[18F]-natriumfluorid autoradiografi billeddannelse af nefrocalcinose i donors nyrer og eksplanterede nyre allografts

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan-Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nephrocalcinoseer til stede i op til 43 pctnyreallotransplantatbiopsier et år efter transplantation og er forbundet med dårligere transplantatfunktion og dårlig transplantatoverlevelse. Vi undersøgte [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) billeddannelse af mikrokalcifikationer i donor nyrer (n= 7) og eksplanteredenyreallotransplantater (n= 13). Tre µm paraffin-indlejrede serielle snit blev brugt til histologisk evaluering af forkalkning (Alizarin Red; Von Kossa-farvning) og ex-vivo [18F]-NaF autoradiografi. Billederne blev fusioneret for at vurdere, om mikrokalcifikationsområder svarede til [18F]-NaF-optagelsesområder. Baseret på histologiske analyser var tubulointerstitielle og glomerulære mikrokalcifikationer til stede i henholdsvis 19/20 og 7/20 prøver. Ved hjælp af autoradiografi blev [18F]-NaF-optagelse fundet i 19/20 prøver med signifikant mere sporaktivitet inyreallograft sammenlignet med afdøde donor nyreprøver (p {{0}}.019). Alizarin Red-farvning af aktive mikroforkalkninger viste god korrelation (Spearman's rho på 0.81, p < 0.001),="" og="" von="" kossa-farvning="" af="" konsoliderede="" forkalkninger="" viste="" signifikant,="" men="" svag="" korrelation="" (0.62,="" p="0.003)" med="" [18f]-naf-aktivitet.="" denne="" sammenhæng="" mellem="" ex-vivo="" [18f]-naf-optagelse="" og="" histologisk="" beviste="" mikroforkalkninger,="" er="" det="" første="" skridt="" mod="" en="" billeddannelsesmetode="" til="" at="" identificere="" mikroforkalkninger="" i="">nefrocalcinose. Dette kan føre til en bedre forståelse af ætiologien af ​​mikrokalcifikationer og deres indvirkning på nyretransplantationsfunktionen.

Klik for at udtrække fordele ved nyresygdom

Nephrocalcinose, defineret som parenkymal og tubulær aflejring af calcium-oxalat (CaOx) eller calcium-phosphat (CaPhos), er en vigtig faktor i faldet i graftfunktionen efternyretransplantation 1–3. Aflejring af CaOx og CaPhos tilskrives høje niveauer af serumoxalat, serumcalcium og serumfosfat hos patienter med kroniskenyresygdom og/eller hyperparathyroidisme4,5. Forekomsten afnefrocalcinose, baseret på nyre-allograft-biopsier, er 6 procent efter 6 måneder, 25-43 procent efter et år og op til 79 procent ved 10-år efternyretransplantation5–7. Undersøgelser med fokus på nyre-allotransplantatbiopsier inden for et år efter transplantation viste en sammenhæng mellem den tidlige tilstedeværelse af calciumaflejringer og både ringere graffunktion og dårlig grafoverlevelse4,8,9. Hvorvidt disse mikrokalcifikationer spiller en aktiv rolle i allograft-dysfunktion eller blot er indikatorer for dereguleret mineralmetabolisme, er stadig uklart.

Til dato,nyreallograft biopsier er den eneste diagnostiske metode til at evaluere post-transplantation mikrocalcifikationer. En ikke-invasiv og pålidelig diagnostisk tilgang ville give mulighed for gentagne målinger, hvilket letter sporing af forkalkninger over tid og interventionsundersøgelser med den potentielle forbedring af resultaterne for transplantatfunktion og transplantatoverlevelse efter nyretransplantation10.

