Abstrakt

Hudhyperpigmenteringsforstyrrelser, såsom melasma, fregner og post-inflammatorisk hyperpigmentering (PIH), udløses ofte af ultraviolet-B (UVB) stråling, hudskader og lokal hudbetændelse. Overskydende aflejring af melanin forringer hudens udseende og påvirker patientens psykologiske velvære negativt. Konventionelle depigmenteringsmidler, såsom hydroquinon, er primært rettet mod tyrosinase med single-mode virkning og har veldokumenterede sikkerhedsrisici. Multi-target naturlige botaniske blandinger er dukket op som lovende alternativer til moderne funktionel kosmetisk formulering.

Phenylethanoid glycosider (PhG'er) er signatur bioaktive bestanddele isoleret fraCistanche deserticola, en velkendt lægeurt fra tørre ørkenområder. Glabridin (Gla), en prenyleret isoflavan udvundet afGlycyrrhiza glabra, er bredt anerkendt som en højpotens, hudoplysende naturlig forbindelse. Denne forskning undersøgte systematisk den synergistiske anti-hyperpigmenteringsydelse af PhG'er kombineret med glabridin. In vitro biokemiske assays inklusive tyrosinaseinhibering, DPPH og ABTS⁺ fri-radikal-fjernende test blev anvendt til foreløbig masseforholdsscreening. Tre cellulære modeller blev yderligere konstrueret: UVB-bestrålet B16F10 musemelanomcellepigmenteringsmodel; lipopolysaccharid (LPS)-stimuleret HaCaT keratinocyt inflammatorisk model; AAPH-induceret HaCaT oxidativ-stress-model. Indikatorer, der dækker intracellulær tyrosinaseaktivitet, melaninindhold, pro-inflammatorisk cytokinfrigivelse (IL-6, TNF-), superoxiddismutase (SOD) og katalase (CAT) enzymaktivitet blev kvantificeret. Beregning af kombinationsindeks (CI) blev implementeret for at kvantitativt identificere synergistisk interaktion mellem de to botaniske ekstrakter.

Blandt testede proportioner udviste masseforhold m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 og 10:1 fremtrædende tyrosinase-undertrykkende og antioxidantsynergi. Ved en total koncentration på 0,4 g/l i pH 6,8 phosphatbufret saltvand (PBS) nåede tyrosinaseinhiberingsraterne 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) og 88,06 % (10:1). De tilsvarende DPPH-radikalopfangende procenter var 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; ABTS⁺-kation-radikal-fjernende kapaciteter nåede 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Ved arbejdskoncentration 25 ug/ml udviste alle tre sammensætningsformuleringer ingen signifikant cytotoksicitet over for B16F10- og HaCaT-cellelinjer. Den 1:1 blandede gruppe genererede overlegen omfattende effektivitet: resterende intracellulær tyrosinaseaktivitet faldt til 23,80 %, det relative melaninindhold faldt til 30,90 %. Desuden udøvede PhGs/Gla (1:1) den stærkeste undertrykkelse af IL-6 og TNF-sekretion og genoprettede maksimalt SOD og CAT antioxidant enzymaktivitet. Eksperimentelle resultater bekræftede, at PhG'er parret med glabridin opnår synergistiske anti-hyperpigmenteringsresultater gennem tredobbelte veje: hæmning af melaninbiosyntese, dæmpning af hudbetændelse og modvirkning af oxidativt stress. Masseforholdet 1:1 giver optimal integreret biologisk ydeevne. Denne undersøgelse giver eksperimentel dokumentation, der understøtter anvendelsen afCistanchephenylethanoid glycosider-glabridin kompositmaterialer i ren-skønhed, plante-afledt blegende hudpleje råmateriale udvikling.

Nøgleord: Cistanche deserticolaphenylethanoid glycosider; glabridin; synergistisk effekt; anti-hyperpigmentering; antioxidant; anti-inflammation; kosmetiske botaniske råvarer

