Strukturel karakterisering af Cistanche Deserticola polysaccharid og dets beskyttende virkning på høj glukoseinduceret HK -2 celleskade

1.2.5.8 Påvisning af mitokondrisk membranpotentiale

Hk -2 celler blev inokuleret i 6- godt plader og dyrket. Efter den tilsvarende stimulering blev kulturmediet i 6- brøndpladerne aspireret, og en stærk positiv kontrolgruppe (POS) blev tilføjet til gruppen under "1.2.5.6". Skyl en gang med PBS, tilsættes 1 ml cellekulturmedium og 1 ml JC -1 farvningsopløsning blev blandet grundigt og placeret i en cellekulturinubator i mørke i 20 minutter. Cellerne blev vasket to gange med JC -1 farvningsbuffer (1 ×), og billeder blev opsamlet under anvendelse af et fluorescensmikroskop.

 

 

 

 

Cistanche fordele

 

1.2.5.9 Hoechst33258 Metode til påvisning af celle -apoptose

Cellesglassene blev anbragt i 6- godt plader, og HK -2 celler i den logaritmiske vækstfase blev podet i 6- godt plader ved en celletæthed på 1 × 105 celler/brønd. Efter den tilsvarende lægemiddelintervention blev Hoechst33258 -farvningssættet anvendt til farvning. Celle -apoptose blev påvist, og billeder blev opsamlet under anvendelse af et fluorescensmikroskop.

 

1.2.5.10 Western blotting for at opdage

Ekspressionen af ​​proteiner relateret til TLR4/NF-KB-signalvejen blev analyseret ved gruppering og behandling af cellerne i henhold til metoden under "1.2.5.6". Derefter blev det samlede protein i cellerne ekstraheret i henhold til instruktionerne fra proteinekstraktionssættet. Proteinkvantificering blev udført under anvendelse af Bicinchoninsyre (BCA) proteinkvantificeringsmetode, og proteinet blev denatureret og opbevaret i en -20 grad køleskab.
10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), polyvinyliden fluorid (PVDF) membranoverførsel, læg membranen i Tris-indeholdende tween -20 buffer
Cellerne blev inkuberet i et Tris -bufret saltvand med tween -20 (TBST) kammer og blokeret ved stuetemperatur. Primære antistoffer mod TLR4, NF-KB P65, P-NF-KB P65 og -Actin var vant tilRegistrer nyrvævet(Antistoffer blev fortyndet til TBST -opløsning i et volumenforhold på 1: 2000) ved 4 grader natten over. Tbst
Membranen blev fortyndet med sekundært antistof (antistof og TBST -opløsning blev fortyndet med et volumenforhold på 1: 2000) og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efter vask af membranen 3 gange med TBST blev ECL -luminescerende reagens tilsat til påvisning, og proteinekspression blev detekteret ved gelafbildning. Image J -software blev brugt til at analysere proteingråskalaværdien med -actin som den interne reference.

1.3 Databehandling

SPSS 23. 0 og GraphPad Prism 6.01 Software blev brugt til dataanalyse. Shapiro-Wilk-test blev anvendt til at teste normaliteten af ​​prøvedata, og brun-til-porythe eller Bartlett's test blev anvendt til at teste homogeniteten af ​​variansen af ​​prøvedata. Måledataene med normal fordeling og homogenitet af varians blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. (x ± s) indikerer beskrivelse, envejs ANOVA blev anvendt til test, og Dunnett's metode blev anvendt til parvis sammenligning, hvis statistisk signifikant.
Til sammenligning af parvise parvise parvise af ulige afvigelser blev Dunnett's T3 -metode anvendt, med p <0. 0 5, der indikerede en statistisk signifikant forskel, og p <0,01, hvilket indikerer en signifikant forskel mellem de to grupper.

