Undersøgelse af neuroendokrin-immun funktion af Cistanche Deserticola og dens risvinsdampende produkter i glukokortikoid-induceret rottemodel-Ⅰ

1. Introduktion

Cistanche ørken, som kaldes "ørkenginseng," er en traditionel kinesisk medicin, der har været brugt i århundreder som en yang-tonisk urt tilstyrker nyrerne og styrker yang[1]. Otte arter og en variation afCistanche Herba er blevet optaget i Kina og kunCistanche deserticolaYC Ma ogCistanche tubulosa(Schenk) Wight er registreret i den kinesiske farmakopé [2]. Farmakologiske undersøgelser viste detCistanches Herbaudviste neurobeskyttende [3], immunmodulerende [4], kardiobeskyttende [5], anti-træthed [6], anti-inflammatorisk [7], leverbeskyttende [8], antioxidativ [9], antibakteriel [10], afføringsmiddel [11] og antitumor effekter [12]. Det brede spektrum af rapporterede biologiske aktiviteter af denne slægt er blevet tilskrevet dens komplekse og varierede fytokemiske sammensætning.Cistanche deserticolaindeholder phenylethanolglykosider, iridoider, polysaccharider [13] osv. Indholdet af phenylethanoidglykosider er det højeste i de originale lægemidler [14].

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL OPVINDELSE AF NYREN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Behandling af kinesisk Materia Medica (CMM) er en traditionel farmaceutisk teknik til at opfylde de forskellige krav til behandling, dispensering og fremstilling af præparater i henhold til traditionel kinesisk medicinteori. Disse forarbejdede produkter kaldes afkogsstykker, som bruges i klinikker. Forarbejdning har til formål at øge effektiviteten for at reducere toksiciteten af ​​rå lægemidler. 2015 Chinese Pharmacopoeia registrerede, at Cistanche tykke skiver (CD) og risvinsdampet Cistanche (WCD) kunne bruges som afkogsstykker i klinikken. Vores forskningsgruppe viste, at den afførende effekt blev lindret, og de antiældende og nyre-yang-forfriskende virkninger blev forstærket efter Cistanche blev dampet med risvin [15].

Funktionen af ​​hypothalamus-hypofyse-binyre-thymuskirtlen (HPAT) aksen er forstyrret i nyre-yang-mangelsyndromet [16]. Patienter med nyre-yang-mangel har også omfattende immundysfunktion. HPA-akse dysfunktion er tæt forbundet med immundefekt. Neuroendokrin-immun netværk (NEI) teori viser, at immunsystemet og neuroendokrine systemer deler mange ligander og receptorer [17], og hypothalamus anses for at være omdrejningspunktet for at forbinde det neuroendokrine med immunsystemet.

I denne undersøgelse replikerede vi nyre-yang-mangel hos modelrotter med eksogen kortikosteroidinjektion og undersøgte mekanismen for nyre-yang-mangel som reaktion på forskellige forarbejdede produkter af Cistanche deserticola fra perspektivet af endokrin-immun funktion.

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer og reagenser

Cistanche deserticola blev indsamlet fra Alashan Neimenggu i 2019.5 og identificeret som de tørrede kødfulde stængler af Cistanche deserticola YC Ma af prof. Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Kina). Kuponprøverne blev opbevaret i Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Standardforbindelser af ajugol blev købt fra Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Kina); cistanoside F,echinacosid, cistanosid A og isoacteosidblev købt fra Must Company (Sichuan Kina); acteosid blev købt fra Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Kina). Acetonitril og methanol af MS-kvalitet blev købt fra Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Myresyre af HPLC-kvalitet blev købt fra Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Risvin blev købt fra Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, renhed > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan piller (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rotte ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 og IL-10 ELISA-detektionskit blev købt fra Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Rottecortisol-ELISA-kittet blev leveret af BOSK Co., rotte CD4-antistof, CD8a-antistof (nr. 561833 og 559976), RBC-lysat (Solarbio, R1010), PBS-bufferopløsning (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM og -actin op- og nedstrømsprimere blev leveret af Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (nr. RR037A) og cDNA Synthesis Kit (nr. 10000068167) blev leveret af Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, isopropanol, 75 % ethanol og urethan opløsninger var alle analytisk rene og produceret af Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrarent vand blev produceret af Milli-Q-systemet (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Eksperimentelle instrumenter