1. Introduktion

Overdreven melaninophobning i epidermale lag resulterer i heterogene hudpigmenteringsfænotyper, herunder melasma, ephelider og postinflammatorisk hyperpigmentering (PIH) Google for.... Flere ydre og iboende drivende faktorer bidrager til patologisk overproduktion af melanin. UVB ultraviolet bestråling repræsenterer den primære miljømæssige trigger; hudtraume og kroniske lokale inflammatoriske reaktioner forstærker pigmentforstyrrelser yderligere. Det er veletableret, at krydstale mellem epidermale keratinocytter og melanocytter dominerer pigmentprogression. Ved ekstern stimulering frigiver aktiverede keratinocytter reaktive oxygenarter (ROS) og pro-inflammatoriske mediatorer. Disse signalmolekyler diffunderer og virker på tilstødende melanocytter, opregulerer tyrosinase-katalytisk aktivitet, accelererer melaninsyntese og fremmer melanosomtransport mod keratinocytter og producerer endelig synlige pigmenterede læsioner på hudoverfladen. Følgelig kan effektiv indgriben til hyperpigmentering ikke blot fokusere på tyrosinaseinhibering. Multimodale terapeutiske strategier bør samtidig dække melanogenesehæmning, anti-inflammatorisk intervention og neutralisering af oxidativ stress.

Traditionelle syntetiske hudlysende aktive stoffer såsom hydroquinon leverer depigmenterende effekt hovedsageligt ved direkte undertrykkelse af tyrosinase. Ikke desto mindre begrænser enkeltmålsmekanismer den praktiske ydeevne, og langsigtet topisk hydroquinonpåføring kan udløse hudirritation, kontaktdermatitis og potentielle sikkerhedsrisici, hvilket begrænser anvendelsesområdet for kosmetisk kvalitet. Naturlige planteafledte bioingredienser tiltrækker voksende interesse fra kosmetikproducenter og forbrugere for deres milde profiler og multi-path farmakologiske virkninger. Sammensatte blandinger af forskellige botaniske ekstrakter er i stand til at producere synergistiske biologiske effekter, øge den samlede effektivitet og samtidig sænke effektive doseringskrav, hvilket åbner nye tekniske retninger for anti-pigmentering af kosmetisk-råmaterialeforskningGoogle

Cistanche deserticola, almindeligvis kaldet "ørkenginseng", er en klassisk tonic urt i traditionel kinesisk medicin. Moderne fytokemiske undersøgelser afslører, at phenylethanoidglycosider (PhG'er) udgør dens vigtigste farmakologisk aktive fraktion, med echinacosid og acteosid som repræsentative forbindelser. Udgivet farmakologisk forskning viser, at PhG'er har robust antioxidantkapacitet, anti-inflammatorisk bioaktivitet og moderat tyrosinaseinhiberende potentiale, hvilket indebærer prospektive anvendelsesmuligheder i dermatologiske hudplejematerialer. Glabridin er en karakteristisk isoflavonoid forbindelse isoleret fraGlycyrrhiza glabrarod, velkendt inden for kosmetikindustrien som "blegning af guld". Det undertrykker kraftigt melanogenese og modulerer samtidig kutane inflammatoriske kaskader. Fra traditionel medicinteoretisk perspektiv,Cistanchenærer nyreessens og tonificerer yang, mens lakridsrødder styrker milten og renser varme-toksin. Kombineret anvendelse er i overensstemmelse med sammensatte kompatibilitetsprincipper for urte dermatologiske terapier.

Mekanistisk hypotese hævder, at PhGs-glabridin kombination kan regulere hudpigmentering via multi-target og multi-path modes: fælles hæmning af tyrosinase katalytisk funktion for at afskære melanin generation oprindelse; dæmpning af opbygning af reaktive iltarter; begrænsning af overfrigivelse af pro-inflammatorisk faktor for at afbryde ROS- og cytokin-medieret signalforstærkning til melanocytaktivering. Til dato har få forskningsartikler systematisk rapporteret synergistisk anti-hyperpigmenteringsevaluering for denne binære blanding.

Dette papir har til formål at udforske kombinatoriske biologiske effekter mellemCistanchephenylethanoid glycosider og glabridin. Biokemisk in-vitro-enzymhæmning og radikal-fjernende screeningseksperimenter blev implementeret først. Tre repræsentative cellemodeller, der efterligner pigmentaflejring, hudbetændelse og oxidativ skade, blev konstrueret til multidimensionel effektivitetsvurdering. Kombinationsindeksmetodologi blev anvendt til at kvantificere synergi- eller antagonismeinteraktioner. Vi havde til formål at bestemme det optimale masseforhold for blandinger, tydeliggøre triple-mode funktionelle mekanismer og levere eksperimentel dataunderstøttelse til udvikling af naturlige synergistiske hudoplysende kosmetiske råmaterialer.

