Fordelene ved acteosid - behandle glioblastom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

TAE WOONG HWANG;DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN‑HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA-JIN KIM

1. Introduktion

Glioblastomer den mest almindelige type malign primær hjernetumor og den mest invasive og ødelæggende primære hjernetumor (1,2), med en median overlevelsesrate på ~18 måneder med aggressiv multimodalitetsterapi. De nuværende behandlingsbeslutninger er begrænsede og omfatter stråling, kemoterapi og kirurgi i kombination med alkyleringsmidlet temozolomid (TMZ) (3,4). På trods af tilgængeligheden af ​​aggressive terapier, patienter medglioblastomgenerelt har en dårlig prognose (5). TMZ er det vigtigste kemoterapeutiske lægemiddel, der anvendes i den kliniske behandling af maligneglioblastom(6-8); som et alkyleringsmiddel i serien er det i stand til at trænge igennem blod-hjerne-barrieren (9-11). Under malignt glioblastom-progression og omfattende invasion i hele hjernen, nedsætter støt stigende lægemiddelresistens over for TMZ dets terapeutiske effekt (12,13). Derfor nye terapeutiske lægemidler til at modvirkeglioblastomsøges akut.

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at gliomceller gennemgår celledød via autofagi eller type II programmeret celledød som reaktion på TMZ (14,15). Autofagi kan hæmmes af 3-methyladenin (3-MA) ​​gennem omdannelsen af ​​mikrotubuli-associeret protein 1 let kæde 3 (LC3)-I til LC3-II, hvilket reducererglioblastomcelledød (16,17); rollen som autofagi er imidlertid afhængig af den cellulære kontekst. Med undtagelse af en cytotoksisk rolle under TMZ-virkning er induktionen af ​​autofagi ved cellulær stress en cytobeskyttende proces, der eliminerer stress-inducerede cytoplasmatiske aggregater, organeller og makromolekyler i pattedyrsceller gennem det lysosomale system. Til gengæld modtager celler involveret i at opretholde homeostase energi gennem disse kataboliske processer (18,19). De komplekse roller af autofagi tyder på, at en autofagi-aktivator kan have anticancer-effekter i kombination med TMZ-behandling ved at inducereglioblastomcelleautofagi uden at udøve skadelige virkninger eller give fordele for normalt væv. Det skal bemærkes, at TMZ har udvist synergistiske terapeutiske effekter i kombination med D-vitamin, herunder undertrykt cellelevedygtighed og forbedret autofagi iglioblastomceller. Desuden har kombinationen af ​​TMZ og D-vitamin vist sig at udøve anticancer-effekter in vivo, herunder reduceret tumorstørrelse og forlænget overlevelsesrate. Disse undersøgelser tyder på, at kombinationsbehandling kan have synergistiske anticancer-effekter via autofagiske mekanismer i TMZ-baseretglioblastomterapi (15).

Acteosider et phenylethanoid glycosid, der er vidt udbredt i flere tonificerende traditionelle kinesiske naturlægemidler (20,21). En række farmakologiske virkninger, herunder antioxidanter, anticancer, antiinflammatoriske, antinefritiske og antimetastatiske virkninger, er blevet forbundet medakteosid(22-24). Det har tidligere undersøgelser vistakteosidhar beskyttende virkning mod carbontetrachlorid- og D-galactosamin-induceret leverskade. De mekanismer, der ligger til grund for de beskyttende virkninger af acteoside, er sandsynligvis relateret til dets evne til at hæmme P450-medieret bioaktivering og frie radikaler-fjernende effekter induceret af kulstoftetrachlorid eksponering (25,26).

Derfor tyder beviser på, at begge deleakteosidog TMZ inducerer anticancer-effekter gennem celledød. Dog deres association og anticancer virkninger i forbindelse medglioblastommangler at blive belyst. Derfor var formålet med denne undersøgelse at verificere de synergistiske anticancer-effekter afakteosidkombineret med TMZ inglioblastomterapi. En cellelevedygtighedsanalyse blev udført for at analysere anticancervirkningerne af kombinationsbehandlingen i C6glioblastomceller (en rotteglioblastomcellelinje), og resultaterne blev sammenlignet med dem efter behandling med TMZ alene. For yderligere at undersøge mekanismen for celledød forårsaget af samtidig behandling medakteosidog TMZ, apoptose og autofagi-relaterede gener i C6-celler blev undersøgt.

acteosid anti-tumor

2. Materialer og metoder

Cellekultur:

C6 rottenglioblastomcellelinje blev købt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Cellerne blev dyrket under sterile forhold ved 37˚C i et fugtigt miljø med 5 procent CO2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS) og 1 procent antibiotika og antimykotika (alle Welgene, Daegu) , Korea).

