Spermidin lindrer intrauterin hypoxi-induceret afkom Nyfødt myokardiemitokondriel skade hos rotter ved at hæmme oxidativ stress og regulere mitokondriel kvalitetskontrol Del 1

Abstrakt

Baggrund: Intrauterin hypoxi (IUH) øger risikoen for hjerte-kar-sygdomme hos afkom. Som en reaktiv oxygen art (ROS) scavenger er polyaminspermidin (SPD) afgørende for embryonal og føtal overlevelse og vækst. Imidlertid er yderligere undersøgelser af SPD-beskyttelse og mekanismer for IUH-induceret hjerteskade hos afkom påkrævet.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en robust fjernelsesevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på sædmembranens funktion. Cistanche polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescent mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og har evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikal-induceret kollagen-nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin frie radikaler.

Klik på Cistanches Herba For Anti-aging

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Mål: Denne undersøgelse havde til formål at undersøge de forebyggende virkninger af prænatal SPD-behandling på IUH-induceret hjerteskade hos nyfødte afkom rotter og dens underliggende mitokondrie-relaterede mekanisme.

Metoder: Rottemodellen af ​​IUH blev etableret ved eksponering for 10 procent O2 syv dage før terminen. I mellemtiden fik de drægtige rotter i syv dage SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Endagsrotterne blev ofret for at vurdere flere parametre, herunder vækstudvikling, hjerteskade, proliferation af kardiomyocytter, myokardieoxidativ stress, celleapoptose og mitokondriel funktion og har mitokondriel kvalitetskontrol (MQC), herunder mitofagi, mitokondriel biogenese, og mitokondriel fusion/fission. I in vitro eksperimenter blev primære kardiomyocytter udsat for hypoxi med eller uden SPD i 24 timer.

Resultater: IUH reducerede kropsvægt, hjertevægt, hjerte-Ki67-ekspression, aktiviteten af ​​SOD og CAT- og adenosin-5'-trifosfat (ATP)-niveauer og øgede BAX/BCL2-ekspression og TUNEL-positive nuclei-tal. Ydermere forårsagede IUH også abnormitet i mitokondriel struktur, dysfunktion og nedsat mitofagi (nedsat antal mitofagosomer), nedsat mitokondriel biogenese (nedsat ekspression af SIRT-1, PGC-1, NRF-2 og TFAM), og førte til fission/fusionsubalance (øget procentdel af mitokondrielle fragmenter, øget DRP1-ekspression og nedsat MFN2-ekspression) i myokardiet. Overraskende nok normaliserede SPD-behandling variationerne i de IUH-inducerede parametre. Ydermere forhindrede SPD også hypoxi-induceret ROS-akkumulering, mitokondriemembranpotentialehenfald og mitofagi-faldet i kardiomyocytter.

Konklusion: Maternal SPD-behandling forårsagede IUH-induceret hjerteskade hos nyfødte afkom rotter ved at forbedre myokardiets mitokondriefunktion via antioxidation og anti-apoptose og regulere MQC.