2. Materialer og metoder

2.1 Reagenser, cellestammer og laboratorieinstrumenter

B16F10 musemelanomcellelinje (STCC20013G-1) blev købt fra Saierbio Co., Ltd. Udødeliggjort human epidermal keratinocyt HaCaT (iCell-h066) blev opnået fra iCell Bioscience Inc.Cistanchephenylethanoid glycosider (PhGs) og glabridin (Gla) blev kommercielt leveret af Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Svampetyrosinase, arbutin, L-tyrosin, L-DOPA, DPPH, ABTS diammoniumcorbic acid, L-AAas, (L-PH,PS), X-100, DMSO og andre kemiske reagenser af analytisk kvalitet blev hentet fra almindelige biokemiske reagensleverandører. Forbrugsstoffer til cellekultur omfattede DMEM-medium med højt glukoseindhold, føtalt bovint serum, penicillin-streptomycin blandet opløsning. ELISA-assaysæt rettet mod human IL-6, TNF-, CAT og total-SOD-detektionskit blev anskaffet fra tilsvarende bioteknologiske producenter.

Nøglelaboratorieudstyr indeholdt Multiskan FC fuldbølgelængde mikropladelæser, Heracell 371 CO₂-inkubator (Thermo Fisher); KQ-200VDB ultralydsrenser; vandbad med konstant temperatur; DHG-9246A blæsetørreovn; KN4006B UVB ultraviolet bestrålingsinstrument med udgangsbestråling på 8 mW/cm².

2.2 Forberedelse af prøveopløsning

Stamopløsninger af PhG'er og glabridin blev fremstillet i pH 6,8 PBS-buffer eller 50 % (v/v) ethanol-vand opløsningsmiddel, seriefortyndet til arbejdskoncentrationer: 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,025 g/l, 0,1 g/l, 0,1 g/l, 0,4 g/l, 0,4 g/l. 1,6 g/L, 2,0 g/L. Ni sammensatte grupper blev konfigureret til en fast total massekoncentration på 0,4 g/l med varierede masseforhold m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:40, betegnet som PhGla PhGs/1 (PhGla:1:1) (1:40).

Til cellulære eksperimentassays blev pulverprøver opløst i serumfrit DMEM-medium for at fremstille serier af arbejdskoncentrationsopløsninger.

2.3 Biokemiske in vitro-assays

2.3.1 Tyrosinaseinhiberingsassay

50 μL prøveopløsning, 50 μL pH 6,8 PBS og 50 μL 1 g/LL-tyrosin-substratopløsning blev sekventielt tilsat til hver brønd på en 96-brønds mikroplade. Forinkubationen fortsatte under 37 graders vandbad i 10 min. Efterfølgende blev 50 μL 0,4 g/L svampetyrosinaseopløsning (200 U/mL) suppleret, og inkubationen fortsatte ved 37 grader i 10 min. Arbutin fungerede som et positivt kontrolstof, blindkontrol anvendte pH 6,8 PBS-buffer. Absorbansværdien blev målt under 490 nm bølgelængde på mikropladelæser. Formel til beregning af tyrosinasehæmningshastighed:

Tyrosinaseinhiberingshastighed (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction-control) / (A_blank − A_blank-control)]} × 100 %

Hvor: A_reaktion: absorbans indeholdende prøve, substrat, PBS og tyrosinase; A_reaktionskontrol: absorbans af prøve, substrat og PBS uden enzym; A_blank: absorbans af substrat, PBS og tyrosinase; A_blank-kontrol: absorbans kun for substrat og PBS-buffer.

2.3.2 Bestemmelse af DPPH-frie radikaler

DPPH-pulver blev opløst i vandfri ethanol til fremstilling af 0,2 mmol/L DPPH-arbejdsvæske. PhG'er, glabridin og C-vitamin-referencestof blev opløst i 50 % ethanol-vand-opløsningsmiddel for at danne stamopløsninger med koncentrationsgradient. Binære blandingsprøver med ni masseforhold blev blandet jævnt. Hver brønd modtog 100 μL prøvevæske plus 100 μL DPPH-arbejdsopløsning. Efter grundig blanding blev mikropladen holdt væk fra lys ved omgivelsestemperatur i 30 min. Absorbansaflæsning blev registreret ved λ = 517 nm. Vitamin C fungerede som positiv kontrol, hver forsøgsgruppe blev gentaget i 3 biologiske replikater. DPPH-opfangningshastighedsformel:

DPPH-opfangningshastighed (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbans af prøve + DPPH arbejdsfluid; A2: absorbans af 50 % ethanol + DPPH arbejdsvæske; A3: absorbans af prøveopløsning blandet med 50 % ethanolopløsningsmiddel.