Plantemateriale:

Abeliophyllum distichum Nakai [voucher no. Park1001(ANH)] blev indsamlet i Misun-hyang Theme Park, Seongbul-Mountain Recreation Forest, Korea.

Callus induktion:

For at inducere callusdannelse (27) blev 1-cm2 bladeksplantater isoleret fra de friske planter. Eksplantatet blev dyrket på Murachige- og Skoog-medium (4 procent saccharose, 0,9 procent agar suppleret med 1 mg/l naphthaleneddikesyre og 1 mg/l 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre, pH 5,7) ved 25˚C. Kallusen blev induceret 20 dage senere. En tilstrækkelig mængde afakteosidblev opnået gennem subkultur for at adskille og oprenseakteosidfra callus (fig. 1). Forskellige partier af rensetakteosidblev brugt i hvert forsøg. Hvert eksperiment blev udført tre gange under anvendelse af en anden batch.

Isolering og rensning:

Ethylacetatfraktionerne blev koncentreret i vakuum og anvendt som en prøve til oprensning af acteosid.Acteosidblev isoleret og oprenset af Accelerated Chromatography Isolation-systemet (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Sverige) ved hjælp af SNAP KPHOSPHO-SIL og SNAP Ultra Cartridges (Biotage). Detakteosidoprenset fra callus blev kvantitativt analyseret under anvendelse af standardacteosid ved HPLC-PDA-analyse. Endelig blev acteosid af større end eller lig med 95 procent renhed opnået fra callus og brugt som en prøve til kemoterapi af temozolomid-baseretglioblastom.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-l)-,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay:

For at identificere den halvmaksimale TMZ-inhiberende koncentration (IC50-værdi) mod C6-celler, blev 1x104 celler i enkeltcellesuspensioner podet i individuelle brønde på 96-brønds plader og inkuberet i 24 timer ved 37˚C før TMZ-behandling ved den angivne koncentrationer (1, 5, 10 og 20 mM) ved 37˚C i 24 timer. Efter bestemmelsen af ​​TMZ IC50-værdien som 5 mm, blev cellerne behandlet i 24 timer med 5 mM TMZ, 50 µMakteosideller en kombination af de to (5 mM TMZ og 50 µMakteosid). MTT-opløsning (5 mg/ml) blev tilsat til hver brønd (10 µl) og dyrket ved 37˚C i 2 timer. Efterfølgende blev mediet fjernet, og DMSO blev tilsat i et volumen på 200 µl hver og omsat ved stuetemperatur i 30 minutter. Absorbansen ved 595 nm blev målt for at bestemme cellelevedygtighed.

Sårhelingsanalyse:

En C6-cellesuspension i 1 ml blev dyrket i en 12-brønds plade og dyrket til konfluens. Cellerne blev behandlet med TMZ,akteosid, eller TMZ plusakteosidog derefter ridset med en steril 10‑µl pipettespids for at skabe et kunstigt sår. Ved 0 og 24 timer efter sår blev der optaget digitale billeder af sårhelingsprocessen ved hjælp af et omvendt mikroskop. Cellemigration blev kvantificeret ved at måle størrelsen af ​​arret ved 0 og 24 timer ved hjælp af billedanalysesoftwaren ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22-software (NIH, Bethesda, Maryland, USA). Hvert eksperiment blev udført tre gange, og målingerne blev udført i tre eksemplarer.

Immunblotting:

C6-cellerne blev behandlet med TMZ,akteosid, eller TMZ plusakteosidi 24 timer. Celler blev lyseret på is af RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 procent Nonidet P-40, 1 procent natriumdeoxycholat, 0,1 procent SDS) lyseringsbuffer suppleret med protease- og fosfatasehæmmercocktail (Roche, Basel, Schweiz) i 30 min. Efter centrifugering ved 18.341 xgi 15 minutter ved 4°C blev supernatanten opnået. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af Bradford Protein Assays (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Lige store mængder af totale proteiner (30 µg) blev fyldt i enkelte brønde og fraktioneret via elektroforese via en 10-15 procent SDS-PAGE. Proteinerne blev elektrooverført til polyvinylidendifluoridmembraner (EMD Millipore, Bedford, MA, USA). Efter inkubation i blokerende opløsning indeholdende 5 procent fedtfri mælk i Tween/Tris-buffer saltvand i 30 minutter ved stuetemperatur. Blottene blev probet med 1:1,000-fortyndede primære antistoffer (kat. nr. 9662, caspase 3; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), B0-celle lymfom 2 (sc-celle lymfom 2 (sc-celle lymfom 2) 7382, Bcl-2), Bcl-2-associeret X-protein (kat. nr. 2772, Bax), phosphoryleret (p-)p53 (sc-101762), total-p53 (sc-6243), -aktin (kat. nr. 4970; alle; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), LC-3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), Rab7 (kat. nr. 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (kat. nr. 114), p-p38 (kat. nr. 9211), total-p38 (kat. nr. 9212), p-c-Jun N-terminal kinase (kat. nr. 9251, s. -JNK), total-JNK (kat. nr. 9252), p-ekstracellulær signalreguleret kinase (kat. nr. 9101, p-ERK), total-ERK (kat. nr. 9102; all Cell Signaling Technology, Inc. .) natten over ved 4˚C. Dette blev efterfulgt af inkubation med peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer (1:2,000; LF-SA8001A, Goat Anti-Mouse IgG-HRP) eller LF-SA8002A (Goat Anti-Rabbit IgG-AB-HRP), Frontier, Seoul, Korea.) i 2 timer ved stuetemperatur. Proteinerne blev derefter visualiseret ved eksponering for Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, ca., USA).

Immunfluorescensfarvning:

Lysosomal-associeret membranprotein 1 (LAMP1) og LC3 er markører for lysosomal og autofagi. Cellerne (1x105 celler/brønd) blev fremstillet på steriliserede dækglas (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) i tre eksemplarer. Efter behandling med TMZ,akteosid, eller TMZ plusakteosidi 24 timer blev cellerne fikseret i 4 procent paraformaldehyd i 30 minutter, blokeret med 5 procent normalt kyllingeserum (S-3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA), 0,1 procent Triton X ‑100 og derefter inkuberet 1 time til permeabilisering og for at blokere ikke-specifikke protein-protein-interaktioner. Cellerne blev derefter inkuberet med anti-LAMP1 (1:200; sc-19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) og anti-LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, USA) natten over ved 4˚ C. Cellerne blev derefter vasket to gange med PBS og inkuberet i yderligere 2 timer i mørke med en blanding af Alexa Fluor 488 og 594 sekundære antistoffer (1:200; Alexa Fluor 488 (A-11008) og 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) og vasket igen med PBS. Kernerne blev farvet med 4,6-diamidino-2-phenylindol (Sigma; Merck KGaA) og derefter vasket to gange med PBS. Objektglassene blev derefter monteret, og billeder blev optaget under et LSM-700 laserkonfokalmikroskop.

Figur 1. Akteosids kemiske struktur.

Flowcytometri.

Cellerne blev analyseret for Mitotracker Green og MitoSOX ved flowcytometri ved anvendelse af et FACSCanto II flowcytometer, som angivet af producenten (BD Biosciences). Efter to vaske med PBS blev cellerne fikseret i 4 procent paraformaldehyd i 3 0 minutter ved stuetemperatur og permeabiliseret med 0,25 procent Triton X-100 i PBS i 20 minutter. Cellerne blev farvet med primære antistoffer natten over ved 4˚C (1:200) og derefter med sekundære antistoffer i 1 time på is. Efter to vaske med PBS blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd og analyseret med det samme. Flowcytometridataene blev indsamlet ved hjælp af 10,000 celler og blev analyseret ved hjælp af FlowJo 7.6.1-software (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Statistisk analyse:

Alle data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 5.0 og præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdien. Data blev analyseret med en envejs-variansanalyse med Tukeys multiple-comparisons post hoc-test til sammenligning af middelværdier blandt flere grupper. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: Anti-apoptose

3. Resultater

3.1 Samtidig behandling med TMZ og akteosidhæmmerglioblastomcelleproliferation og migration.

Kombineret behandling med TMZ ogakteosidhæmmede levedygtigheden af ​​C6-celler. TMZ reducerede cellelevedygtighed på en dosisafhængig måde (fig. 2A), hvorimod acteosid alene ikke havde nogen signifikant effekt på noget behandlingsniveau (fig. 2B). Efter inkubation i et dyrkningsmedium indeholdende TMZ med eller uden acteosid i 24 timer, blev der udført en MTT-analyse for at sammenligne cytotoksiciteten af ​​forskellige behandlingsniveauer. TMZ undertrykte signifikant cellelevedygtighed, hvorimod acteosid ikke signifikant undertrykte cellevækst. Kombineret behandling med TMZ og acteosid reducerede cellens levedygtighed markant (fig. 2C). Behandling med TMZ eller akteosid påført alene reducerede sårhelingsevnen (fig. 3A). Sårafstanden (procent) blev målt under anvendelse af resultaterne vist i fig. 3A med ImageJ-software. Sårafstanden steg signifikant efter kombinationsbehandling (fig. 3B) sammenlignet med hver enkelt behandling. Disse resultater indikerer, at samtidig behandling med TMZ og acteosid var en effektiv hæmmer afglioblastomcelleproliferation og migration.

