Undersøgelse af Calcitriols anti-aldringseffekter på menneskelige naturlige dræberceller in vitro Ⅱ

3. Resultater

Denne undersøgelse fokuserede på anti-aldringseffekterne af calcitriol på NK-celler. Resultaterne viste, at Calcitriolreducerede ekspressionen af ​​aldringsrelaterede biomarkører inklusive CD16, TIM3, PD-1, KIR ogøgede ekspressionen af ​​NKG2A af NK-celler. det ogsåhæmmet NK-celleproliferationogarrestere dem i G1-fasen. Calcitriolnedsat frigivelse af inflammatoriske faktorersåsom IL-5, IL-13, IFN- og TNF- og havde visseantioxiderende virkninger, som kunne bidrage til densanti-aging effekter.

Klik her for at kende Cistanche-antioxidationseffekter og få en prøve

3.1 Calcitriol vendte ekspressionen af ​​overfladeældningsmarkørerne, sænkede NK-celleamplifikationen og opretholdt NK-celler i G1-fasen.

Ældrende NK-celler viste høj ekspression af aldringsrelaterede biomarkører, såsom CD16, PD-1, TIM3 og KIR, og lav ekspression af NKG2A. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af de aldringsrelaterede biomarkører NKG2A (Figur 1a) (*P < 0.05) steg, mens ekspressionen af ​​CD16 (Figur 1b), TIM3 (Figur 1c) ), PD-1 (Figur 1d) og KIR (Figur 1e) (*P < 0,05) blev reduceret efter behandling med calcitriol i 72 timer. Reverseringseffekterne var positivt korreleret med koncentrationen af ​​calcitriol (Supplerende figur 1).

Vi udvidede celler fra humane perifere blodprøver in vitro. Derefter isolerede vi NK-cellerne (CD{{0}}CD56 plus ) ved magnetisk perlesortering (figur 1f). De sorterede NK-celler blev derefter dyrket med forskellige koncentrationer af calcitriol eller rapamycin i 72 timer. CCK8-farvningsresultater viste, at væksthastigheden af ​​de calcitriolbehandlede NK-celler med høj koncentration (10- [7] M) var langsommere end den for den negative kontrolgruppe (NC) (*P < {{17 }}.05) (Figur 1g). Derudover regulerede calcitriol NK-cellecyklussen. Efter behandling med calcitriol i 48 timer viste NK-celler et højt calcitriolkoncentrationsafhængigt skift mod G1-fasen (*P < 0,05), mens andelen af ​​celler i G2-fasen (#P < 0,05) faldt. Andelen af ​​calcitriol-behandlede NK-celler i S-fasen viste ingen ændring, uanset koncentrationen af ​​calcitriol (Figur 1h, Supplerende Figur 2). Vi testede derefter, om denne calcitriol-afledte G1-fasestop inducerede NK-celle-apoptose og fandt, at den NK-celle-apoptotiske biomarkør, T-celle-immunoglobulin og immunoreceptor-tyrosin-baseret inhibitorisk motiv (ITIM) domæne (TIGIT), ikke viste nogen signifikant ændring (P > 0,05) NS) (figur 1i). Disse resultater indebar, at tilsætningen af ​​calcitriol reducerede væksthastigheden af ​​NK-celler, reducerede deres proliferation og inducerede G1-fasestop af NK-cellerne i stedet for at forårsage apoptose.

3.2 Calcitriol reducerede frigivelsen af ​​inflammatoriske cytokiner i NK-celler og hæmmede NK-cellers cytotoksicitet

Inflammation er en kronisk lavgradig inflammation. Det fremskynder aldring af NK-celler, da NK-celler deltager i denne kroniske inflammation. Figur 2a viser, at niveauerne af IL-5, IL-13, IFN- og TNF- faldt signifikant i alle grupper end i den negative kontrol (*P < 0.05). IFN- og TNF- er velkendte pro-inflammatoriske cytokiner, men nogle undersøgelser har også vist de pro-inflammatoriske egenskaber af IL-5. IL-13 er blevet rapporteret at bidrage til forskellige typer slimhindebetændelse, såsom allergisk astma, colitis ulcerosa, eosinofil esophagitis og adskillige sygdomme relateret til fibrose.