2.3.3 ABTS⁺-kation-radikal-fjernende assay

7,4 mmol/L ABTS-stamopløsning og 2,6 mmol/L kaliumpersulfatopløsning blev blandet ligeligt, inkuberet i mørke omgivelser i 12 timer for at producere stabilt ABTS⁺-arbejdsreagens. Prøveopløsninger blev konfigureret efter protokoller beskrevet i afsnit 2.3.2. 40 μL prøveopløsning, og 160 μL ABTS⁺ arbejdsvæske blev pipetteret til mikropladebrønde. Efter lysafskærmet inkubation i 6 minutter ved stuetemperatur blev absorbans målt ved 734 nm. ABTS⁺ radikal-opfangende-rate formel:

ABTS⁺ rensningshastighed (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: absorbans af prøveopløsning plus ABTS+ arbejdsopløsning; A₂: absorbans af deioniseret vand blandet med ABTS⁺ arbejdsreagens; A₃: absorbansværdi for prøveopløsning blandet med rent deioniseret-vand opløsningsmiddel.

2.4 Cellekulturprocedurer

B16F10-melanomceller og HaCaT-keratinocytter blev dyrket i DMEM-medium med højt glucoseindhold suppleret med 10 % føtalt-bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin. Inkubatorparametre: 37 grader, 5 % volumenfraktion CO₂, relativ luftfugtighed 70 %. Cellepassage og medium forfriskning blev udført i henhold til cellulær væksttæthed observeret under omvendt optisk mikroskop. Celler i logaritmisk vækstfase blev opsamlet til efterfølgende podning på 96-brønds kulturplader.

2.5 Etablering af tre cellulære funktionelle modeller

2.5.1 UVB-induceret B16F10-pigmenteringsmodel

Efter 1 times forbehandling med tilsvarende prøvemedium blev cellelagets overflade dækket med PBS-buffer. UVB-bestrålingsintensitet blev sat til 8 mW/cm², bestrålingsafstand 3 cm, bestrålingsvarighed 110 s. Normal gruppe modtog identisk medium uden UVB-strålingsintervention. Modelkontrolgruppen opnåede PBS-forbehandling efterfulgt af UVB-eksponering i lige store doser uden prøvetilskud.

2.5.2 LPS-medieret HaCaT-inflammatorisk aktiveringsmodel

HaCaT-celler blev præ-inkuberet med testprøve-DMEM-medium i 24 timer. Bagefter blev lipopolysaccharid LPS-opløsning suppleret for at nå en endelig koncentration på 20 ug/ml, og co-kultur varede yderligere 24 timer. Modelgruppeceller blev udfordret af LPS uden prøveforbehandling. Normal gruppe opretholdt almindelig komplet-medium dyrkning.

2.5.3 AAPH-udløst HaCaT-oxidativ-stress-model

Celler modtog 24 timers prøvepræinkubation. AAPH-reagens blev tilsat til dyrkningsmediet, slutkoncentration 25 mmol/L, fortsat 24 timers inkubation. Modelkontrolgruppe blev stimuleret af AAPH uden prøveintervention. Normal-kontrolgruppen voksede under normal medium tilstand.

Alle cellulære modelgrupper indeholdt tre tekniske replikatbrønde.

2.6 Cytotoksicitetstest (CCK-8 metode)

Cellesuspension blev justeret til densitet 1 × 104 celler/ml og inokuleret til 96-brønds mikroplader. Efter celleadhærens blev gradientkoncentrationsprøvemedium administreret, og inkubationen fortsatte i 24 timer, 48 timer, 72 timer. CCK-8-detekteringsreagens blandet med frisk DMEM-medium (volumenfraktion 10 %) erstattede gammelt medium, inkubationen fortsatte i 60 min. Mikropladelæser målte absorbans ved 450 nm bølgelængde. Beregningsformel for relativ cellelevedygtighedsprocent:

Cellelevedygtighed (%)=[(A_sample − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_prøve: absorbans af brøndholdige celler, CCK-8-reagens og prøvemedium; A_blank: absorbans for dyrkningsmedium plus CCK-8 uden podede celler; A_0: absorbans af celler og CCK-8-reagens dyrket med blankt medium (ingen testprøver).

2.7 Intracellulær tyrosinase-aktivitet kvantificering

Efter 48 timers modeletableringsbehandling blev cellesupernatanten kasseret. Cellemonolag blev vasket to gange med pH 7,4 PBS. 50 μL 1 % Triton X-100 lyseringsopløsning blev tilsat pr. brønd. Mikropladen blev frosset ved -80 graders køleskab i 30 minutter og derefter optøet under stuetemperatur for fuld cellemembranbrud. Forvarmningsbehandling ved 37 grader varede 5 min. L-DOPA-substrat (10 mmol/L, 10 μL) blev suppleret. Mikroplade blev inkuberet i 1 time inde i CO2-inkubator. Absorbans blev detekteret ved 475 nm til beregning af relativ intracellulær tyrosinase-aktivitet.