1. Baggrund

Epidemiologiske og dyreforsøg indikerer, at et adv se intrauterint miljø er forbundet med en øget risiko for hjerte-kar-sygdomme i voksenalderen (1). Prænatal hypoxi, det mest almindelige ugunstige intrauterine miljø, kan gøre fosteret ude af stand til at realisere sit genetisk bestemte vækstpotentiale, manifesteret som væksthæmning og organfunktionsskade i efteråret(2). Kronisk føtal hypoxi skyldes ofte graviditet med øget placenta vaskulær modstand, såsom præ-clampsia, inter-graviditet i stor højde eller maternelle luftvejssygdomme. Mere signifikant er en tredjedel af dem ramt af obstruktiv søvnapnø hypoventilationssyndrom (OSAHS) i slutningen af ​​graviditeten, og det er også forbundet med udviklingen af ​​svangerskabsforhøjet blodtrykssyndrom. Den mest kritiske patofysiologiske ændring SAHS er kronisk intermitterende hypoxi (3, 4). I flere dyremodeller fører intrauterin hypoksi (IUH) til reduktion af hjerteeffektivitet, diastolisk og systolisk dysfunktion, hypertrofisk vækst, nedsat kardiomyocytproliferation og forsinket kardiomyocytmodning i fosterets og neonatale hjerte, hvilket øger risikoen for hjertesygdomme hos voksne afkom ( 5). Programmeringseffekten af ​​kronisk hypoxi kan hovedsageligt forklare mekanismen på kritiske stadier af udviklingen af ​​hjertet, hvilket fører til øget hjerteoxidativ stress og stigning i celleapoptose hos afkom (6-9). Indholdet i udviklingsprogrammering giver mening, fordi vores fysiologi er meget mere formbar og plastisk i det tidlige liv. Den intrauterine tilstand bestemmer og programmerer begreberne fysiologi og stofskifte, som vores liv. Følgelig fører det føtale adaptive respons på IUH til udvikling af hjerte-kar-sygdomme hos voksne (10). Mitokondrier er komplekse organeller, der spiller afgørende roller i cellulær energigenerering og et utal af kældersignaleringsbegivenheder. Den strukturelle og funktionelle integritet af mitokondrier er afgørende for overlevelsen af ​​kardiomyocytter, og når den kompromitteres, resulterer afbrydelsen af ​​mit-hondriel homeostase i udviklingen af ​​karaksygdomme. For nylig har adskillige undersøgelser fokuseret på rollen af ​​kronisk prænatal hypoxi-inducerende mitokondriel dysfunktion i at formidle hjerteskader af afkom. Det er blevet rapporteret, at den mitochondrialiratoriske funktion var svækket, og ekspressionen af ​​adskillige mitokondrielle mol-regler ændrede det perinatale hjerte udsat for IUH (11). Ydermere fører IUH til nedsat mitokondriel kompleks enzymaktivitet og skive dysfunktion af hjertet hos ult afkom efter myokardieiskæmi (12). Derfor sigtede denne undersøgelse på at opdage den molekylære forbindelse amo prænatal hypoxi, oxidativ stress, mitokondriel dys-handling og hjerteskade hos nye afkom (13).

Udviklingen og modningen af ​​dette højvolumen mitokondrielle system i myokardiet sker hovedsageligt i de perinatale og postnatale udviklingsstadier, primært på grund af det hjertemetaboliske skift fra at bruge glucose eller fedtsyrer til adenosin 5'-triphosphat (ATP) generationen efter fødslen (14). Nye beviser tyder på, at mitokondrielle kvalitetskontrolmekanismer (MQC) er kritiske determinanter for modningen af ​​kardiomyocytter (15). Mitokondriel kvalitetskontrol, hovedsageligt inklusive mitokondriel biogenese, mitofagi sammen med dynamik, et fint afstemt regulatorisk netværk, orkestrerer mængden og kvaliteten af ​​mitokondrier og forbedrer mitokondriel funktion og kardiomyocytoverlevelse under stressforhold (16). Peroxisomproliferator-aktiverende receptorer (PPAR) coactivator 1 (PGC-1) ​​spiller en afgørende rolle i at drive mitokondriel biogenese og funktion i hjertet (17). Peroxisomproliferatorer-aktiverer receptorer coactivator 1 / (-/-) musehjerter udviser signaturerne af modningsdefekten og alvorlig abnormitet i mitokondriel funktion og tæthed (18). Desuden forhindrer sletning af mitofagi-mediatoren Parkin morfologisk og funktionel mitokondrier modning i neonatalstadiet (19). Mitokondrier er meget dynamiske organeller, der gennemgår konstante fissions- og fusionsbegivenheder forbundet med deres funktion. I den sene embryonale periode viser den bil ac-specifikke genetiske ablation af mitochondrial fusion pro i MFN1 og MFN2 hos mus alvorlig mitokondriel dysfunktion efter fødslen og udvikler kardiomyopati (20). Påfaldende nok afslørede en nylig undersøgelse, at kronisk hyp ia forstyrrede mitokondriel dynamik i fosterets gui forhjerne (21). I overensstemmelse hermed kan MQC fungere som et fokuspunkt i udviklingen af ​​myokardieskade hos det neonatale IUH-afkom. Der er dog lidt kendt om virkningerne af prænatal hypoxi på det neonatale hjerte-MQC-system og effekten af ​​MQC-dysfunktion på neonatal hjertesundhed. Denne undersøgelse overtog denne mission for at udforske den mitokondrie-relaterede mekanisme af IUH-induceret myokardieskade i nye afkom og yderligere udforske forebyggende strategier for at reducere hjerteskaden af ​​IUH.