Positron-emissionstomografi/computertomografi (PET/CT) billeddannelse med [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) bruges i klinisk praksis og eksperimentelle undersøgelser som skelet- og vaskulær billeddannelsesmodalitet11-15. Mens pålidelig visualisering af vaskulære mikrokalcifikationer hæmmes med CT-billeddannelse, korrelerede resultaterne af ex-vivo [18F]-NaF microPET-billeddannelse godt med histologisk beviste mikrokalcifikationer i blodkarprøver hos mennesker og dyr16,17. Desuden viste resultaterne af adskillige prospektive kliniske undersøgelser, at tidlig vaskulær [18F]-NaF-aktivitet relaterer sig godt til både mikrokalcifikationer, påvist ved CT-billeddannelse, og mere interessant, stigningen i størrelsen af ​​disse forkalkninger18-20.

Her præsenterer vi resultaterne af en proof of concept autoradiografiundersøgelse til ex-vivo brug af [18F]-NaF billeddannelse afnefrocalcinosehos donorernyrerog transplanterede nyre-allotransplantater som en diagnostisk tilgang til visualisering af mikrokalcifikationer.

Tabel 1.Nyretransplantationsmodtagerens egenskaber. Ingen tilfælde af hypercalcæmi i denne kohorte; *klassificering af Banf-klassificering af allograftpatologi—201828; FSGS=Fokal segmentel glomerulosklerose; IFTA=Interstitiel fbrose og tubulær atrofi; tilsvarende autoradiografi og histologi resultater er præsenteret i Supplerende S1.

Tabel 2. Afdødenyredonoregenskaber. *Kardiovaskulær sygdom defineret som en cerebrovaskulær hændelse, myokardieinfarkt, vaskulær sygdom, der kræver invasiv intervention; **som bemærket af indkøbsteamet; Tilsvarende autoradiografi og histologi resultater er præsenteret i Supplerende S2; ingen donorer med diabetes mellitus.

Resultater

Prøvekohorte.

Trettennyreprøver blev opnået efter transplantektomi, med en median på 33 [IQR 9-66] måneder efter transplantation, fra transplantationsmodtagere med en medianalder på 51 [IQR 30-64] år. Transplantektomi blev udført for allotransplantatafstødning (Banf IIA og IIB) hos syv patienter, kronisk allotransplantatarteriopati hos to patienter, allotransplantatinfektion hos to patienter, primær non-funktion én patient og interstitiel fbrose og tubulær atrofi Grad III hos én patient. Otte ud af 13 (61,5 procent) patienter havde hyperparathyroidisme, syv (53,8 procent) havde hyperfosfatæmi, fem (38,5 procent) havde diabetes mellitus, og ingen af ​​disse patienter havde tegn pånefrocalcinosepå klinisk ultralyd eller en anamnese med nyresten (tabel 1). Syv afdøde donornyreprøver blev opnået fra donorer med en medianalder på 65 [IQR 64-71] år. Fire ud af syv (57,1 procent) donorer havde en historie med kardiovaskulær sygdom, ingen havde diabetes mellitus og seks ud af syv (85,7 procent) havde åreforkalkning i nyrevaskulaturen ved visuel inspektion, hvilket er potentielle faktorer til at afvise denne donornyrer(Tabel 2).

Figur 1. Autoradiografibillede af [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) optagelse (A), med overlejringsbilledet af [18F]-NaF optagelse med Alizarin rød farvning af mikrokalcifikationer (B) og von Kossa farvning af forkalkninger (C).

Autoradiografi og histologi.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 procent ud af 5 (25 procent) ud af 20 prøver (Fig. 1 og Fig. 2A) (Supplerende S1 og Supplerende S2, der viser autoradiografi og overlejringsbilleder for alle prøver). Antallet af [18F]-NaF områder var signifikant højere inyreallograftprøver sammenlignet med afdød donornyreprøver med en median på 7.0 [IQR 4.0–15.5] og 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], henholdsvis (p=0.019) (Supplerende S3).