3.2 Acteosid og TMZ påvirker apoptose synergistisk i C6-celler.

Resultaterne af western blot-analysen afslørede, at niveauerne af spaltet caspase-3, Bax og phosphoryleret p53 var højere, og niveauerne af Bcl-2 var lavere efter kombinationsbehandling med TMZ ogakteosidend efter behandling med TMZ alene (fig. 4A).Acteosid-medieret mitokondriel funktion og dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), som er nøglemediatorer for apoptotisk signalering, blev derefter observeret i de TMZ-behandlede C6-celler. For at verificere mitokondriel masse blev fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse udført ved hjælp af MitoTracker Green. Sambehandling med TMZ ogakteosidresulterede i en højere mitokondriel masse end behandling med TMZ alene (fig. 4B). ROS-generering var signifikant højere efter samtidig behandling med TMZ og acteosid end behandling med TMZ alene (fig. 4C). Disse resultater tyder på, at ROS-generering og mitokondriefunktion er vigtige i apoptose induceret af behandling med TMZ plus acteosid. Samtidig behandling med TMZ og acteosid inducerer autofagi i C6-celler. TMZ er blevet rapporteret at inducere autofagi (28,29); derfor undersøgte denne undersøgelse i hvilket omfang autofagi blev induceret af TMZ plus acteosidbehandling. C6-cellerne blev behandlet med TMZ med eller uden acteosid; efter 24 timer, og cellerne blev farvet til immunfluorescens for at detektere LAMP1 og LC3 som markører for autofagi. Højere ekspressionsniveauer af LAMP1 og LC3 blev observeret efter kombinationsbehandlingen (fig. 5A). Autophagy-relateret proteinekspression blev også undersøgt, og det blev fundet, at TMZ inducerede omdannelsen af ​​LC3-I til LC3-II, som er en signatur på autophagosomgenerering. En højere omdannelseshastighed af LC3-I til LC3-II blev observeret efter samtidig behandling med TMZ og acteosid end behandling med TMZ alene. Ekspressionsniveauerne for Rab7 og p62 indikerede autofagi-induktion i de TMZ-behandlede celler (fig. 5B). Disse resultater tyder på, at samtidig behandling med TMZ og acteosid forbedrede den autofagiske proces iglioblastomceller.

3.3 Acteosid inducerer MAPK pathway genekspression i TMZ-baseret behandling.

Tidligere undersøgelser har vist, at TMZ regulerer MAPK-vejen, herunder p38, JNK og ERK (30). Derfor undersøgte nærværende undersøgelse evtakteosidpåvirker TMZ-relateret MAPK-genekspression. C6-cellerne blev behandlet med TMZ med eller udenakteosid. Efter 24 timer resulterede TMZ-behandling i højere ekspressionsniveauer af p‑p38, p‑JNK og p‑ERK. Ekspressionen af ​​TMZ-regulerede gener var signifikant højere efter behandling med TMZ plus acteosid end behandling med TMZ alene (fig. 6). Disse observationer tyder på detakteosidpåvirker TMZ-baserede terapeutiske mekanismer via MAPK-vejen.

Acteosid anti-glioblastom

Diskussion

Resultaterne af nærværende undersøgelse fastslår, at den kombinerede behandling med TMZ medakteosidgiver terapeutisk potentiale forglioblastombehandling, og give bevis for, at kemosensibilisering til en kombination af TMZ ogakteosidkan opstå gennem autofagi-forstærkning. Som mutationen afglioblastomceller kan føre til inaktivering af apoptotisk vej, induktion af autofagi af TMZ plusakteosidsambehandling kan repræsentere en alternativ metode tilglioblastomterapi. Men om autofagi er den eneste mekanisme tilglioblastomterapi med TMZ plusakteosidsambehandling mangler at blive belyst.