Imidlertid involverer cytotoksiciteten af ​​NK-celler hovedsageligt frigivelse af inflammatoriske cytokiner og degranulering af celler. Vi mærkede K562-celler med DIO og co-dyrkede DIO-K562-cellerne med calcitriol-behandlede NK-celler i 4 timer. Procentdelen af ​​DIO plus PI plus celler var lavere i alle effektor (E)/mål (T) forholdsgrupper end i den negative kontrol (*P < 0.05) (Figur 2b, c). Den udledte ekspression af klynge af differentiering 107 (CD107) indikerede lavere degranulering (*P < 0,05) (figur 2d). Disse resultater viser inhiberingen af ​​den NK-dræbende funktion af calcitriol.

3.3 Calcitriol aktiverede ekspressionen af ​​SIRT1- ∆Exon8 og anti-aging-relateret SIRT1/pERK-vej

For at undersøge anti-aldringseffekterne af calcitriol på NK-celler detekterede vi de aldringsrelaterede signalveje ved immunblotting. Western blotting-analyse blev udført for at vurdere ekspressionsniveauerne af VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 og PERK i de calcitriolbehandlede NK-celler. Statistisk analyse viste, at calcitriol aktiverede VDR/SIRT1/pERK-aksen ved høje koncentrationer. I mellemtiden aktiverede calcitriol ekspressionen af ​​SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Figur 3a).

Figur 1. Aldringsrelateret fænotype, celleudvidelse og cellecyklusanalyse af NK-celler. (ae) De humane NK-celler behandlet med calcitriol eller rapamycin i 72 timer viste følgende cellebiomarkører: naturlig dræbergruppe 2 medlem A (NKG2A), klynge af differentiering 16 (CD16), T-celle immunoglobulin og mucin domæne-holdigt protein 3 ( TIM3) programmerede celledød-1 (PD-1) og dræber immunoglobulin-lignende receptor (KIR), som var relateret til aldring. 50 nM rapamycin (RAPA) blev brugt som positiv kontrol. n=3 for hver gruppe. *P < 0.05 og **P < 0.01 blev sammenlignet med den negative kontrolgruppe (NC). (f) NK-celler (højre) isoleret fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er, venstre) ved magnetisk perlesortering. (g) Celleproliferationsanalyse målt ved celletællingskit 8 (CCK8). (h) Virkning af calcitriol eller rapamycin på cellecyklus i sorterede nk celler efter behandling i 72 timer, wp 0.0, 0.05 og fp < 0.05 indikerede den signifikante forskelle i henholdsvis G1-, S- og G2-faserne. Alle grupperne blev sammenlignet med hhv. NC. n=3. ) Procentdelen af ​​T cellimmunoa globulin og immunoreceptor tyrosin-baseret hæmmende motiv(M) domæne (TGI)-positive NK celler efter behandling med calcitriol eller rapamycin i 72 timer.*p < 0,05 og **p < 0,01 blev sammenlignet med NC. n=3.