Polyaminer (PA'er), inklusive putrescin (PU), spermidin (SPD) og spermin (SP), er til stede i næsten alle levende organismer og er afgørende for embryonal og føtal overlevelse, vækst og udvikling (22-24) . Undersøgelser viste, at får udsat for IUH kan forbedre embryonal dysplasi ved at supplere eksogene polyaminer (25, 26). Ydermere indikerer den voksende mængde af litteratur polyaminers rolle i at opfange frie radikaler og beskytte DNA, proteiner og lipider mod den skadelige skade af oxidativ stress. Det er også afsløret, at polyamintilskud øger levetiden i modelorganismer via antioxidant-, anti-inflammatoriske og mitofagi-inducerende pro-forsøg (27-29). Nylige undersøgelser har dokumenteret, at sup mentation med SPD i kosten er kardiobeskyttende og forlænger levetiden hos både mus og mennesker ved at stimulere mitofagi og mitokondriel respiration og forbedre hjertefunktionen (30, 31). Endnu vigtigere er det, at vi tidligere har rapporteret, at maternel hypoxisk eksponering i de sene stadier af fosterudviklingen resulterede i den dased ana-liste og øget katabolisme af polyaminer i carac-vævet hos nyfødte rotter. SPD forhindrede hjerteskade i ven-dages afkom rotter udsat for IUH ved at hæmme mitokondriel mentation (32).

2. Mål

I denne undersøgelse antages IUH at inducere mitokondriel struktur og funktionsdefekter ved at øge oxidativt stress og ødelægge MQC-mekanismen i det nyfødte afkoms hjerte, og moder SPD-behandling in utero antages at reducere myokardieskade ved at reducere mitokondriers udviklingsprogram. Denne undersøgelse kan bidrage til udviklingen af ​​forebyggende eller terapeutiske strategier for IUH-afkom for at forhindre hjerte-kar-sygdomme hos voksne.

3. Metoder

3.1. Dyr

Wistar-han- og hunrotterne (3 måneder gamle) blev købt fra Department of Laboratory Animals ved Harbin Medical University. Alle procedurer blev godkendt af Ethics Review Committee fra Harbin Medical University (Kina), og alle eksperimenter blev udført af National Institutes of Health retningslinjer. Rotterne med et han-til-hun-forhold på 2:1 blev tilfældigt anbragt i et bur til parring. Vaginale udstrygninger blev udført den følgende dag for at påvise tilstedeværelsen af ​​sæd i vaginale propper eller vaginale udstrygninger, hvilket blev bekræftet som nul-dagen for graviditeten. De drægtige rotter blev holdt i et rum med kontrolleret fugtighed (60 procent) og kontrolleret temperatur (21 grader), og lys-mørke-cyklussen var 12:12 timer.

