Undersøgelse af de terapeutiske virkninger og mekanismer af Cistanche Deserticola-ekstrakt på dexamethason-induceret sarkopeni hos mus

Abstrakt:Denne undersøgelse udforskedeterapeutisk effekt af Cistanche deserticola ekstrakt (CdE)om dexamethason (Dex)-induceret sarkopeni hos mus og den mulige virkningsmekanisme. For det første blev de farmakodynamiske komponenter og vigtige mål af Cistanche undersøgt ved netværksfarmakologi, og veje blev beriget for at forudsige virkningsmekanismen af ​​CdE. I dyreforsøg blev 50 KM-mus tilfældigt opdelt i 5 grupper (kontrolgruppe, Dex-modelgruppe, CdE-højdosisgruppe, CdE-middeldosisgruppe og CdE-lavdosisgruppe). Bortset fra kontrolgruppen blev de andre grupper injiceret subkutant for at inducere sarkopeni efter 42 dage, og de tre behandlingsgrupper fik forskellige doser af CdE oralt på samme tid. Under forsøget blev dyrets vægt, træningskapacitet og kropssammensætning regelmæssigt testet. Efter at dyrene var blevet aflivet, blev muskelkoefficienten for bagbenene beregnet, og histologi og relaterede genekspressionstest blev udført. Netværksfarmakologiske resultater viser, at CdE kan behandle sarkopeni ved at opregulere IGF-1-relaterede signalveje. Resultaterne af dyreforsøg viser, at CdE signifikant reverserer faldet i magert kødindhold og muskelkoefficient forårsaget af Dex, forbedrer træningskapaciteten, reducerer fedtindholdet, forbedrer den histologiske status af musklerne, opregulerede IGF-1, MyoD og MyoG og nedregulerede udtrykket af Atrogin-1 og MuRF-1. CdE har en terapeutisk effekt på Dex-induceret muskelatrofi og kan forbedre muskelhistologisk morfologi, og dets virkningsmekanisme kan være aktiveringen af ​​IGF-1 signalvejen.

Nøgleord: Cistanche deserticola ekstrakt; dexamethason; sarkopeni; netværk farmakologi; IGF-1 vej

 

 

echinacoside fordel

 

1. Materialer og metoder

1.1 Reagenser

Følgende reagenser blev brugt i denne undersøgelse:

Dexamethason natriumfosfat injektion(Batchnr.. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Normalt saltvand(Batchnr. L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Vandfri ethanol, xylen, paraformaldehyd, ogglutaraldehyd– China National Pharmaceutical Group

Saltsyre(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Hæmatoxylinfarvningsopløsning– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Eosin farvestof opløsning– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

812 epoxyharpiks indstøbningssæt, uranylacetat– SPI Company

Molpure® RNA-ekstraktionssæt, PrimeScript RT Kit, TB Green™ Premix Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology and Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 aktive ingredienser af cistanche

 

1.2 Instrumenter

Vigtigt brugt udstyr:

NK-10 analog push-pull-måler– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

QMR06-060H kropssammensætningsanalysator– Niumag Corporation

BA 210 digitalt trinokulært mikroskop– Motic Group

JEM-1400 FLASH transmissionselektronmikroskop– JEOL, Japan

QuantStudio™ 3 real-time PCR-system– ThermoFisher Scientific

 

1.3 Netværksfarmakologisk analyse

At undersøge de aktive forbindelser og potentielle mekanismer afCistanche tubulosai behandlingen afsarkopeni, a netværksfarmakologitilgang blev anvendt:

Aktive forbindelserafCistanche tubulosablev screenet ved hjælp afTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database (TCMSP), med tærskler på:

Oral biotilgængelighed (OB) større end eller lig med 30 %

Lægemiddellignhed (DL) Større end eller lig med 0,18

Yderligere sammensatte ogmåloplysningerblev hentet fra:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Sygdomsrelaterede gener for sarkopeniblev hentet fra:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Protein-protein interaktion (PPI) analyseblev udført viaSTRING database(https://string-db.org).

A forbindelse-mål-gen interaktionsnetværkblev bygget vhaCytoscape 3.2.1.

Funktionel berigelseblev udført ved hjælp af:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) forGenontologi (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) til vejanalyse

Resultater blev visualiseret viaBioinformatik online værktøj(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 Udarbejdelse afCistanche tubulosaUddrag (CdE)

DeCistanche tubulosaekstrakt blev fremstillet som følger:

Rå urteskiver (batchnr. Y221217) blev købt hosSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., og godkendt af prof. Yang Wenyu fra Xihua University.

1 kg tørretCistanche tubulosablev pulveriseret og ledt gennem en40 mesh sigte.

A 1:20 materiale-til-væske-forholdblev brugt med50% ethanol-vand opløsning.

Blandingen varudblødt i 30 min, efterfulgt afultralydsudvindingpå55 grader, 250 W, for40 min.

Ekstrakter varcentrifugeret, filtreret og koncentreret under reduceret trykved 60 grader til en tyk pasta (densitet 1,2) ved hjælp af en rotationsfordamper.

Den koncentrerede ekstrakt varfrysetørret under vakuum, hvilket giver en finaleudvindingseffektivitet på 40 %.

 

1.5 Dyreforsøgsdesign

I alt50 SPF-grade KM hanmus, 6 uger gammel og vejer(22 ± 2) g, blev brugt i denne undersøgelse (Animal License No.SCXK [Chuan] 2023-030). Alle dyreprocedurer fulgteBestemmelser om administration af forsøgsdyrudstedt af ministeriet for videnskab og teknologi i Folkerepublikken Kina og vargodkendt af den dyreetiske komité på Xihua University(Godkendelsesnr.: XH-2023-02-01).