2 resultater og analyse

2.1 Bestemmelse af total sukker, uronsyre og proteinindhold i CDP'er

Den lineære regressionsligning af polysaccharidindhold var: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Eksperimentet viste, at der mellem 7 og 70 ug/ml var et godt lineært forhold mellem standard glukosekoncentrationen (X) og absorbansværdien (Y). Den beregnede procentdel af polysaccharidindhold i prøven er: 81,02%.
Den lineære regressionsligning af standard uroninsyre er: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Eksperimentet viste, at der mellem 20 og 100 ug/ml var et godt lineært forhold mellem standard uronsyrekoncentration (X) og absorbansværdien (Y). Uronsyreindholdet i prøven er: 4,43%.
Den standardprotein lineære regressionsligning er: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Eksperimentet viste, at mellem 20 og 1 00 µg/ml var der et godt lineært forhold mellem standardproteinkoncentrationen (X) og absorbansværdien (Y). Proteinindholdet i prøven er: 4,00%.

 

2.2 Molekylvægtfordeling af CDP'er

Molekylvægten af ​​CDP'er blev bestemt ved høj ydeevne gelpermeationskromatografi tandem -søjldetektion. Med RT AS (X) og LGMP AS (Y) blev ligningen af ​​LGMP-RT-kalibreringskurve beregnet som: Y=-0. 1951x + 11. 661, R² {{5}. 9956; RT er (x), LGMW er (y), LGMW-RT-kalibreringskurve-ligningen er: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; RT er (x), lgmn er (y), LGMN-RT-kalibreringskurven ligningen er: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Baseret på standardkurven opnås beregningsformlen for at beregne molekylvægt af hver prøve. Prøvens molekylvægtsspektrum er som følger, og beregningsresultaterne er vist i tabel 2. Resultaterne viste, at CDP'er havde flere elueringstoppe, og den molekylære vægt af polysaccharider blev hovedsageligt fordelt mellem 3 og 8 kDa, som var en heterogen lille molekylær vægt heteropolysaccharid. Som vist i figur 1.

 

 

2.3 CDPS Monosaccharid -sammensætning

CDP'er blev analyseret ved ionkromatografi, og kromatogrammet er vist i figur 2. Resultaterne viste, at sammenlignet med retentionstiden for 16 monosaccharidstandarder blev 5 monosaccharider påvist i CDP'er. Ved at sammenligne spektrene med dem fra monosaccharidstandarder var CDP'er hovedsageligt sammensat af glukose, galactose, rhamnose, mannose og saccharose. , Arabinose. Molforholdet er 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0,0255: 0,0178. Fra molforholdet kan det ses, at CDP'er hovedsageligt er sammensat af glukose, galactose og rhamnose. Blandt dem tegner glukose sig for 73,405%, galactose tegner sig for 5,381%, og Rhamnose tegner sig for 5,02%.

 

Bemærk: Man.mannose, Glc N.Glucosamine hydrochlorid, rha.rhamnose, glc-uA.glucuronsyre, gal-uA.galacturonsyre, gal n.galactosamin hydrochlorid, glc.glucose, gal.galactose, xyl.xylose, ara. Arabinose, fuc.fucose.

2.4 CDPS Fourier infrarød analyse

Toppen i nærheden af ​​3246 cm -1 er forårsaget af OH -strækningsvibrationen af ​​hydroxylgruppen, absorptionstoppen nær 2900 cm -1 er ch -strækningen vibrationstop af -ch3, og absorptionstoppen ved 1594 cm -1 er C {{{{{{{=}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}} oT hvilket indikerer, at CDPS-tilstedeværelse af uronsyre, 1374,31 cm -1: denne absorptionstop kan være relateret til deformationsvibrationen af ​​CH-bindinger, især i methyl (-ch3) eller methylen (-h 2-) grupper af polysaccharider. Absorptionstoppen ved 1018,38 cm -1 kan være relateret til strækningsvibrationen af ​​CO -bindingen, som ofte findes i etherbindingerne eller esterbindingerne af polysaccharider. Tre svage absorptionstoppe i området 1200-1000 cm -1 angiver tilstedeværelsen af ​​pyranose i CDP'er. Absorptionstoppene ved 870 og 930 cm -1 indikerer, at -type glycosidiske bindinger kan eksistere i CDP'er. Se figur 3.