2.8 Intracellulær måling af melaninindhold

NaOH-spaltningsmetoden blev vedtaget til påvisning af melaninindhold. Efter 72-timers modelintervention blev kultursupernatanten fjernet, celler skyllet to gange med PBS-buffer. 100 μL 1 mol/L NaOH-vandig opløsning indeholdende 10 % DMSO blev tilsat. Mikropladen blev inkuberet inde i en 90 graders ovn i 60 minutter for fuldstændig melaninopløsning. Absorbans blev aflæst ved 490 nm for at beregne relativ melaninindholdsprocent.

2.9 Påvisning af inflammatoriske faktorer og antioxidant-enzymindikatorer

Efter 48 timers modelbehandling blev HaCaT-celler skrabet og opsamlet, centrifugeret for at høste cellesupernatant. Kommercielle ELISA-sæt blev brugt til kvantitativ bestemmelse af IL-6- og TNF-pro-inflammatoriske-cytokinkoncentrationer. Til antioxidant-enzymtestning blev cellepelleter udsat for gentagne fryse-optøningscyklusser for at opnå cellefragmentering. Centrifugeringstilstand: 12 000 r/min, 4 grader, 10 min. Supernatantfraktion blev opsamlet for at analysere SOD-vitalitet og CAT-enzymindhold i overensstemmelse med kittets operationelle specifikationer.

2.10 Analyse af kombinationsindeks (CI).

Chou-Talalay kombinationsindeks (CI) algoritme blev implementeret til at bedømme synergistisk/additiv/antagonistisk interaktion mellem PhG'er og glabridin inden for tyrosinasehæmnings- og antioxidantassays:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 repræsenterer antagonistisk interaktion; CI ≈ 1 betyder additiv virkning; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistisk analyse

Eksperimentelle måleresultater blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (middel ± SD). GraphPad Prism 9.5.0 software udførte statistisk beregning. En-vejs variansanalyse (ANOVA) blev brugt til multi-gruppe sammenligning. P-værdi< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Resultater og diskussion

3.1 In vitro tyrosinase-hæmmende ydeevne af phG'er, Glabridin og binære blandingsprøver

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhG'er.

Ved en total koncentration på 0,4 g/L for sammensat PBS-opløsning, afgav PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) en tyrosinasehæmningsgrad på 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Både 5:1 og 1:1 forhold oversteg inhiberingseffektiviteten af ​​enkeltkomponent-phG'er (36,92 %) og enkeltkomponent-glabridin (92,71 %) ved matchende total massekoncentration. 1:1-gruppen opnåede en hæmningsstørrelse sammenlignelig med positiv kontrol-arbutin. Ifølge CI-værdiberegningsresultater: m(PhGs):m(Gla) fra 40:1 til 1:1 genereret CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, der viser antagonistisk interaktion.

Phenoliske hydroxylgrupper udgør den kernefunktionelle del for tyrosinaseinhiberende kapacitet. PhG'er indeholder ortho-dihydroxyphenyl strukturelle fragmenter, der er i stand til at chelatere kobberioner i tyrosinase katalytisk-aktiv lomme, hvilket kompetitivt hindrer substrat-enzymbinding. Glabridin-isoflavanskelet bærer 2-OH- og 4-OH-grupper på sin B-ring, strukturelt analogt med L-tyrosin / L-DOPA aromatisk hydroxyl-substitueret ring, hvilket muliggør konkurrencedygtig besættelse af enzymaktivt-site-domæne. Efter blanding af blandinger stiger den kumulative mængde phenol-hydroxyl; i mellemtiden kan to molekyler binde sig til forskellige bindingssteder af tyrosinaseprotein, hvilket i fællesskab forstærker den inhiberende effektivitet.

3.2 Radikal-fjernende antioxidantaktivitet af testprøver

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. PhG'er er rigelige i caffeoyl-gruppe- og 3,4-dihydroxyphenylethanol-dele, med konjugerede dobbeltbindingssystemer, der styrker fri-radikal-neutraliserende ydeevne. Glabridin flavonoidramme leverer også hydroxylgrupper og udvidet konjugeret ringarkitektur til stabilisering af uparrede elektroner fra reaktive iltarter.