Tubulointerstitielle mikroforkalkninger, visualiseret med Alizarin rød farvning, var til stede i 19 ud af 2 0 prøver med en median på 5,5 [IQR 2-10.3] pr. prøve, og glomerulære mikrokalcifikationer blev set i syv ud af 20 prøver med en median på 1 [IQR 1-3] pr. prøve (fig. 2B). Et signifikant højere antal mikrokalcifikationer blev observeret i nyre-allotransplantatprøver sammenlignet med afdøde donornyreprøver, med en median på 9.0 [IQR 5.0–20.5] og 4.0 [IQR 1.0-4.0] henholdsvis (p=0.046) (Supplerende S3). Med Von Kossa-farvning blev tubulointerstitielle forkalkninger set i 18 ud af 20 prøver, med en median på 2,5 [IQR 1-5] pr. prøve, og glomerulære forkalkninger blev set i syv ud af 20 prøver, med en median på 1 [IQR 0-3] prøve (fig. 2C). Antallet af forkalkninger var ikke signifikant forskellig mellemnyreallograftprøver og nyreprøver fra afdøde donorer med en median på 4.0 [IQR 2.0–6.0] og 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], henholdsvis (p=0.311) (Supplerende S3). Interobservatør-reproducerbarheden blev identificeret mellem visuel og semi-automatisk påvisning af forkalkninger med en ICC på 0.94 (95 procent CI 0.85–0.98) for rød Alizarin-farvning og på 0.77 (95 procent CI 0.42–0.91) for Von Kossa-farvning.

Overlejringsbilleder af autoradiografi og histologiske resultater viste co-lokalisering af [18F]-NaF-optagelse med Alizarin rød farvning til mikrokalcificering (fig. 1B). Til sammenligning viste overlejringsbilleder af [18F]-NaF-optagelse og Von Kossa-farvning af forkalkninger optagelse i områder uden histologisk beviste forkalkninger (fig. 1C). Den falsk negative [18F]-NaF-optagelse, som procentdelen af ​​histologisk beviste (mikro)forkalkningsområder uden for overlejringen, var median 0 procent [IQR 0–25 procent] for røde Alizarin-områder og median 100 procent [65-100 procent ] for Von Kossa-områder. Alizarin Red-farvning af mikrokalcifikationer viste god korrelation med [18F]-NaF-optagelse (Spearman's rho på 0,81 (95 procent CI 0,57-0,92), p.< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 procent [18F]-NaF-optagelse (fig. 4).

Figur 2. Overlejringsbillede af [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) optagelse og (Alizarin rød) mikrokalcifikationer (A), med Alizarin rød farvning til mikrokalcifikationer (B) og von Kossa farvning til forkalkninger (C).

Recipientkarakteristika på tidspunktet for transplantektomi.

Der blev ikke observeret forskelle mellemnyreallografprøver fra patienter med (n{0}}) eller uden hyperphosphatæmi (n=6), for antallet af [18F]-NaF-områder (median 5.0 [IQR 2.0–11.8] versus 7.0 [7.0–23.0], s=0.170) , Alizarin rød (median 7,5 [IQR 5.0–14.0] versus 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390) og Von Kossa (median 5.0 [IQR 3.5–6.3] versus 3.0 [2.{ {59}}–5.0], s=0.247). Sammenligning af nyre-allografprøver fra patienter med (n=8) eller uden (n=5) hyperparathyroidisme viste ingen forskelle for antallet af [18F]-NaF-områder (median 7.0 [IQR 4.0–7.5] versus 7.5 [4.0–23.0], p=0.459), Alizarin red (median 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] versus 1{{103}}.0 [3.5-32.8], s{{76 }}.769), og Von Kossa (median 4.0 [IQR 1.5–5.0] versus 4.5 [2.0–6.8], p{{9{{ 131}}}}.505). Der blev ikke identificeret signifikante forskelle mellem nyre-allografprøver fra patienter med (n=5) eller uden (n=8) diabetes mellitus, for antallet af [18F]-NaF-områder (median 5,5 [IQR 2,5– 19.3] versus 7.0 [6.5-15.5], p=0.524), Alizarin red (median 10.0 [IQR 5.5-24.8] versus 9.0 [4.0-8.5], p=0.833) og Von Kossa (median 3.0 [IQR 2.0-5.8] versus 4.0 [3.5-8.5], p=0.284). For tiden mellem transplantation og transplantektomi (måneder) blev der ikke observeret nogen signifikante korrelationer med antallet af [18F]-NaF områder (p=0.586), Alizarin red (p=0.667) og Von Kossa (s=0.459). For alderen på transplantationstidspunktet blev der ikke observeret signifikante korrelationer med antallet af [18F]-NaF-områder (p=0.902), Alizarin red (p=0.798) og Von Kossa (p. =0.334). Tilsvarende blev der ikke observeret nogen signifikante sammenhænge mellem urskivens varighed (måneder) efternyreallograffejl og antal af [18F]-NaF områder (p=0.481), Alizarin rød (p=0.565) og Von Kossa (p=0.174).