Boligforhold:Temperatur (26 ± 1 grad), luftfugtighed (50 ± 10%), 12 timers lys/mørke cyklus, fri adgang til mad og vand.

Efter 7 dages akklimatisering blev mustilfældigt fordelt i 5 grupperbaseret på kropsvægt.

Kropsvægt blev registreret dagligt, og generelle helbredstilstande såsom adfærd, pelstilstand og fødeindtagelse blev overvåget.

Behandlingsgrupper og doseringerer detaljeret iTabel 1.

Pådag 40-42, motoriske funktionstest(grebstyrke og svømning) blev gennemført.

Pådag 43Efter 12 timers faste blev kropsvægt og kropssammensætning registreret. Mus blev derefter bedøvet med ether og aflivet. Bilaterale bagbensskeletmuskler blev hurtigt dissekeret og vejet.

Devenstre gastrocnemiusblev skåret på langs og fastgjort3% glutaraldehydog4% paraformaldehydhhv.

Dehøjre gastrocnemiusblev frosset ved -80 grader forqPCR analyse.

SEO søgeord:dyremodel for sarkopeni, KM-mus, muskelatrofieksperiment, vurdering af muskelfunktion, etisk dyreforskning

acteoside fordele

1.6 Kropssammensætning og muskelindeksmåling

Kropsvægtblev registreret dagligt under hele forsøget.

Før ofring,kropssammensætning(mager masse og fedtmasse) blev måltto gange, oggennemsnitsværdiblev optaget.

Efter ofring,bagbenets skeletmuskulaturblev vejet.

Demuskelmasseindeksblev beregnet ved hjælp afCuadros formel [11]:

Muskelindeks (%)=Muskelmasse/Kropsvægt × 100
(ligning 1)

SEO søgeord:mager kropsmasse i mus, muskelindeksberegning, kropssammensætningsanalysator, sarkopeni biomarkører

 

1.7 Motorfunktionstest

At vurderemuskel funktion, blev følgende tests udført mellem dag 40 og 42:

Svømmeprøve:

Hver mus varvejes, og enbelastning (5 % kropsvægt i blyfolie)var fastgjort til den distale tredjedel af halen.

Mus blev anbragt i enbeholder med 25 graders vand, i en dybde større end eller lig med 30 cm.

Svømmetidblev optaget fra indsejling, indtil musen ikke længere kunne flyde og begyndte at synke.

Hver mus blev testet en gang dagligt for3 dage i træk, oggennemsnitblev taget som det endelige resultat.

Grib styrke test:

Udført ved hjælp af enmanuel push-pull måler.

Hver mus blev testetfem gange, med en150 sekunders hvilemellem prøverne.

Degrebstyrkekoefficientblev beregnet til at normalisere for kropsvægt:

Grib Strength Coefficient=Grip Force/Kropsvægt (N/kg)
(ligning 2)

SEO søgeord:svømning udholdenhedstest, grebsstyrke hos gnavere, muskelpræstationsmålinger, sarkopeni musemodel

 

1.8 Histologisk analyse

For at vurderemorfologiske ændringer i muskelvævefter behandling medCistanche tubulosaekstrakt (CdE):

Hæmatoxylin & Eosin (H&E) farvningblev udført på væv fikseret i4% paraformaldehyd.

Sektioner blev observeret under alysmikroskop, ogmuskelfibres tværsnitsarealblev analyseret vhaImageJsoftware.

Forultrastrukturel analyse, muskler fikseret i3% glutaraldehydblev efterfikset1% osmiumtetroxid, dehydreret i acetone og indlejret iEp812 harpiks.

Semitynde sektionervar farvet medtoluidin blåtil positionering.

Ultratynde sektionervar farvet meduranylacetat og blycitratog observeret med enJEM-1400FLASH transmissionselektronmikroskop.

Muskelfiberbreddeblev målt ved hjælp af ImageJ.

SEO søgeord:skeletmuskelhistologi, HE-farvningsprotokol, elektronmikroskopi i muskelforskning, muskelfibermorfologianalyse

cistanche fordele liste

1.9 Genekspressionsanalyse

For at undersøgemolekylære mekanismeraf CdE i sarkopeni:

Frosne muskelvævblev mekanisk afbrudt under flydende nitrogen.

Total RNA blev ekstraheret under anvendelse afTRIpure reagensi henhold til producentens anvisninger.

cDNA blev syntetiseret med enomvendt transkriptionssæt, ogqPCRblev udført ved hjælp af enThermo Scientific PikoRealsystem.

GAPDHblev brugt som et internt referencegen.

Primer sekvenser tilmuskel-relaterede generer opført iTabel 2.

SEO søgeord:qPCR for muskelatrofi-gener, GAPDH-referencegen, RNA-ekstraktion fra muskel, genekspression ved sarkopeni

 

1.10 Statistisk analyse

Eksperimentelle data blev analyseret vhaenvejs ANOVA, efterfulgt afDunnetts multiple sammenligningstest.

A P-værdi < 0,05blev betragtet som statistisk signifikant.

Alle statistiske analyser blev udført vhaSPSS 23.0.

Histomorfometriske datablev analyseret vhaImageJsoftware.

SEO søgeord:statistisk analyse i farmakologiske undersøgelser, SPSS i biomedicinsk forskning, ANOVA i dyreforsøg, ImageJ muskelanalyse