En enzymmarkør (Thermo, model 3530911931), automatisk pladevasker (model HBS- 4009), digital display push-pull kraftmåler (model VICTOR- 50N), højhastigheds frysecentrifuge (model Sigma 3k15 ), ultramikrospektrofotometer (model B-50Q), genforstærker (model L96G), kvantitativ fluorescens i realtid (model StepOne), flowcytometer (model AC66051710132), paraffinmikrotom (model Laika), mikroskop (Olympus , model BS-53) og et instrument til rent vand (model F7JA36507).

2.3. Forberedelse af prøver til UPLC-Q-TOF-MS og farmakologiske eksperimenter

WCD blev behandlet fra samme batch afCistanche ørkeni vores laboratorium. Til fremstilling af WCD blev tørre CD-stykker (5 mm tykke) (100 g) infunderet med risvin (30 ml), dampet ved højt tryk (1,25 kPa) i 4 timer og derefter tørret ved 55 grader.

De grove pulvere af CD og WCD blev gennemblødt i 10 gange 95 % ethanol i 0,5 time, tilbagesvalingsekstraheret 3 gange hver gang i 1 time og filtreret, og filtraterne blev kombineret 3 gange. Ethanolen blev udvundet under reduceret tryk, og ekstrakten blev opnået til administration. Ekstrakten (1 ml) blev tilsat til 50% methanol, hvilket bringer det totale volumen til 20 ml og opbevaret ved 4 grader til indholdsanalyse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Betingelser for analyse af CD- og WCD-ekstrakter

2.4.1. LCThMS analytiske forhold

UPLC-MSThMS-systemet med MassLynx 4.1 Analyst-software blev brugt til at udføre dataopsamling og -behandling. Den analytiske kolonne var en Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) ved en temperatur på 40 grader C. Den mobile fase var 0,1 % vandig myresyreopløsning (A) og acetonitril indeholdende 0,1 % myresyre (B). Elueringsgradienten var 0.00–1.00 min med 3 % B, 1,01–2.00 min med 3 %–11,5 % B, 2,01–3.{{29 }} min med 12 % B, 3,01–4.00 min. med 15 % B, 4,01–5.00 min. med 20 % B, 5,01–6.00 min. med 22 % B, 6,01–8.00 min med 25 % B og 8,01–9.00 min med 10 % B. Strømningshastigheden var 0,3 mLTh min., og injektionsvolumenet var 1,0 μL.

Waters triple quadruple massespektrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) udstyret med en elektrospray-ioniseringskilde (ESI) blev brugt i negativ ion-tilstand. Desolvationsgassen var nitrogen med en strømningshastighed på 500 LThh ved en temperatur på 250 grader. Alle detekterede forbindelser blev målt i multipel reaktionsovervågnings- (MRM)-tilstand; Tabel 1 viser energiparametrene, og tabel 2 viser kalibreringskurverne for de analyserede komponenter.

2.4.2. Fremstilling af referencestoffer

Tubulosid A (3.02 mg), echinacosid (3.00 mg), 2'-acetylacteosid (2,34 mg), acteosid (2,45 mg), isoacteosid (0,61 mg), cistanosid F ( 2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposidinsyre (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) og catalpol (2,39 mg) blev opløst i methanol til fremstilling af en stamopløsning. Stamopløsningen blev fortyndet med methanol for at opnå de passende koncentrationer for arbejdsstandardopløsningerne. Alle forberedte opløsninger blev opbevaret ved 4 grader før brug.

2.5. Forberedelse og gruppering af dyremodeller

SD-hanrotter (180-220 g) blev købt fra Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Dyretilladelsesnummer: SCXK (Liao) 2015-0001. Alle rotter blev holdt med fri adgang til mad og vand ved 25 grader og en relativ luftfugtighed på 30-50%. Dyrene blev anbragt i 7 dage før forsøgene.

