Den nuværende status for neurobeskyttelse ved medfødt hjertesygdom, del 2

De mikroskopiske billeder blev derefter udsat for billedberegning ved hjælp af ImageJ-software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signalet for Hsp60 blev ganget med "x".

Hsp60 er et vigtigt proteinmolekyle, der spiller en vigtig biologisk rolle i den menneskelige krop. Forskning i de senere år har vist, at tilstedeværelsen af ​​Hsp60 er tæt forbundet med menneskets hukommelse.

Hsp60 er et molekylært chaperonprotein, der hovedsageligt er involveret i proteinfoldning, udfoldning, stabilisering og nedbrydning. Disse processer er meget vigtige for normal metabolisme og cellulær funktion af den menneskelige krop. Samtidig har Hsp60 også antioxidant-, anti-inflammatoriske og immunmodulerende virkninger og spiller en stor rolle i at opretholde menneskers sundhed og balancen i immunsystemet.

Forskning har fundet ud af, at Hsp60 spiller en afgørende rolle i hukommelsesdannelse og vedligeholdelse. Under processen med indlæring og hukommelse producerer hjerneceller et stort antal Hsp60-molekyler. Disse molekyler kan beskytte celler mod interferens og skader fra det ydre miljø for at sikre en jævn fremgang af indlæring og hukommelse. Derudover kan Hsp60 også påvirke menneskelig tænkning og adfærd ved at ændre signaltransduktionen af ​​hjerneceller og udviklingen af ​​neuroner og har en positiv indflydelse på kognition og stressresistens.

Selvom Hsp60's rolle har vist positive virkninger på den menneskelige krop, skal folk også indse, at både overskud og mangel på Hsp60 kan have negative virkninger på menneskers sundhed. Derfor bør vi aktivt udforske og studere mekanismen for Hsp60 i forskellige fysiologiske og patologiske tilstande i den menneskelige krop for bedre at forstå Hsp60's position og rolle i menneskers sundhed. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola har antioxidant-, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter, som kan hjælpe med at reducere oxidation og inflammatoriske reaktioner i hjernen og derved beskytte nervesystemets sundhed. Derudover kan Cistanche deserticola også fremme vækst og reparation af nerveceller og derved forbedre forbindelsen og funktionen af ​​neurale netværk. Disse effekter kan hjælpe med at forbedre hukommelsen, indlæringsevnen og tænkehastigheden og kan også forhindre udviklingen af ​​kognitiv dysfunktion og neurodegenerative sygdomme.

Klik på Kend for at forbedre korttidshukommelsen

"x"-værdien blev bestemt som følger: subtrahering af det "x"-foldede Hsp60-signal fra mitokondrie-DNA-signalet i kontrolgruppen gjorde, at mitokondrie-DNA-værdien var mindre end eller lig med nul. Signalet fra histon H2B blev multipliceret med "y".

"y"-værdien blev bestemt som følger: subtrahering af det "y"-foldede histon-H2B-signal fra nuklear-DNA-signalet i kontrolgruppen gjorde, at nuklear-DNA-værdien var mindre end eller lig med nul. Hvis baggrundssignalet bliver højt fra multiplikationen, kan kontrasten af ​​det multiplicerede billede justeres til de samme forhold i alle prøverne.

Billedet af dsDNA-farvning, minus det justerede billede af multipliceret Hsp60 og histon H2B, blev brugt til efterfølgende analyse. Ved at bruge funktionen "Adjust-Threshold" blev disse billeder binariseret. Vi valgte dsDNA-puncta i størrelse fra 2 til 2 0 µm2 (cirkularitet 0,1-1,0), og de blev talt ved hjælp af funktionen "Analyse-analysere partikler".

2.3. Elektronmikroskopi

En dag før transfektion blev HeLa-celler udpladet med en tæthed på 600 celler/µL. Ekspressionen af ​​gener af interesse blev dæmpet i HeLa-celler ved hjælp af Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) i Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) ifølge producentens instruktioner (med en endelig RNA-koncentration på 10 nM).

Fire dage efter siRNA knockdown blev cellerne udsat for fiksering. Cellekulturprøver blev fikseret med 2 % PFA og 2 % glutaraldehyd i 0.1 M phosphatbuffer, pH 7,4, ved 37 ◦C og derefter anbragt i en 4 ◦C køleskab i 30 min. Prøverne blev fikseret i 2 % glutaraldehyd i 0,1 M phosphatbuffer natten over ved 4 ◦C. Prøverne blev vasket tre gange med 0,1 M phosphatbuffer i 30 minutter og efterfikseret med 2% osmiumtetroxid i 0,1 M phosphatbuffer ved 4 ◦C i 1 time.

Prøverne blev dehydrerede ingraderede ethanolopløsninger, overført til harpiks (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japan) og polymeriseret ved 60 ◦C i 48 timer. De polymeriserede harpikser blev skåret i ultratynde 70-nmsektioner med en diamantkniv ved hjælp af en ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og blev derefter monteret på kobbergitre.