Autofagi er en væsentlig cellulær mekanisme til nedbrydning af proteiner og cytoplasmatiske organeller. Den katabolske fordel ved induceret autofagi kan være vigtig under stressende forhold; derfor kan induktionen af ​​autofagi være en adaptiv mekanisme til forebyggelse af celledød (31-33). Tidligere undersøgelser har rapporteret, at nedsat autofagi er korreleret med cancer (34-36). Derudover dereguleres adskillige proteiner og signalveje forbundet med autofagi under malign transformation, hvilket resulterer i en reduktion i autofagisk aktivitet. Høje ekspressionsniveauer af LC3 er også blevet forbundet med øgede overlevelsesrater hos patienter medglioblastommed dårlige præstationsscore (37,38). Tilsvarende indikerer resultaterne af nærværende undersøgelse, at genoprettelse af normal autofagi kan være en latent strategi forglioblastomterapi og kan tjene som en mekanisme til begrænsning af unormal tumorcellevækst.

Ved normal autofagi isoleres særlige cytoplasmatiske komponenter i autofagosomer, som derefter smelter sammen med et lysosom, der skal nedbrydes og recirkuleres (39,40). Når autofagi er opreguleret, overgår autophagosomdannelseshastighederne lysosomale nedbrydningshastigheder; denne tilstand kaldes autofagisk stress. Hvis stress eller unormal autofagi fortsætter, kan celledød forekomme via energiudtømning eller ændringer i beclin-1/Bcl-2-balancen. Apoptose kan også udløses af autophagosom hyperaktivitet, der opsluger cytoplasmatiske organeller, herunder mitokondrierne eller endoplasmatisk retikulum (41). Det er blevet foreslået, at generel autofagi kan inducere celledød under normal cytoplasmatisk og organelomsætning i raske celler. I denne proces 'kannibaliserer' cellen sig selv indefra, en nøgleegenskab ved type II programmeret celledød. Selvom de mekanismer, hvormedakteosidforbedrer den terapeutiske effekt af TMZ-baseretglioblastomterapi mangler at blive fuldt belyst, kan de anticancer-effekter, der udvises af den kombinationsbehandling, der er undersøgt i denne undersøgelse, være forbundet med disse autofagiske mekanismer.

Acteosider et phenylethanoid glycosid afledt af planter (22,26). Tidligere undersøgelser har rapporteret om de forskellige biologiske aktiviteter af acteosid. Ændringerne i ekspressionsniveauerne af spaltet caspase-3 og LC3 i denne undersøgelse viser, at behandling med en kombination af TMZ ogakteosidinduceret apoptose og autofagi i C6-celler (fig. 4 og 5). Kombinationsbehandlingen viste sig at have en synergistisk effekt påglioblastomceller. Selvom andre mulige mekanismer for disse synergistiske virkninger stadig mangler at blive belyst, identificerede denne undersøgelse induktionen af ​​autofagi som en afgørende tumoricidal mekanisme forakteosidkemosensibilisering under TMZ-baseretglioblastomterapi.

Acteosid behandler glioblastom

Referencer

1. Friedman HS, Kerby T og Calvert H: Temozolomid og behandling af malignt gliom. Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Mrugala MM og Chamberlain MC: Sygdomsmekanismer: Temozolomid ogglioblastom- se på fremtiden. Nat Clin Pract Oncol 5: 476-486, 2008.

3. Agarwala SS og Kirkwood JM: Temozolomid, et nyt alkyleringsmiddel med aktivitet i centralnervesystemet, kan forbedre behandlingen af ​​fremskreden metastatisk melanom. Onkolog 5: 144-151, 2000.

4. Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E og Newton cG: Antitumorimidazotetraziner. 1. Syntese og kemi af 8-carbamoyl-3-(2-chlorethyl)imidazo[5,1-d]-1,2,3, 5-tetrazin-4(3 H)-on, en ny bredspektret antitumor agent. J Med Chem 27: 196-201, 1984.

5. Fulda S: Celledødsbaseret behandling afglioblastom. Celledød dis 9: 121, 2018.

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ og Chen KC: Den CHAC1-hæmmede Notch3-vej er involveret i temozolomid-induceret gliom cytotoksicitet. Neuropharmacology 116: 300-314, 2017.

7. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, Fukushima T og Inoue T: Effekten af ​​temozolomidbehandling hos patienter med højgradigt gliom. Anticancer Res 29: 911-917, 2009.

8. Van den Bent MJ: Adjuverende behandling af højgradige gliomer. Ann Oncol 17 (Suppl 10): x186-x190, 2006.

9. Shen W, Hu JA og Zheng JS: Mekanisme af temozolomid-inducerede antitumoreffekter på gliomceller. J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10. Barciszewska AM, Gurda D, Głodowicz P, Nowak S og Naskręt-Barciszewska MZ: En ny epigenetisk mekanisme for temozolomidvirkning i gliomceller. PLoS One 10: e0136669, 2015.