3.2. Intrauterin hypoxi model

Fra den 15. til den 21. drægtighedsdag blev rotterne i hypoxigruppen (n=10) sat i et lukket plexiglaskammer, injiceret med luft og nitrogen og overvåget af en oxygenanalysator (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, New York, USA), og inhaleret med et iltindhold på 10 procent i fire timer om dagen. De arterielle blodprøver blev taget fra den højre femorale arterie, blodgassen og pH-værdierne blev målt for at opretholde det arterielle iltpartialtryk på 50 - 55 mmHg, blodets iltmætning blev opretholdt på 80 - 85 procent, og specifikke procedurer blev udført som tidligere beskrevet (32). De eksperimentelle hunrotter blev tilfældigt opdelt i fire grupper: kontrolgruppe (kontrol), intrauterin hypoxigruppe (Hpx), intrauterin hypoxi plus spermidin gruppe (Hpx-Spd) og intrauterin hypoxi plus spermidin plus inhibitor gruppe (Hpx-Spd-DFMO) ). Seks rotter pr. gruppe blev injiceret intraperitonealt på den 15. - 21ste dag af graviditeten. Rotterne fik 0,9 procent saltvand (1 ml/kg/d) i kontrol- og Hpx-grupperne, SPD (5 mg/kg/d) i Hpx-Spd-gruppen og SPD (5 mg/kg/d) og difuoromethy -L-ornithin (DFMO, en inhibitor af nøgleenzymet i polyaminsyntese ODC) (5 mg/kg/d) i henholdsvis Hpx-Spd-DFMO-gruppen. Efter fødslen blev 1-daggamle nyfødte ofret, og deres hjerter blev ekstraheret til opfølgende eksperimentelle undersøgelser.

3.3. Histologisk Analyse

Rotternes venstre ventrikulære væv blev skåret i en tykkelse på < 1 cm, fikseret med 4 procent paraformaldehyd, dehydreret med alkohol og indlejret i paraffin. Den indlejrede paraffin blev skåret i 5 mm tykke skiver, derefter tørret ved en konstant ovntemperatur på 60 grader, afvokset med xylen og efterfulgt af farvning af hæmatoxylin-eosin (HE). Vævsskiverne blev observeret for at vurdere ændringerne i hjertemorfologi og -strukturer med et optisk mikroskop (Eclipse E200; Nikon, Tokyo, Japan).

3.4. Immunfluorescensanalyse

Ki67 immunfluorescensfarvning blev udført som tidligere beskrevet (33). Kort fortalt blev rotternes venstre ventrikulære væv fikseret i 4% formalin, indlejret i paraffin; afvoksning, hydrering og antigenreparation blev først afsluttet. Disse væv blev blokeret med 0,5 procent bovint serumalbumin i 2 timer og derefter inkuberet med Ki67 Rabbit Monoclonal Antibody (1:100, AF1738, Beyotime, Kina) ved 4 grader natten over. Efter vask med PBS blev vævet inkuberet med Alexa fluor-mærket ged anti-kanin IgG (1: 500, A 0468, Beyotime, Kina) og modfarvet med DAPI for kerner. Billederne blev set og scannet under konfokal lasermikroskopi (OLYMPUS, FV1000, Japan). Softwaren blev brugt til at analysere kolokaliseringen af ​​de fusionerede billeder.

3.5. Kvantificering af fibrose

Hjertefibrose blev vurderet ved Massons trichromfarvning. Som beskrevet ovenfor blev hjertevævssektionerne fra de neonatale rotter afvokset og hydreret ved standardmetoder og derefter farvet med Massons trichrom ifølge protokollerne. To ikke-tilstødende tværsnit blev brugt til hvert hjerte. Procentdelen af ​​fibrotisk areal i det totale venstre ventrikulære myokardieområde blev analyseret ved hjælp af ImageJ-software, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT-medieret dUTP Nick End-mærkning og apoptotiske cellemålinger

Et TdT-medieret dUTP nick end labeling (TUNEL) assay blev brugt til at bestemme antallet af apoptotiske celler i de en dag gamle neonatale rottehjerter. Hjertevævene blev behandlet efter vores tidligere beskrevne procedure ved anvendelse af et celledødsdetektionskit (Roche, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner. Tre objektglas fra hver blok blev evalueret for procentdelen af ​​apoptotiske celler. Fire objektglasfelter blev tilfældigt undersøgt med 200x forstørrelse. I alt blev der talt 100 celler i hvert felt.