Et hundrede rotter blev tilfældigt opdelt i 10 grupper: blank kontrol (BC) gruppe, model kontrol (MC) gruppe, positiv kontrol (PC) gruppe, risvin kontrol (WC) gruppe, CD højdosis (CD) -HD) gruppe, CD mellemdosis (CD-MD) gruppe, CD lavdosis (CD-LD) gruppe, WCD højdosis (WCD-HD) gruppe, WCD mellemdosis (WCD-MD) gruppe og WCD lavdosis (WCD-LD) gruppe. Doserne af CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD og CD-LDThWCD-LD var henholdsvis 5,48 gTh(kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) og 1,37 gTh(kg ∙ d). Dosis for PC-gruppen var 1,646 gTh(kg ∙ d), og for WC-gruppen 1 mLTh100 g i 40 dage. På den 6. dag efter administration blev rotterne subkutant injiceret med corticosteron-vandsuspensionen (corticosteron + 0,1% dimethylsulfoxid + 0,1% Tween-80 + 0,9% natriumchlorid) undtagen for BC-gruppen [18]. Koncentrationen af ​​corticosteron var 5 gThL, og dosis var 0,1 mLTh100 g. Rotterne i BC-gruppen fik normal saltvand + 0.1% dimethylsulfoxid + 0.1% Tween- 80 + 0.9% natriumchlorid ved injektion i den samme dosis.

2.6. Bestemmelse af HPA-aksefunktioner

2.6.1. Vægt-, temperatur- og holdekrafttest

Der blev udført en vægttest hver 3. dag, og temperaturen blev målt hver 6. dag. under forsøget. På den 39. dag blev bagbenets maksimale styrke målt med en grebsmåler. Rotterne blev placeret på glatte platforme, hvilket fik deres baglemmer til at gribe stangen. Rotterne vil instinktivt gribe enhver genstand for at forhindre bevægelse bagud, når halen trækkes, indtil trækkraften overstiger grebet. Da rotten mistede grebet, kunne forforstærkeren automatisk registrere den maksimale grebskraft.

2.6.2. Bestemmelse af niveauet af T, CRH, ACTH, CORT og Cortisol i serum

En time efter den sidste administration blev rotterne bedøvet ved intraperitoneal injektion af en urethanopløsning (20 gTh 100 ml). Derefter blev blodprøverne opsamlet, centrifugeret ved 3500 r i 15 minutter for at opnå serumet og opbevaret ved -20 grader. Koncentrationerne af T, CRH, ACTH, CORT og cortisol blev målt med rotte-ELISA-sæt i henhold til producentens instruktioner.

2.6.3. Mikroskopobservationer

Den morfologiske struktur af binyrevæv blev observeret ved HE-farvning. Binyrevæv blev fikseret i 10 % paraformaldehyd, dehydreret i ethanol, gjort gennemsigtigt med en xylenopløsning, indlejret ved konventionelle metoder, skåret i 4 μm tykke skiver, afvokset med xylenopløsning, hydreret med ethanolgradienten og derefter farvet med hæmatoxylin og eosin farvningsopløsning. Efter at være blevet gjort gennemsigtig med xylen, blev pladen forseglet med neutral gummi og observeret under et mikroskop.

2.6.4. Immunhistokemisk farvning af Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas og FasL proteinekspression i binyren