Tre lovende sammensatte grupper PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) udviste fremragende DPPH- og ABTS-fjernende ydeevne. ABTS⁺-opfangningshastigheden nåede næsten 100 %, hvilket indikerer næsten fuldstændig eliminering af kationfrie radikaler. Forskellige masseforhold producerer varierede molekylære interaktionstilstande mellem to molekyler, hvilket fører til forskelle i hydroxylgruppeeksponeringsstatus og resulterer i divergens af antioxidantsynergistisk størrelse.

3.3 Cytotoksicitetsvurdering af phG'er, Glabridin og blandede præparater

CCK-8 cytotoksicitetstest viste, at PhG'er inden for koncentrationsområde 62,5 ~ 500 ug/mL og glabridin 6,25 ~ 25 ug/mL ikke udløste åbenbar levedygtighedsreduktion for B16F10- og HaCaT-cellelinjer. Under 25 ug/mL total massekoncentrationsbetingelser opretholdt tre forbindelsesforholdsgrupper PhG'er/Gla (1:1, 5:1, 10:1) høj cellelevedygtighed og viste ingen påviselig cytotoksisk effekt mod begge cellestammer. Som følge heraf blev 25 ug/ml valgt som sikker arbejdskoncentration til efterfølgende cellulær funktionsevaluering. For enkeltstofgrupper blev PhG lav-/medium-/høj-dosering defineret som 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL; glabridin lav-/medium-/høj dosis: 6,25 ug/ml, 12,5 ug/ml, 25 ug/mL.

3.4 Indflydelse på intracellulær tyrosinase-aktivitet og melaninindhold i UVB-stimulerede B16F10-celler

Efter UVB-bestrålingsbehandling udviste B16F10-modelgruppen statistisk signifikant stigning i intracellulær tyrosinase-aktivitet og melaninakkumulering (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Ved samlet samlet koncentration på 25 ug/ml viste sammensatte grupper overlegne biologiske resultater i forhold til enkeltkomponent-modparter. Blandt tre forhold leverede PhGs/Gla (1:1) optimal effekt: resterende intracellulær tyrosinaseaktivitet kun 23,80 %, det relative melaninindhold faldt til 30,90 %. Statistisk sammenligning afslørede signifikant forskel sammenlignet med 5:1 og 10:1 sammensatte grupper. 1:1-andelen viste fremtrædende synergistisk-amplifikation til at begrænse melaninbiosyntesen inde i melanocytceller.

UVB-bestråling fremkalder melanocyt-iboende melanogen signaleringskaskade, opregulerer MITF-transskriptionsfaktorekspression og inducerer yderligere tyrosinaseproteinoverekspression. Vores cellulære eksperimentresultater validerede, at PhG'er kombineret med glabridin effektivt kunne vende UVB-induceret tyrosinaseaktivering og reducere melanindannelsen.

3.5 Anti-inflammatorisk virkning mod LPS-udfordrede HaCaT-keratinocytter

LPS-stimulering øgede stærkt IL-6- og TNF-pro-inflammatorisk-cytokin-sekretion i HaCaT-modelgruppe (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). 1:1-formuleringen genererede maksimal reduktion for IL-6 og TNF-frigivelse, der oversteg den hæmmende effekt opnået ved separat påføring af PhG'er eller glabridin.

Molekylær mekanisme forklaring: PhGs phenol-hydroxyl-del fjerner inflammatorisk-udløsende frie radikaler; desuden kan PhG'er forstyrre NF-κB og MAPK intracellulære signalkaskader for at begrænse pro-inflammatorisk gentransskription. Glabridin hæmmer phosphorylering af stressaktiveret kinase JNK og p38, hvilket blokerer nedstrøms inflammatorisk signaltransduktion. Enkelt stof kan kun delvist undertrykke aktivering af inflammatorisk signalvej. Binær kombination intervenerer samtidigt flere knudepunkter i inflammatorisk-signaleringsnetværket og opnår synergistisk anti-inflammatorisk ydeevne.

Kutan inflammation tjener som kritisk opstrømsdriver for PIH-forekomst. Inflammatoriske cytokiner udskilt af keratinocytter fungerer som parakrine signalerende budbringere, stimulerer tilstødende melanocytter til at accelerere melaninproduktion og melanosomoverførsel. Effektiv afbødning af epidermal inflammation er afgørende for at forebygge og forbedre hyperpigmenteringslæsioner. Derfor giver den anti-inflammatoriske fordel ved PhGs-glabridinforbindelsen yderligere værdi til anti-pigmentering af kosmetisk materiale.