3.7. Måling af antioxidant enzymaktivitet

Superoxiddismutase (SOD) og katalase (CAT) aktivitet blev målt ved hjælp af kommercielle kits (SOD: A001-3- 1 og CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Kina) med et spektrofotometer (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, USA). Ifølge producentens instruktioner blev operationen afsluttet, og proteinkoncentrationen blev målt ved hjælp af bicinchoninsyremetoden (Pierce, Rockford, USA) med bovint serumalbumin (BSA) som standard (34).

3.8. Måling af Adenosin 5'-trifosfatindhold

ATP-indholdet i hjertevæv blev målt under anvendelse af et ATP-assaykit (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Kina). Ifølge producentens instruktioner blev lysatet tilsat i forhold til vævsvægten, homogeniseret med en glashomogenisator og derefter centrifugeret ved 4 grader 12000 g. Supernatanten blev taget, og indholdet af ATP i hver prøve blev påvist med et luminometer (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) BCA-kit (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Kina). Bicinchoninsyremetoden blev brugt til at bestemme proteinkoncentrationen og derefter omdanne koncentrationen af ​​ATP til nmol/g protein.

3.9. Transmissionselektronmikroskopi

Det apikale hjertevæv blev dissekeret i ca. 1 mm × 1 mm × 1 mm små stykker og derefter fikseret i glutaraldehydphosphatbuffer ved 4 grader. Efter rutinemæssig dehydrering, iblødsætning, indlejring og farvning blev de ultratynde sektioner på 50 - 70 nm lavet. Ultrastrukturen af ​​hjertevævet blev observeret under et transmissionselektronmikroskop (TEM) og fotograferet (H600 Hitachi, Tokyo, Japan). Enkelte mitokondrier og myofilamenter blev kortlagt under betingelse af 10.000 gange forstørrelse med Image J softwareversion 1.80 (National Institutes of Health), og deres områder blev målt fra hvert hjerte (35). I mellemtiden blev mitokondrielle fragmenter < 1 µm3, som ikke var opdelt (normalt runde), identificeret, og den gennemsnitlige procentdel af mitokondrielle fragmenter i synsfeltet blev talt ved hjælp af Mitochondrial Fragmentation Index (MFI).

3.10. Mitokondriel isolation

Mitokondrier blev isoleret ved 4 grader ved anvendelse af differentiel centrifugering med et Mitochondria Isolation Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina). Kort fortalt blev frisk hjertevæv skåret i vævsstykker og centrifugeret med 10 volumener forkølet PBS, supernatanten blev kasseret, bundfaldet blev fordøjet med trypsin i 20 minutter, den tilsatte isoleringsbuffer A blev centrifugeret, supernatanten blev overført til en anden rør, centrifugeret igen, og den udfældede fraktion var de isolerede mitokondrier. Den endelige hjerte-mitokondrielle pellet blev resuspenderet i homogeniseringsbuffer, opbevaret på is og brugt til eksperimenter med mitokondriel respirationsfunktion inden for 4 timer.

3.11. Måling af mitokondrielt iltforbrug

Mitokondrielt oxygenforbrug blev målt med en Clark-type oxygenelektrode (Hansatech Instruments, Norfolk, UK) i en mitokondriel respirationsbuffer. Pyruvat (5 mM) og malat (5 mM) blev anvendt som et substrat for komplekse I-holdige mitokondrier ved den endelige koncentration på 500 µg protein/ml. ADP-stimuleret oxygenforbrug (tilstand 3 respiration) blev målt i nærvær af 200 µM ADP, og ADP-uafhængigt oxygenforbrug (tilstand 4 respiration) blev overvåget. Respirationskontrolforholdet (RCR, tilstand 3 divideret med tilstand 4) afspejler iltforbruget ved fosforylering (kobling). Procedurerne fortsatte som tidligere beskrevet (36).