Formalinfikserede, paraffinindlejrede rottebinyreafsnit blev afparaffineret og rehydreret efter at være blevet skåret i en tykkelse på 4 μm. Til blokering af endogen peroxidaseaktivitet blev sektionerne præinkuberet i hydrogenperoxidblok i 1 0 min. Sektioner blev dyppet i 0,01 M citrat (pH 6,0) og opvarmet til kogning. Processen blev gentaget efter 5-10 min. Efter afkøling blev sektionerne vasket med PBS (pH 7,2-7,6) 1-2 gange, efterladt ved stuetemperatur i ca. 5 minutter og vasket med PBS (pH 7,2-7,6) 2-3 gange. Den 5% BSA blokerende opløsning blev tilsat ved stuetemperatur, og den overskydende væske på sektionen blev rystet af 20 minutter senere. Fortyndede primære antistoffer specifikke for FasTh FasL, Bcl-2ThBax og caspase-3 (1:100 fortyndet med PBS) blev tilsat og inkuberet ved 37 grader i 1 time eller 4 grader natten over. Sektionerne blev vasket 2-3 gange med PBS (pH 7,2-7,6). Derefter blev biotinyleret gede-anti-muse-IgG tilsat, og sektionerne blev tørret ved 20-37 grader i 20 minutter og vasket med PBS (pH 7,2-7,6) 4 gange i 5 minutter. Efter grundig vask i PBS blev sektionerne inkuberet med en blanding af reagens A og B i 30 minutter, inkuberet med PBS i 45 minutter og til sidst udviklet med DAB-substrat (DAKO) i 30 minutter før de blev let modfarvet med hæmatoxylin, dehydreret, og monteret.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FØLELSE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Bestemmelse af immunfunktioner

2.7.1. Beregning af immunorganindeks

En time efter den sidste administration blev rotterne bedøvet ved intraperitoneal injektion af urethanopløsning (20 gTh 100 ml), og derefter blev milten og thymuskirtlen fjernet og vejet straks i en steril hætte. Vægtkoefficienterne for milten eller thymus (%) � milt- eller thymusvægt (mg) Kropsvægt (g).

2.7.2. Påvisning af T-lymfocytundergrupper i perifert blod

Splenocytter og hæmocytter blev inkuberet med de monoklonale antistoffer anti-CD4 (PE) og anti-CD8 (FITC) i 30 minutter i mørke. 2 ml erytrocytlysat blev tilsat, og opløsningen blev blandet ved vortexing. Opløsningen blev efterladt i mørke i 10 minutter og centrifugeret i 5 minutter. Supernatanten blev kasseret, og derefter blev opløsningen vasket 3 gange med iskold PBS og resuspenderet i PBS permeabiliserende opløsning. Mindst 10,000 celler blev analyseret ved flowcytometri inden for 1 time efter hver Mab-farvning.

2.7.3. Bestemmelse af niveauet af IL-10, IL-6, IL-2, TNF- og IFN-c i serum

En time efter den sidste administration blev rotterne bedøvet ved intraperitoneal injektion af urethanopløsning (20 gTh 100 ml), og blod blev taget fra abdominal aorta. Blodet blev centrifugeret ved 3500 r i 15 minutter for at opnå serumet og opbevaret ved -20 grader. Koncentrationerne af IL-10, IL-6, IL-2, TNF- og IFN-c blev påvist med rotte-ELISA-kits i henhold til producentens instruktioner.

2.8. Ekspression af CaM i Hypothalamus og Hypofysevæv

Total RNA blev ekstraheret fra hypothalamus- og hypofysevævet med TRIzol. Omvendt transkription blev udført på 10 μL totalt RNA i henhold til producentens instruktioner. Lige store mængder cDNA blev analyseret via qPCR i nærværelse af dsDNA-bindende farvestof (Promega, USA) og CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, USA) for at se på de forskellige gener under betingelserne for initial aktivering kl. 95 grader i 10 minutter, 40 cyklusser af denaturering ved 95 grader i 15 s, og annealing forlængelse ved 60 grader i 1 min.

Primere for CaM og -actin er angivet i tabel 1, og -actin blev brugt som en intern kontrol. Hver prøve blev normaliseret ved at bruge forskellen i kritiske tærskler (Ct) mellem målgenet og -actin. Følgende ligning blev brugt til at beskrive resultatet: ΔΔCt � (Ct-målgen − Ct-actingen) eksperimentel gruppe − (Ct-målgen − Ct-aktingen) kontrolgruppe. mRNA-niveauerne for hver prøve blev derefter sammenlignet under anvendelse af ekspressions-2- ΔΔCt-målgenet. Der blev beregnet et gennemsnit af resultaterne for hver gruppe (tabel 3).