3.4 Calcitriol modstod ældningen af ​​NK-celler induceret af oxidativt stress in vitro

Det er almindeligt accepteret, at aldring er forårsaget af ophobning af oxidative skader på grund af den store mængde beviser fundet gennem årene [31]. Vi dyrkede NK-cellerne med forskellige koncentrationer af H2O2 i 24 timer og fandt ud af, at 1{{1{{20}}}}0 μM var den koncentration, der var tættest på den gennemsnitlige dødelige dosis (LD50) (figur 3b) . Ekspressionen af ​​TIM3 i NK-cellepopulationen steg ved tilsætning af H2O2, mens ekspressionen faldt efter behandling med calcitriol (*P < 0,05) (figur 3c). Derudover blev aldrende NK-celler farvet blå i nærvær af -galactosidase. Denne blå farve af cellerne er et specifikt kendetegn for senescent celler. Statistisk analyse viste, at ubehandlede NK-celler har mindre cellulær -galactosidase-aktivitet, mens NK-celler udsat for H2O2 udviste forhøjet galactosidaseaktivitet. Calcitriol reducerede den - galactosidase-positive population, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​færre aldrende celler (*P < 0,05) (figur 3d). Nedsat mitokondriemembranpotentiale er også blevet observeret i en række aldrende celler fra flere pattedyrarter. Vi evaluerede mitokondriemembranpotentialet for NK-cellerne i denne undersøgelse. De statistiske resultater viste, at H2O2 reducerede den cellulære aktivitet af NK-celler signifikant sammenlignet med den af ​​de ubehandlede celler, mens calcitriol øgede skaden forårsaget af H2O2 (*P < 0,05) (Figur 3e).

Figur 2. Virkninger af calcitriol på NK-cellernes funktioner. (a) Analyse af cytokinet frigivet af de calcitriol-behandlede NK-celler i 48 timer. b) Resultater af fluorescensaktiveret celsortering (FACS) viste døde K562-celler mærket af 3,3 -octadecyl-oxacarbocyaninDlO) og propidiumiodid (P). K562-celler blev dyrket sammen med forskellige forhold mellem calcitriol-behandlede Nk-celler i 4 timer. (C) FACSinalyse af døde K562-celler i drabsassays. (d) Degranuleringsvirkningerne af behandlede Nk-celler i drabsassays. n=3 for eaciyroup. *p < 0.05 og **p < 0,01 blev sammenlignet med NC

3.5 Calcitriol modstod apoptose af NK-celler induceret af oxidativt stress in vitro

Dernæst målte vi antallet af apoptotiske celler. Flowcytometriresultaterne viste, at behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer førte til signifikant apoptose af NK-cellerne. Imidlertid reducerede behandling med calcitriol det apoptotiske forhold (*P < 0,05) (figur 4a). Alle ovenstående resultater demonstrerede calcitriols modstand mod oxidativ stress forårsaget af H2O2. Imidlertid opdagede vi apoptotiske proteiner i NK-celler under oxidativt stress. Før behandling med H2O2 blev 10- [7] M calcitriol tilsat til NK-cellerne i 24 timer. Niveauerne af apoptose-relaterede proteiner, caspase-3 p17 og caspase-3 p20, steg signifikant efter behandling med H2O2. Calcitriol reducerede H2O2-afledt apoptose og nedregulerede ekspressionen af ​​caspase-3, p17 og caspase-3 p20 (*P < 0,05) (figur 4b). Disse resultater indikerede, at calcitriol modstod apoptose induceret af H2O2.

Figur 3. Denanti-aging effekteraf calcitriol på NK-celler. (a) Ekspressionen af ​​vitamin D-receptoren (VDR), sirtuin 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 og proteinkinase R-lignende endoplasmatisk reticulum kinase (pERK) i NK-celler blev påvist ved western blotting-analyse efter behandling med calcitriol i 48 timer. Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som ladningskontrol. Søjlediagram, der illustrerer resultaterne af Western blotting (n=3). *P < 0.{{10}}5 og **P < 0.01 blev sammenlignet med NC (n=3). (b) Dosisdødelighedskurve for NK-celler efter behandling med hydrogenperoxid (H2O2) i 24 timer. (c) Procentdel af TIM3-celler, der udviser høj ekspression efter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. (d) De senescens-associerede -galactosidase-farvning og analyseresultater. De senescerende celler blev farvet med blåt og angivet med røde pile. Målestok, 50 μm. (e) NK-celler blev farvet med Hoechst og Chloromethyl-X-Rosamine (CMXRos) for at bestemme celleplaceringen og mitokondrielle membranpotentiale. De aldrende og apoptotiske celler var Hoechst plus CMXRos- og angivet med hvide pile. Målestok, 50 μm. Statistisk analyse viste relativ fluorescensintensitet. *P < 0,05 og **P < 0,01 blev sammenlignet med H2O2-gruppen i figur C, D og E (n=3).