 

2,5 Toksiske effekter af CDP'er på normale HK -2 celler

Sammenlignet med CON, 24 timer efter administration, begyndte celleviabiliteten at falde markant, efter at CDPS -koncentrationen nåede 1000 ug/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Diskussion og konklusion

Polysacchariderer polymerer med høj molekylvægt sammensat af mere end 10 monosaccharider. Det er rapporteret, at polysaccharider harImmunmodulerende, antioxidant, antiinflammatoriske og hypoglykæmiske effekter[15]. Som et af de vigtigste farmakologisk aktive stoffer i Cistanche Deserticola har CDP'er betydelig medicinsk værdi. Denne undersøgelse karakteriserede foreløbigt strukturen af ​​CDP'er og fandt, at de kan forbedre skaden på HK -2 celler induceret af miljø med højt sukker.

 

Den komplekse struktur af polysaccharider er tæt knyttet til deres biologiske aktivitet, blandt hvilke typen og andelen af ​​monosaccharider, den relative molekylmasse af polysaccharider og typen af ​​glycosidiske bindinger er de vigtigste påvirkningsfaktorer [16]. Den moderate relative molekylmasse giver polysaccharider mere aktive steder og kan udvise stærkere biologisk aktivitet.
Imidlertid vil stor molekylvægt øge transmembranresistensen, hindre polysaccharidabsorption og påvirke aktiviteten. Omvendt er polysaccharider med små molekylvægt muligvis ikke i stand til at danne effektive aktive strukturer, hvilket resulterer i reduceret aktivitet [17]. Når man undersøger den biologiske aktivitet af polysaccharider, er det nødvendigt at overveje monosaccharid -sammensætningen omfattende, relativ molekylmasse og glycosidisk bindingstype [18]. I denne undersøgelse bestemte ionkromatografi, at CDP'er hovedsageligt var sammensat af glukose, galactose og rhamnose, hvilket er i overensstemmelse med rapporten fra Xu et al. [19]. De vægtgennemsnitlige molekylvægte af CDP'er målt ved henholdsvis højtydende væskegelkromatografi var henholdsvis 3444, 4198 og 8031 ​​kDa. Molekylvægtene af tre cistanche-polysaccharider fra fire medicinske materialer af cistanche-typen målt af Yang et al. [20] var ens. CDP'er kan indeholde -type glycosidiske bindinger og kan indeholde -glucose eller -mannose. Polysaccharider sammensat af -glucose eller -mannose genkendes lettere ved hjælp af vejafgiftslignende receptor 4 (TLR4) eller TLR2 [21].
DN er en af ​​de mest alvorlige mikrovaskulære komplikationer af diabetes, og dens patogenese er tæt knyttet til oxidativ stress, mitokondrisk dysfunktion og celle -apoptose [22]. Denne undersøgelse undersøgte den beskyttende virkning af CDP'er på høj glukoseinduceret HK -2 celler ved at regulere TLR4/NF-KB signalveje og dens molekylære mekanisme.