Sektionerne blev farvet med 2% uranylacetat ved stuetemperatur i 15 minutter og vasket med destilleret vand, efterfulgt af sekundær farvning med en blyfarvningsopløsning (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) ved stuetemperatur i 3 minutter.

Gitteret blev observeret under et transmissionselektronmikroskop (JEM-1400Plus, JEOL Ltd.., Tokyo, Japan) ved en accelerationsspænding på 80 kV (zebrafisk-hjerne) eller 100 kV (celle), og billeder blev optaget ved hjælp af et charge-coupled-device (CCD)-kamera (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Immunelektronmikroskopi

Prøverne på guldskiverne blev frosset i flydende propan ved -175 ◦C. Efter at prøverne var frosset, blev de fryse-substitueret med 1% garvesyre i ethanol og 2% destilleret vand ved -80 ◦C i 24 timer.

Prøverne blev derefter holdt ved -20 ◦C i 4 timer, efterfulgt af inkubation ved 4 ◦C i 1 time. Derefter blev prøverne dehydreret i vandfri ethanol 3 gange i 30 min. hver gang, efterfulgt af infiltration med en 50:50 blanding af ethanol og harpiks (LR hvid: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) ved 4 ◦C i 1 time. Prøverne blev overført til frisk 100 % harpiks og inkuberet ved 4 ◦C i 30 minutter, og denne proces blev gentaget tre gange.

Prøverne blev overført til frisk 100% harpiks og blev polymeriseret ved 50 ◦ CO/N. De polymeriserede harpikser blev skåret i ultratynde snit ved 90 nm med en diamantkniv ved anvendelse af en ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica), og sektionerne blev anbragt på nikkelgitre. Gitterne blev inkuberet med anti-dsDNA-antistof (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) i 1 % BSA/PBS ved 4 ◦CO/N, efterfulgt af tre skylninger med 1 % BSA/PBS i 1 minut hver.

De blev efterfølgende inkuberet med dette sekundære antistof konjugeret til {{0}}nm guldpartikler (ged anti-mus IgG polyklonalantistof) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter skylning med PBS blev gitrene anbragt i 2% glutaraldehydein 0,1 M cacodylatbuffer.

Bagefter blev gitrene tørret og derefter farvet med 2% uranylacetat i 15 minutter og med en blyfarvningsopløsning (Sigma-Aldrich) ved stuetemperatur i 3 minutter. Gitrene blev observeret gennem et transmissionselektronmikroskop (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) ved en accelerationsspænding på 100 kV. Digitale billeder blev taget med et CCD-kamera (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Resultater

3.1. Nedsat TFAM eller GBA inducerer en stigning i ektopisk mitokondrielt DNA

Først viste vi et eksempel på påvisning af mitokondrier-afledt cytoplasmatisk DNA i HeLa-celler, hvori TFAM-proteinet blev slået ned af siRNA (figur 1A). .

Sekvenspolymorfismer i dette gen rapporteres at være forbundet med Parkinsons sygdom [21,22]. Efter 3 dage med TFAM-proteinknockdown blev en masse dobbeltstrengede DNA-prikker påvist i HeLa-cellernes cytoplasma.

Histoner er positive markører for kerne-oprindelses-DNA i cytoplasmaet og negative markører for mitokondrielt DNA og mitokondrielt-DNA i cytoplasmaet [23]. Disse prikker co-lokaliserede ikke med histoner, hvilket tyder på, at de ikke var kerne-afledt DNA. Desuden co-lokaliserede nogle af disse cytoplasmatiske, ektopiske DNA-prikker ikke med Hsp60, en markør for mitokondriematrixen, hvilket indikerer, at de befandt sig uden for mitokondrierne (figur 1B, C).

Elektronmikroskopi viste også, at det ektopiske DNA lækkede fra mitokondrierne (figur 2A, B). Sammenfattende skyldtes stigningen i ektopiske DNA-prikker i cytoplasmaet ved TFAM-knockdown, at mitokondrielt DNA lækker fra mitokondrierne. For det andet viste vi et andet eksempel på påvisning af mitokondrier-afledt cytoplasmatisk DNA i HeLa-celler, hvor GBA-protein blev slået ned af siRNA (Figur 1A).

GBA er det forårsagende gen for Gauchers sygdom, men en heterozygot mutation af GBA er også en risikofaktor for Parkinsons sygdom [24]. En masse dobbeltstrengede DNA-prikker blev påvist i HeLa-cellernes cytoplasma efter 3 dages GBA-protein knockdown. Nogle DNA-punkter blev co-lokaliseret med histoner, hvilket tyder på, at de var nuklear-afledt DNA.

Andre DNA-prikker blev ikke co-lokaliseret med histoner, hvilket tyder på, at de ikke var nuklear-afledt DNA, men mitokondrier-afledt DNA (figur 1D). Sammenfattende skyldtes stigningen i ektopiske DNA-prikker i cytoplasmaet ved GBA-knockdown i det mindste delvist mitokondrielt DNA, der lækker fra mitokondrierne.

For more information:1950477648nn@gmail.com