ens. (Skalabjælke for a og f: 1000μm; skalabjælke for b, cd, e, g, h og i: 200μm).

KLIK HER FOR AT DELTAⅡ