Figur 4. De anti-apoptotiske virkninger af calcitriol på NK-celler. (a) Anti-apoptotiske virkninger af calcitriol i H2O2-induceret skade. FACS-analyse viste procentdelen af ​​apoptotiske NK-celler efter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. (b) Ekspressionsniveauerne af caspase-3 p20 og caspase-3 p17 i NK-celler blev påvist ved western blotting-analyse efter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. GAPDH blev brugt som belastningskontrol. Søjlediagram, der illustrerer resultaterne af Western blotting (n=3). *P < 0,05 blev sammenlignet med H2O2-gruppen.

4. Diskussion

Den langsigtede interaktion mellem inflammation og oxidativ stress er en vigtig faktor i aldring. Derudover er inflammation og oxidativt stress synergistiske [32]. Overskydende ROS genereret af oxidativt stress angriber kroppens celler. Under denne proces frigives inflammatoriske faktorer af det aktiverede immunsystem for at dræbe de unormale celler, hvilket fører til yderligere ROS-generering. Mangel på calcitriol kan forårsage autoimmune sygdomme, kroniske stofskiftesygdomme og tumorer. Der er dog lidt kendt om calcitriols anti-aldringseffekt på immunsystemet, især på NK-celler.

I denne undersøgelse undersøgte vi anti-aldringseffekterne af calcitriol på NK-celler. Vi fandt, at calcitriol øgede ekspressionen af ​​NKG2A, mens den mindskede ekspressionen af ​​KIR in vitro. CD56−CD16 plus subpopulationen af ​​NK-celler, som vides at være relateret til kronisk inflammation, er signifikant øget hos ældre [33]. Derfor kan reduktionen i CD16-ekspression induceret af calcitriol tilskrives dets anti-inflammatoriske virkning. TIM-3 og PD-1 er blevet rapporteret at være de hæmmende og depletionerende receptorer af NK-celler. Vores undersøgelse viste, at cal citriol nedregulerede ekspressionsniveauerne af TIM-3 og PD-1 og forhindrede apoptose af NK-celler.

Derudover hæmmede calcitriol udvidelsen af ​​NK-celler og opretholdt NK-cellepopulationen i G1-fasen in vitro. Cellerne i S-fasen blev dog ikke påvirket. TIGIT, som er kendt som en checkpoint-faktor for NK-celler, forblev uændret. Disse resultater indikerede, at Figur 4. De anti-apoptotiske virkninger af calcitriol på NK-celler. (a) Anti-apoptotiske virkninger af calcitriol i H2O2-induceret skade. FACS-analyse viste procentdelen af ​​apoptotiske NK-celler efter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. (b) Ekspressionsniveauerne af caspase-3 p20 og caspase-3 p17 i NK-celler blev påvist ved western blotting-analyse efter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. GAPDH blev brugt som belastningskontrol. Søjlediagram, der illustrerer resultaterne af Western blotting (n=3). *P < 0,05 blev sammenlignet med H2O2-gruppen. BIOENGINEERET 6851calcitriol førte ikke til NK-cellers død, men det bremsede kun hastigheden af ​​NK-celleudvidelse.

Det er velkendt, at inflammation fører til immunosenescens [34,35]. Desuden fandt vi, at calcitriol reducerede niveauerne af IL-5, IL-13, IFN- og TNF- i NK-celler. NK-cellers cytotoksicitet er delvist medieret af frigivelsen af ​​inflammatoriske faktorer [36]. Desuden var der et fald i dødeligheden af ​​K562-tumorceller og degranulering af NK-celler. Disse resultater var i overensstemmelse med vores forventninger. Rapamycin er et velkendt lægemiddel, der reducerer stofskiftet for at forhindre aldring[37], som bruges som den positive kontrol i denne undersøgelse. Det resulterer i immunsuppression og øger den potentielle risiko for tumor- og tumorbyrde. Denne byrde er blevet bekræftet i musemodeller af brystkræft [38]. Hvorvidt calcitriol udviser lignende virkninger som rapamycin er stadig ukendt. Flere dyre- og kliniske undersøgelser bør udføres for at verificere deres virkninger i den menneskelige krop.