3.12. Western Blot Analyse

Prøven af ​​hjertevæv blev høstet og opbevaret ved -80 grad. Frosne venstre ventrikulære hjertevæv blev homogeniseret i iskold RIPA-lysebuffer (Beyotime Inc., Shanghai, Kina P0013B). Proteinkoncentrationerne blev kvantificeret ved anvendelse af et BCA-proteinassaykit (Beyotime Inc., Shanghai, Kina P0006C). Prøverne indeholdende totalt protein blev adskilt med 10% (vægt/volumen) SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Følgende antistoffer blev brugt: Antistoffer for GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) og BAX (1.1000,509599-2-Ig) blev købt fra Proteintech (WuHan, Kina), BCL2 (1: 2000, sc-7382) og DRP1 (1:1000, sc-271583) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) og PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, UK). Det sekundære antistof (peberrodsperoxidase-mærket gede-anti-kanin IgG) var fra Beyotime Corporation (Shanghai, Kina). Intensiteterne af proteinbåndene blev kvantificeret ved anvendelse af et Fluor Chem Chemiluminescence gel-billeddannelsessystem (Protein Simple, USA). Den optiske tæthed af proteinbåndene blev analyseret med Image J softwareversion l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Hypoksisk kardiomyocytmodel

Neonatale rottekardiomyocytter (NRMC'er) blev isoleret og dyrket ved standardmetoder som tidligere beskrevet (32). Kort fortalt blev hjerterne fra de tre-dages neonatale rotter ekstraheret, hakket, dyrket og derefter fordøjet i 0,25 procent trypsin og 0,02 procent EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina). Efter centrifugering blev præcipitaterne overført til DMEM suppleret med 10 procent føtalt kalveserum (Biolot, Rusland) og inkuberet i fugtig luft indeholdende 5 procent 2. Tre dage efter at være blevet podet blev cellerne anbragt i et hypoksisk glaskammer (Biospherix OxyCycler C42). , Redfield, NY), og fyldt med nitrogen i 8 minutter for at udlede den resterende oxygen. Disse cardiomyocytter blev tilfældigt opdelt i følgende grupper: (1) Kontrolgruppe (kontrol), celler dyrket under normale inkubationsbetingelser; (2) hypoxigruppe (Hpx), celler anbragt i det hypoxiske kammer i 24 timer og derefter dyrket normalt i 24 timer; (3) Hpx-Spd-gruppe, celler anbragt i det hypoxiske kammer og inkuberet med 10 µmol/L SPD i 24 timer; (4) Hpx-SpdDFMO-gruppe, celler anbragt i et hypoxisk kammer og inkuberet med 10 µmol/L SPD plus 2 mmol/L DFMO i 24 timer.

3.14. Måling af reaktive iltarter

ROS-genereringen blev målt ved dihydroethidium (DHE)-farvningsassayet (kat. nr. S0063, Beyotime, Kina). Kort fortalt blev primære kardiomyocytter inkuberet med 5 µmol/L DHE ved 37 grader i 30 minutter, vasket med PBS og derefter flyttet under mikroskopet for at observere ændringerne i fluorescensintensitet. Billeder blev taget med et Olympus FluoView FV1000 fluorescensmikroskop (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japan) ved en excitationsbølgelængde på 535 nm, og den maksimale emissionsbølgelængde var 610 nm, n > 20 celler pr. gruppe.