Under høje glukosebetingelser udviser HK -2 celler signifikant oxidativ stress [23]. Undersøgelser har fundet, at høje sukkerniveauer markant øger produktionen af ​​intracellulær ROS. Denne overdreven mængde ROS kan direkte skade cellemembranlipider, hvilket fører til en stigning i indholdet af lipidperoxidationsprodukt MDA [24]. På samme tid blev aktiviteterne af SOD og GSH-PX, vigtige antioxidantforsvarssystemer, signifikant reduceret, hvilket indikerede, at cellernes antioxidantkapacitet blev alvorligt beskadiget [25]. Denne ubalance i oxidation-antioxidationssystemet fremmer yderligere ekspressionen og aktiveringen af ​​TLR4 [26]. Tidligere undersøgelser har vist, at overdreven ROS kan genkendes af TLR4 som fareassocierede molekylære mønstre (DAMP'er), hvilket danner en positiv feedback-loop [27]. I denne undersøgelse reducerede forbehandling af CDP'er signifikant ROS-niveauer, forøget SOD og GSH-PX-aktiviteter og nedsat MDA-indhold. Denne omfattende antioxidanteffekt antyder, at CDP'er kan regulere oxidative stressresponser gennem flere mål.
I TLR4/NF-KB-signalvejen fremmer Activated TLR4 aktiveringen af ​​IKK-komplekset ved at rekruttere nedstrøms adapterproteiner, som igen fører til phosphorylering og nedbrydning af IBB [28]. Den nuværende undersøgelse observerede, at høj glukose signifikant øgede phosphoryleringsniveauet af IBB, hvilket førte til translokation af NF-KB P65 fra cytoplasmaet til kernen. Undersøgelser har vist, at nuklear translokation af p65 ikke kun forværrer oxidativ stress, men også påvirker mitokondrial funktion [29].
Det blev observeret af JC -1 farvning af, at høj glukosebehandling forårsagede et signifikant fald i mitokondrisk membranpotentiale, hvilket viste et skift fra rød fluorescens til grøn fluorescens, hvilket indikerede, at protongradienten mellem de indre og ydre membraner i mitochondria blev forstyrret. Mitochondrial dysfunktion forværrer produktionen af ​​ROS yderligere og danner en ondskabsfuld cyklus [30]. CDPS-forbehandling kan opretholde stabiliteten af ​​mitokondrisk membranpotentiale, og denne beskyttende virkning kan opnås ved at hæmme ekspressionen af ​​TLR4 og aktivering af NF-KB.
Mitochondrial dysfunktion og vedvarende oxidativ stress fører i sidste ende til celle -apoptose [31]. Hoechst -farvning afslørede, at cellekernerne i den høje glukosebehandlingsgruppe viste åbenlyse typiske apoptotiske morfologiske ændringer, såsom kondens, kondensation og fragmentering [32]. Disse ændringer er tæt knyttet til den mitokondriske medierede iboende apoptosevej: tabet af mitokondrisk membranpotentiale fører til frigivelse af cytochrome C, aktivering af caspase-kaskaden og i sidste ende celle apoptose [33]. Den nukleare morfologi af celler i CDPS -forbehandlingsgruppen var dybest set normal, og farvningen var ensartet, hvilket antydede, at CDP'er forhindrede celle -apoptose ved at opretholde mitokondriel funktion og hæmme oxidativ stress.
I sammendraget detekterede denne undersøgelse systematisk oxidative stressindikatorer (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), mitokondrial funktion (JC -1) og celle apoptose (Hoechst), kombineret med TLR4/NF-KB signalveje-nøgle Molekuler, der belyser mekanismen for CDPS: CDPS: CDPS
Først ved at forbedre cellernes antioxidantkapacitet, reducere niveauet af ROS og reducere aktiveringen af ​​TLR4; For det andet ved at hæmme ekspressionen af ​​TLR4 og phosphorylering af IKB, der blokerer for nuklear translokation af NF-KB; Endelig ved at forbedre mitokondrisk funktion, hæmmer celle -apoptose. Døden og spiller således en beskyttende rolle mod DN. Denne synergistiske effekt med flere mål får CDP'er til at vise gode applikationsudsigter i behandlingen af ​​DN. I efterfølgende undersøgelser bestemmes polysaccharidstrukturen yderligere ved røntgenstrålediffraktion, nuklear magnetisk resonansspektroskopi og gaskromatografimassespektrometri. Derudover viser de gennemsnitlige resultater af molekylvægt, at CDP'er er heterogene polysaccharider. Dernæst vil vi adskille og rense homogene polysaccharider, detektere polysaccharidstrukturen og biologisk aktivitet og afklare struktur-aktivitetsforholdet.