3.6 Antioxidant-enzymregulerende kapacitet under AAPH-induceret oxidativ-stress-tilstand

AAPH oxidativ-stress model-gruppe viste tydeligt fald i intracellulær SOD og CAT antioxidant-enzym vitalitet (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Hud udsat for ultraviolet stråling genererer store mængder reaktive iltarter. Overskydende ROS oxiderer ikke kun direkte melanin-syntese-relaterede biomolekyler, men aktiverer også flere melanogene signalveje. Endogent antioxidant-enzymsystem (SOD, CAT) udgør en væsentlig forsvarsbarriere for at eliminere intracellulær ROS. Når oxidativ stress overvælder den iboende antioxidantkapacitet, accelererer ROS-akkumulering pigmenteringsforløbet. PhGs-glabridin-forbindelsen fjerner ikke kun direkte frie radikaler via phenol-hydroxyl-kemisk reaktion, men reparerer også cellulær antioxidant-enzym-systemfunktion og lindrer skader fra oxidativ stress fra to dimensioner. Forskellige masseforhold ændrer molekylært interaktionsmønster mellem to naturlige molekyler, hvilket resulterer i uoverensstemmelse i den endelige antioxidantregulerende effektivitet.

3.7 Omfattende mekanismediskussion for synergistisk anti-hyperpigmentering

Hudhyperpigmenteringspatologisk proces danner et komplekst signalnetværk: UVB-bestråling virker på både melanocytter og omgivende keratinocytter. Keratinocytter frigiver ROS og pro-inflammatoriske-cytokiner. Disse biosignaler aktiverer melanocytter yderligere, opregulerer tyrosinaseaktivitet, booster melaninbiosyntesen og letter melanosomtransporten mod epidermale keratinocytter, hvilket til sidst fører til synlig pigmentaflejring på hudoverfladen. Derfor kan enkelt-mål tyrosinase-hæmning ikke fuldstændigt vende patologisk pigmentering. Multi-path interventionsstrategi bør integrere melanogenese-hæmning, anti-inflammation og antioxidantbeskyttelse.

Vores eksperimentelle resultater viste, at PhG'er kombineret med glabridin realiserer multimodal intervention mod hyperpigmentering:

Undertrykker direkte tyrosinase-katalytisk aktivitet inde i melanocytter for at hæmme melaninbiosyntesekilden;

Hæmme pro-inflammatorisk-cytokin-oversekretion fra keratinocytter, afskære parakrine inflammatoriske-stimulerende signaler mod melanocytter;

Eliminer overskydende reaktive-ilt-arter og genvind endogen SOD/CAT-antioxidant-enzymaktivitet, hvilket mindsker oxidativ-stress-medieret pigment-amplifikation.

m(PhGs):m(Gla) = 1:1-forholdet udviste optimal omfattende synergistisk-ydeevne på tværs af biokemisk enzymhæmning, radikalopfangning, melanocytpigment-model, keratinocyt-inflammations-model og oxidativ-stress-model. Dette forhold oversteg 5:1 og 10:1 grupper i næsten alle testindikatorer. Synergi kan stamme fra komplementære molekylær-strukturelle karakteristika: PhG'er og glabridin har forskellige phenolskeletskeletter, der interagerer med forskellige målproteiner (tyrosinase, inflammatoriske signalkinaser, antioxidant-enzym-relaterede veje). Efter blanding af blandinger optimeres eksponeringsstatus for phenol-hydroxyl gennem intermolekylær interaktion, hvilket øger den samlede biologiske aktivitet.

For kosmetisk industris praktiske perspektiv giver synergistiske botaniske sammensatte råmaterialer to store fordele. For det første muliggør synergistisk effekt reduktion af den nødvendige dosis for hver enkelt aktiv ingrediens, hvilket sænker formuleringsomkostningerne; for det andet matcher multi-path funktionel profil den komplekse patologiske mekanisme af klinisk observeret hudhyperpigmentering, såsom PIH og melasma, og tilbyder et teoretisk grundlag for udvikling af højeffektive naturlige hudoplysende kosmetiske formler.