3.15. Bestemmelse af mitokondriel membranpotentiale

Farvestoffet tetramethylrhodaminethylester (TMRE) er positivt ladet og kan selektivt lokaliseres i mitokondrier. Det er meget brugt til at bestemme mitokondrielle membranpotentiale (∆Ψm). Kort sagt blev TMRE-farvningsarbejdsopløsning i en koncentration på 200 µmol/L tilsat til de grupperede behandlede kardiomyocytter, blandet grundigt og anbragt i en celleinkubator ved 37 grader i 20 minutter. Supernatanten blev aspireret, og cellerne blev vasket med PBS og flyttet til et omvendt mikroskop for at observere ændringen i fluorescensintensitet. Excitationsbølgelængden var 549 nm, og emissionslyset var 579 nm. Den røde fluorescensintensitet indikerede ændringen af ​​∆Ψm, n > 20 celler pr. gruppe.

3.16. Mitokondriel og lysosomal lokaliseringseksperiment

Ifølge instruktionen brugte Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Kina) og Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Kina) den mitokondrielle og lysosomale kolokaliseringsanalyse. NRCM'er blev fyldt med 200 nM MitoTracker Green FM og 50 nM LysoTracker Red i HBSS i 30 minutter før eksperimenter, celler blev vasket med PBS, og derefter blev cellebilleder opnået ved hjælp af et Olympus FluoView FV1000 fluorescensmikroskop. 488 nm laserlinjen blev brugt til at excitere MitoTracker Green fluorescens, målt mellem 505 og 515 nm. Til LysoTracker Red blev 577 nm laserlinjen brugt med en måling på 590 nm. Rød og grøn pixelintensitetsoverlejring blev bestemt ved hjælp af kvantificeringssoftware på Nikon Eclipse Microscope, n > 20 celler pr. gruppe.

3.17. Statistisk analyse

Alle data fra de eksperimentelle grupper blev sammenlignet ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test med GraphPad Prism software version 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) og SPSS software version 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United) stater). Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM, og signifikansniveauet blev sat til at være P < 0.05.

4. Resultater

4.1. Afkom og hjertekarakteristika

Kropsvægt (BW) og hjertevægt (HW) blev målt, og HW til BW-forholdet (HW/BW) blev beregnet (figur 1). Resultaterne viste, at de nyfødte rotters BW og HW faldt, og deres HW/BW steg på grund af intrauterin hypoxi. Sammenlignet med IUH-gruppen steg BW og HW for neonatale rotter i SPD-gruppen (P < 0.05), og HW/BW faldt (P < 0). 05); Sammenlignet med SPD-gruppen faldt både BW og HW i DFMO-behandlingsgruppen (P < 0,05), og HW/BW steg signifikant (P < 0,05).

4.2. Effekter af SPD på myokardiemorfologiske struktur, celleproliferation og fibrosisin nyfødte afkom udsat for

Resultaterne af kardiel HE-farvning viste, at hjerterne hos endagsafkom udsat for IUH viste hævelse og løst arrangerede myokardiefibre. Imidlertid opretholdt IUH-hjerterne behandlet med SPD en acceptabel myokardievævsstruktur (figur 2A). Dernæst evaluerede vi antallet af binukleære kardiomyocytter med den HE-farvede vævsskive; antallet af binukleære kardiomyocytter var større i IUH-gruppen end i kontrolgruppen (P < 0.05). Sammenlignet med IUH-gruppen faldt andelen af ​​binukleære kardiomyocytter i SPD-behandlingsgruppen signifikant (P < 0.05); DFMO dæmpede effekten af ​​SPD (P < 0.05) (figur 2C). Vi detekterede yderligere ekspressionen af ​​Ki67 (en markør for celleproliferering) i rottemyokardium ved anvendelse af immunfluorescensmetoden. Jo højere udtryk af Ki67, jo stærkere er den lyserøde fluorescens ved at fusionere rød og blå (figur 2E). Resultaterne viste, at sammenlignet med kontrolgruppen faldt ekspressionen af ​​Ki67 i IUH-gruppen signifikant (P < 0.05), Ki67-ekspressionen steg signifikant efter SPD-administrationen (P < { {28}}.05), og effekten af ​​SPD blev ophævet af DFMO (P < 0,05) (figur 2F). Disse resultater indikerer, at SPD kan hæmme den for tidlige tilbagetrækning af cardiomyocytter fra cellecyklussen induceret af IUH og fremme spredningen af ​​cardiomyocytter i det nye afkom, der udsættes for IUH. Derefter brugte vi Masson-farvning til at detektere ændringerne i myokardiekollagenindhold og vurderede myokardiefibrose ved kollagenarealmåling (figur 2BandD). Vi fandt, at myokardiekollagenaflejring i hjerterne hos de nyfødte rotter, der blev udsat for IUH, steg (P < 0,05), hvis niveau var højere sammenlignet med kontrolgruppen. Tværtimod reducerede området med myokardiefibrose efter SPD-behandlingen signifikant (P < 0,05). Sammenlignet med SPD-behandlingsgruppen steg fibroseområdet signifikant i HpxSpd-DFMO-gruppen (P < 0,05).