Til sidst undersøgte vi virkningerne af calcitriol på antioxidantældning. Resveratrol, et velkendt lægemiddel mod aldring, kan nedregulere NF-KB-vejen ved at aktivere SIRT1/PERK-aksen. Denne nedregulering har også vist sig at være gavnlig ved neurodegenerative lidelser og kardiovaskulære sygdomme [39]. SIRT1-deacetylering er forbundet med metabolisk kontrol og mitokondriel biogenese. I denne type regulering kan forhøjede SIRT1-niveauer fremme akkumuleringen af ​​peroxisomproliferatoraktiveret receptor-gamma-coactivator-1 alfa (PGC-1) i kernen, hvilket resulterer i transskription af gener, der er nødvendige for mitokondriefunktion [40]. Desuden undertrykker SIRT1 pattedyrsmålet for rapamycin (mTOR) signalvejen, som kan beskytte nerverne og modstå hjernealdring hos mus [41]. I denne undersøgelse identificerede vi en lignende regulatorisk vej for calcitriol. Calcitriol aktiverede SIRT1 via VDR og hævede SIRT1/pERK-aksen.

Derudover fandt vi, at calcitriol opregulerede ekspressionen af ​​SIRT1-∆Exon8. Spændinger er kendt som en opregulerende faktor for SIRT1-∆Exon8. Selvom SIRT1-∆Exon8 selv viser reduceret p53-deacetyleringsaktivitet, udøver det en additiv deacetyleringseffekt på p53, når det udtrykkes sammen med SIRT1 i fuld længde [42]. Denne effekt indikerede den anti-apoptotiske funktion af calcitriol på NK-celler. Rollen af ​​SIRT1-∆Exon8 i aldersrelaterede veje mangler dog at blive bedre forstået. Da faldet af SIRT1 kan skyldes oxidativ skade [43], etablerede vi en akut aldrende NK-cellemodel in vitro ved hjælp af H2O2. Den oxidative aldring induceret af H2O2 øgede ekspressionen af ​​TIM3 såvel som aktiviteten af ​​-galactosidase i NK-celler. Vi fandt ud af, at calcitriol modstod oxidativ skade og opretholdt mitokondriel aktivitet og cellelevedygtighed af NK-celler, mens det forhindrede celleapoptose. Calcitriol er dog endnu ikke blevet identificeret som et anti-aldringslægemiddel i klinisk medicin, da der er behov for mere dokumentation vedrørende anti-aging virkningerne af dette lægemiddel in vivo. Sammenfattende leverede vi foreløbige beviser for at implicere anti-aldringseffekterne af calcitriol på NK-celler in vitro. Vi mener, at virkningerne af dette lægemiddel bør undersøges yderligere i fremtidige dyre- og kliniske undersøgelser.

5. Konklusion

I denne undersøgelse demonstrerede vianti-aging effekteraf calcitriol på NK-celler. Calcitriol vendte udtrykket afaldrende biomarkørerpå NK-celler. Det bremsede NK-amplifikationen og holdt dem i G1-fase. Derudover hæmmede calcitriol frigivelsen af ​​inflammatoriske cytokiner og nedregulerede degranulering af NK-celler. Aktivering af SIRT1-∆Exon8 og VDR/SIRT1/pERK-aksen med calcitriol kan være hovedmekanismen for calcitriol-anti-aldringseffekt baseret på alt ovenfor. Endelig modstod calcitriol den oxidative senescens af NK-celler in vitro. Yderligere undersøgelser bør fokusere på dyre- og klinisk forskning.

Højdepunkter

(1) Calcitriol reducerede ekspressionen af ​​aldersrelaterede biomarkører inklusive CD16, TIM3, PD-1, KIR og øgede ekspressionen af ​​NKG2A af NK-celler. (2) Calcitriol var i stand til at hæmme NK-celleproliferation og standse dem i G1-fasen. (3) Calcitriol reducerede frigivelsen af ​​større inflammatoriske faktorer såsom IL-5, IL-13, IFN- og TNF- af NK-celler.(4) Calcitriols anti-aldringseffekt på NK-celler kan opnås gennem Sirt1- pERK-signalvejen.