2.9. Statistisk Analyse

Alle data blev analyseret ved hjælp af SPSS-software (version 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Forskelle mellem grupper blev analyseret med en-vejs variansanalyse med gentagne foranstaltninger (ANOVA). Resultaterne blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD) ved hjælp af GraphPad Prism-software (version 6.0, San Diego, CA, USA). Forskelle med en P-værdi mindre end 0.05 blev betragtet som statistisk signifikante.

3. Eksperimentelle resultater

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalyse

For at opnå den bedste adskillelse, topform og en kort analysetid blev de kromatografiske forhold, herunder søjle, mobil fase og gradientprogram undersøgt i vores foreløbige eksperiment. De typiske kromatogrammer med MRM-tilstand er vist i figur 1.

Fra tabel 4 kan vi se, at indholdet af phenylethanoidglycosider i WCD steg sammenlignet med CD, især for echinacosid og acteosid, mens indholdet af iridoider var faldet i WCD.

3.2. Regulering for HPA-aksefunktion

3.2.1. Vægt-, temperatur- og holdekrafttest

Rotterne i MC-gruppen og eksperimentelle grupper viste nyre-yang-mangelsymptomer gradvist efter at have fået kortikosteron. Symptomerne, såsom vægttab, hypotermi, tab af hårglans, hængende ånd, forsinkelse i respons og et signifikant fald i vandforbrug og aktivitet, forbedredes meget i CD- og WCD-grupperne. Figur 2(a) viser vægtændringerne. Vægten af ​​hver af lægemiddelgrupperne steg, især i CDHD- og WCD-HD-grupperne. Vægtforøgelsen i MC-gruppen var den laveste. Figur 2(b) viser temperaturændringerne, som var de laveste i MC-gruppen, og temperaturen steget i WCD-HD-, WCD-MD- og WCD-LD-grupperne.

Figur 2(c) viser, at holdekraften steg for BC-gruppen og hver af forsøgsgrupperne, og WCD-MD-gruppen var den højeste, hvilket viste, at tegn på svaghed induceret af nyre-yang-mangel blev forbedret efter administration.

3.2.2. Niveauer af T, CRH, ACTH, CORT og Cortisol

Figur 3 viser, at sammenlignet med dem i BC-gruppen faldt niveauet af T, CRH, ACTH og CORT i rotteserum (P < 0.01) og kortisolniveau faldt (P < 0.05) i MC-gruppen. Sammenlignet med dem i MC-gruppen steg niveauet af T i WCD-HD- og WCD-MD-grupperne (P < 0.01), niveauet af CRH i WCD-LD, WCD-MD- og WC-grupperne blev forbedret (P < 0.01), indholdet af ACTH steg i CD-HD-, WCD-MD- og WCD-HD-grupperne (P < 0.01), CORT-niveauet blev opgraderet i CD-MD-, WCD-MD- og WCD-HD-grupperne (P < 0,01) og forstærket i CDHD- og WCD-LD-grupperne (P < 0,05), og cortisolniveauet steg i hver af lægemiddelgrupperne.

3.2.3. Resultater af mikroskopobservation

Binyrevæv kan opdeles i det kortikale lag og medullalaget. De kortikale lag omfatter kugleformede, bundte- og retikulære lag. Cellerne indeholder flere lipider, og medullalaget består for det meste af fæokromocytomceller og en lille mængde fibrøst væv. Som vist i figur 4 fandt vi, at alt var normalt i BC-gruppen, mens binyrebarken i MC-gruppen havde tydelig hyperplasi, cellulær atrofi og stigende tæthed. Den løgformede strimmel blev tykkere, og den gennemskinnelige fascikulære zone, smalle zona reticularis og mindre celler viste ujævn farve og kapillær overbelastning. I PC-gruppen var de kortikale og medullære grænser synlige. Cellerne i de kugleformede og bundte bånd var arrangeret jævnt, og den morfologiske struktur var blevet genoprettet. Den samme bedre restaurering blev observeret i WCD-grupperne, og virkningerne i WCD-MD-gruppen var bedre end i WCD-HD- og WCD-LD-grupperne. Morfologien af ​​binyrerne i CD-grupperne var ikke så god som i WCD-grupperne.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%