4. Konklusion

Denne forskning evaluerede systematisk synergistisk anti-hyperpigmenteringsbioaktivitet afCistanche deserticola-afledtphenylethanoid glycosider (PhGs) kombineret med glabridin (Gla). Biokemisk in-vitro-screening og tre repræsentative cellulære modeller blev brugt til multidimensionel effektivitetskarakterisering. De vigtigste eksperimentelle konklusioner er opsummeret som følger:

Inden for in-vitro biokemiske assays for tyrosinase-hæmning og fri-radikal-opfangning, præsenterede sammensatte formuleringer m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 gunstig inhiberende ydeevne og synergistisk-interaktion. Under en total koncentration på 0,4 g/l i pH 6,8 PBS nåede tyrosinaseinhiberingsraterne 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). DPPH-radikal-opfangende rater: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺‑radikal-opfangningsrater: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Ved sikker arbejdskoncentration på 25 ug/ml udviste PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM-opløsninger ingen cytotoksicitet mod B16F10 melanomceller og HaCaT humane keratinocytter. Blandt disse grupper opnåede PhGs/Gla (1:1) den bedste integrerede effektivitet: intracellulær tyrosinase-aktivitet faldt til 23,80 %, melaninindhold reduceret til 30,90 %. Det genererede den stærkeste hæmning af IL-6, TNF-inflammatorisk-cytokinfrigivelse og maksimal genopretning for SOD og CAT antioxidant-enzym vitalitet. 1:1-masseforholdsgruppen udviste en åbenlys synergistisk-forstærkende effekt, som var overlegen i forhold til enkeltstof-grupper og andre grupper med forbindelsesforhold.

PhG'er og glabridin binær blanding udøver en anti-hud-hyperpigmenterende effekt gennem tredobbelte veje: undertrykker melaninbiosyntesen, lindrer epidermal betændelse og modvirker skader på oxidativ stress. Det optimale synergistiske-masseforhold m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Denne undersøgelse leverer eksperimentel evidens og teknisk støtte til udvikling af naturlige, plante-afledte multifunktionelle kosmetiske råmaterialer til hudoplysende og anti-pigmenteringsapplikationer.

Anerkendelser

Dette arbejde blev økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82160772). Vi takker Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research for støtte til eksperimentel platform.

Referencer

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Håndtering af hyperpigmentering: Nuværende behandlinger og nye terapier[J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher DE. Hudpigmentering og dens kontrol: Fra ultraviolet stråling til stamceller[J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Melasmabehandling: En systematisk gennemgang[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816-1837.

[4] Hossain MR, Ansary TM, Komine M, et al. Diversificerede stimuli-inducerede inflammatoriske veje forårsager hudpigmentering[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Sang X, Ni M T, Zhang Y, et al. Sammenligning af de hæmmende evner af epigallocatechin-3-gallate og gallocatechin gallat mod tyrosinase og deres kombinerede virkninger med kojic acid[J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad TF, et al. Målretning mod tyrosinase i hyperpigmentering: Nuværende status, begrænsninger og fremtidige løfter[J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Exosomer frigivet af keratinocytter modulerer melanocytpigmentering[J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Intrinsisk og ydre regulering af human hudmelanogenese og pigmentering[J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. En mekanistisk tilgang til toksicitet og risikovurdering af tungmetaller, hydroquinon og mikroorganismer i kosmetiske cremer[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. Hydroquinon-induceret hudirriterende reaktion kunne opnås ved at aktivere mastceller via mas-relateret G-protein-koblet receptor X2[J]. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R, et al. Bibliometrisk analyse af virkningerne af ginseng på huden[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99-107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et al. Fremskridt i biomedicinske funktioner af naturlige blegestoffer i behandlingen af ​​hudpigmenteringssygdomme[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J, et al. Synergistisk hudpleje af Lonicera japonica polyphenoler og ethanolekstrakt af Vaccinium vitis-idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et al. Anvendelse af komplekser af Salvia miltiorrhiza flygtig olie og mælkebøtteekstrakt i kosmetik[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen JR, Zhu XY, Cui HY, et al. Variationer af aktive ingredienser og antioxidantaktivitetsanalyse af Cistanche deserticola fra forskellige racer og dele i Xinjiang-provinsen[J]. Food Industry Science and Technology, 2024, 45(21):227-233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubulosid B, isoleret fra Cistanche tubulosa, et lovende middel mod M1 makrofagaktivering via synergistisk målretning mod Mob1 og ERK1/2[J]. Biomedicin & Farmakoterapi, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Undersøgelse af phenylethanoid glycosider af Herba cistanches transdermal levering og hæmmende virkninger på melaninsyntese i B-induceret pigmentering i brunt marsvin[D]. Urumqi: Xinjiang Medical University, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Synergistisk blegning, antioxidant og anti-inflammatoriske aktiviteter af glabridin, resveratrol og poldatin kompleks[J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99-107.233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Undersøgelse og anvendelse af Chou-Talalay-metoden til kombination af antitumorlægemidler[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Hudblegemidler: Medicinsk kemiperspektiv af tyrosinasehæmmere[J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425