Tak Vi vil gerne takke alle medarbejdere i vores gruppe for deres støtte og Shenzhen Science and Technology Innovation Committee for deres støtte til denne undersøgelse.

Finansiering Dette arbejde blev økonomisk støttet af Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (JCYJ20170412155231633), Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (nr. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech og Sanming Project of Medicine i Shenzhen (nr. SZSM202011010); Shenzhen Science and Technology Innovation Committee [JCYJ20170412155231633]; Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund [Nr. SZXK062]; Sanming Project of Medicine i Shenzhen [Nr. SZSM202011010].

Etisk godkendelse Alle procedurer blev godkendt af den etiske komité på Shenzhen Luohu People's Hospital (ZLNK 12/2019, Shenzhen, Kina). Der blev opnået informeret samtykke til eksperimentering med prøver fra mennesker.

Oplysningserklæring Alle forfattere godkendte indsendelsen af ​​dette manuskript. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige relationer, der kunne have påvirket det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Referencer

[1] Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, et al. Nedsat immunovervågning fremskynder ophobningen af ​​ældningsceller og ældning. Nat Commun. 2018;9 (1):5435.

[2] López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, et al. Aldringens kendetegn. Celle. 2013;153:1194-1217.

[3] Hodgins JJ, Khan ST, Park MM, et al. Killers 2.0: NK-celleterapier på forkant med kræftkontrol. J Clin Invest. 2019;129(9):3499-3510.

[4] Zhu H, Blum RH, Bjordahl R, et al. Pluripotente stamcelle-afledte NK-celler med højaffinitet ikke-spaltelig CD16a medierer forbedret antitumoraktivitet. Blod. 2020;135(6):399-410.

[5] Mandal A, Viswanathan C. Naturlige dræberceller: i sundhed og sygdom. Hematol Oncol Stamcelle Ther. 2015;8(2):47–55.

[6] Le Garff-Tavernier M, et al. Humane NK-celler viser store fænotypiske og funktionelle ændringer i løbet af levetiden. Aldrende celle. 2010;9(4):527-535.

[7] Le Garff-Tavernier M, Béziat V, Decocq J, et al. Ekspressionsmønstre for NKG2A, KIR og CD57 definerer en proces med CD56dim NK-celledifferentiering ukoblet fra NK-celle uddannelse. Blod. 2010;116 (19):3853-3864.

[8] Manser AR, Uhrberg M. Aldersrelaterede ændringer i naturlige dræbercellerepertoirer: indvirkning på NK-cellefunktion og immunovervågning. Cancer Immunol Immunother. 2016;65(4):417–426. [9] Bi J, Tian Z. NK Celleudmattelse. Front Immunol. 2017; 8:760.

[10] Furman D, Campisi J, Verdin E, et al. Kronisk betændelse i sygdommens ætiologi over hele levetiden. Nat Med. 2019;25(12):1822-1832.

[11] Liu Y, et al. Et cytomegalovirus-peptid-specifikt antistof ændrer naturlig dræbercelle-homeostase og deles i flere autoimmune sygdomme. Celleværtsmikrobe. 2016;19(3):400–408.

[12] Campus X, Pera A, Solana R, et al. NK-celler i sund aldring og aldersrelaterede sygdomme. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:195956.

[13] Liu Y, Mu R, Gao YP, et al. Virkning af aldring på nk-cellepopulation og deres proliferation ved ex vivo kulturtilstand. Analcellepatol (Amst). 2018;2018:7871814.

[14] Sintov AC, Yarmolinsky L, Dahan A, et al. Farmakologiske virkninger af vitamin D og dets analoger: seneste udvikling. Drug Discov i dag. 2014;19 (11):1769-1774. [15] Halicka HD, Zhao H, Li J, et al. Dæmpning af konstitutiv DNA-skade signalering ved

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950