Figur 3. Korrelation af antallet af [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) områder med Alizarin rødfarvede mikrokalcifikationer (A) og von Kossa farvede forkalkninger (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 procent [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) sporstofoverfladeareal, for antallet af Alizarin rødfarvede mikrokalcifikationer (A) og von Kossa, farvede forkalkninger (B) (median, interkvartilområde).

Diskussion

I denne proof of concept-undersøgelse, ex-vivo [18F]-NaF-optagelse hos menneskernyreparenkymprøver viste en god korrelation med histologisk beviste mikrokalcifikationer. Optagelse af [18F]-NaF korrelerede stærkere med Alizarin rød farvning for aktive mikrokalcifikationer sammenlignet med Von Kossa farvning af konsoliderede forkalkninger, hvilket tyder på en rolle for [18F]-NaF billeddannelse i identifikation af tidlige stadier af nefrocalcinose.

De præsenterede prøver repræsenterer en case-mix af donor-nyrer og eksplanterede nyre-allotransplantater. Disse to prøvetyper adskilte sig med hensyn til sporbinding, med mere [18F]-NaF-optagelse observeret i eksplanterede nyre-allograftprøver. Dette er på linje med tidligere publikationer, der rapporterer en stigning i mikroforkalkninger efter nyretransplantation5-7. Foreningen afnefrocalcinosemed ringere transplantatfunktion på tidspunktet for biopsi og et år efter transplantation er rapporteret i to nyre allograft biopsi undersøgelser, med 258 og 149nyretransplanterede hhv.8,9. Desuden er der i en longitudinel kohorte med 97 nyretransplanterede modtagere vist en signifikant dårligere 1-år og 12-års graftoverlevelse hos patienter med calciumoxalataflejringer (dvs. en grafoverlevelse på 98,6 procent versus 72,5 procent og henholdsvis 79,3 procent mod 49,7 procent). I multivariat logistisk regressionsanalyse var tilstedeværelsen af ​​calcium-oxalat-aflejringer uafhængigt forbundet med graftab, i en model, der blandt andet inkluderede kreatinin på tidspunktet for biopsi og donor type4. Den specifikke rolle af mikrokalcifikationer i denne kaskade afnyrefald i allograftfunktionen er stadig uklar. I kliniske omgivelser før transplantation tilskrives CaOx-aflejringer høje niveauer af serumoxalat, et molekyle, der ikke effektivt fjernes under dialyse4. Hvorimod CaPhos-aflejringer oftest ses hos patienter med hyperparathyroidisme og høje niveauer af serumcalcium på grund af en forstyrret mineralmetabolisme før og efter transplantation5. Vi fandt ingen forskelle i histologi- og autoradiografiresultater for hyperfosfatæmi, hyperparathyroidisme, diabetes mellitus, tiden mellem transplantation og transplantektomi og dialysevarigheden efter nyre-allograftsvigt.

Til udvikling af nye behandlingsstrategier for aktive mikrokalcifikationer inefrocalcinose, bør dens kliniske relevans med hensyn til (kronisk) transplantationssvigt forstås mere omfattende. Med identifikation af en målgruppe med høj risikonyretransplantationsmodtagere, kan kliniske undersøgelser designes til at udforske behandlingsstrategier21. Et muligt fokus kunne findes i opreguleringen af ​​endogene forkalkningshæmmere, med særlig vægt på osteopontin3.