4.3. Virkninger af Spermidin på myokardie mitokondrielle struktur, respirationsfunktion og adenosin 5'-trifosfatindhold hos nyfødte afkom udsat for intrauterin hypoxi

De ultrastrukturelle strukturændringer af hjertevæv og mitokondrielle karakteristika blev analyseret ved TEM (figur 3A). Image J-software blev brugt til at kvantificere mitokondrielt indholdsprocent (mitokondrielt område i hele celleområdet) og mitokondrielt område (figur 3B og C). Resultaterne viste, at i kontrolgruppen var myokardiemyofilamenterne ordnet, sarkomerstrukturen var klar, mitokondrierne var kompakte, matrixen var tættere, og de mitokondrielle cristae var ordnet arrangeret. Mitokondrier svulmede imidlertid, og den løsnede matrix og nedsat tæthed blev observeret i nogle kardiomyocytter i IUH-gruppen. Sammenlignet med kontrolgruppen var andelen af ​​mitokondrier i cardiomyocytter og mitokondrierområdet begge reduceret (P < 0.05). I SPD-behandlingens rottehjerter var myokardiemyofilamenterne dog pæne, sarkomerstrukturen var klar, mitokondriematrixen var kompakt, og mitokondriehævelsen faldt. Sammenlignet med IUH-gruppen steg andelen af ​​mitokondrier i kardiomyocytter (P < 0.05), og arealet af mitokondrier steg (P < 0,05). DFMO hæmmede disse SPD-inducerede virkninger (P < 0,05).

Vi brugte pyruvat/malat som substrat til at evaluere den mitokondrielle respiratoriske funktion, herunder tilstande 3 og 4 respirationsfrekvenser og RCR (figur 3D - F). Vi bemærkede, at sammenlignet med kontrolgruppen var respirationsfrekvensen i tilstand 3 og 4 og RCR for IUH-gruppen alle signifikant lavere (P < 0.{{10}}5). Interessant nok blev RCR for tilstand 3 og 4 genoprettet efter SPD-behandlingen (P < 0.05). I modsætning hertil var disse SPD-effekter signifikant hæmmet i DFMO-behandlingsgruppen (P < 0.05). Tilsvarende, sammenlignet med kontrolgruppen, reduceredes myokardie-ATP-indholdet i IUH-gruppen signifikant (P < 0,05). Sammenlignet med IUH-gruppen steg ATP-indholdet bemærkelsesværdigt i den SPD-behandlede gruppe (P < 0,05), og DFMO svækkede virkningerne af SPD (P < 0,05) (Figur 3G). Disse resultater tyder på, at SPD kan beskytte den myokardielle mitokondrielle struktur og funktionsskade og forhindre faldet i ATP-niveauerne hos neonatale afkom, der er udsat for IUH.

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】