I betragtning af den høje forekomst afnefrocalcinoseog dets sammenhæng med nyre-allotransplantatfunktion, er en bedre forståelse af ætiologien af ​​mikrokalcifikationer berettiget. En ikke-invasiv og pålidelig diagnostisk tilgang til at identificere og kvantificere mikrokalcifikationer i tidlig nefrocalcinose kunne muliggøre undersøgelser af virkningen af ​​nefrocalcinose på nyretransplantationsfunktionen. [18F]-NaF-billeddannelse er af interesse, da [18F]-NaF-optagelse i menneskelige og animalske vaskulære prøver øges i biologisk aktive områder med forkalkning, før disse områder kan visualiseres ved mikrocomputertomografi16,17,22. I nyere kliniske PET/CT-studier blev [18F]-NaF-optagelse vist at være relateret til progressionen af ​​vaskulær forkalkning, hvilket giver klinisk bevis for brugen af ​​[18F]-NaF til påvisning af områder med biologisk aktiv forkalkning18-20. Observationerne i denne undersøgelse er i overensstemmelse med disse tidligere resultater inden for vaskulær billeddannelse. Der blev påvist en god sammenhæng mellem [18F]-NaF-optagelse og de histologisk beviste mikrokalcifikationer, mens sammenhængen med konsoliderede forkalkninger var klart svagere.

Som nævnt blev co-lokalisering mellem [18F]-NaF-optagelse og Alizarin rød-positive mikrokalcifikationer identificeret, mens [18F]-NaF-optagelsesområder ikke co-lokaliserede med Von Kossa-farvning af konsoliderede forkalkninger. Disse forkalkede områder med konsoliderede forkalkninger og ingen tilsvarende [18F]-NaF-optagelse kan betragtes som områder med inaktiv forkalkning, hvor der ikke er nogen igangværende mineraliseringsproces, som tidligere beskrevet af Irkle et al. i en ex-vivo undersøgelse af carotis calcifcation16. Selvom kun valideret for vaskulære forkalkninger og ikke fornyreparenkymforkalkninger, understøttes det af [18F]-NaFs bindingsegenskaber til den ydre overflade af forkalkninger og begrænset penetration i faste forkalkninger. Derfor vil [18F]-NaF-optagelse være højere ved mikroforkalkninger, med et stort overfladeareal, sammenlignet med mikroforkalkninger, med et højt volumen, men relativt lille overfladeareal13,16.

Denne proof of concept-undersøgelse har også nogle begrænsninger. For det første, iboende til undersøgelsesdesignet, repræsenterer resultaterne et enkelt tidspunkt, der mangler klinisk opfølgning af forkalkningsprogression. For det andet består dette proof of concept-studie af et relativt lavt antal nyreprøver, da transplantektomi efter sen transplantationsfejl kun udføres på klinisk indikation og tilgængeligheden af ​​afvist donornyrertil forskningsbrug er begrænset23. Derfor bør en omfattende analyse af ætiologien af ​​calciumaflejringer overvejes uden for dette projekts rammer. For det tredje hæmmes den kliniske oversættelse af resultaterne af manglen på viden om in vivo [18F]-NaF-fordeling i nyrerne og effekten af ​​nyresporingsclearance, dvs. en lav mål-til-baggrund-aktivitet kan begrænse visualisering af forkalkninger. For at tackle dette problem bør det optimale tidspunkt for [18F]-NaF PET-billeddannelse vurderes, dvs. ved hvilket [18F]-NaF virkelig udskilles, og den resterende aktivitet kommer fra binding til forkalkede områder. Dette kan muligvis opnås med forsinket billeddannelse på mere end tre timer, som udført til vurdering af koronare forkalkninger24. Den reducerede glomerulære filtrationshastighed fundet hos transplantationsmodtagere kan resultere i en forlænget udskillelsesfase, hvilket kræver en længere periode mellem sporstofinjektion og PET-billeddannelse, men de nuværende retningslinjer indikerer ikke potentiel nefrotoksicitet af [18F]-NaF-sporstoffet11,25. Et potentielt skridt mellem den her præsenterede proof of concept-undersøgelse og in-vivo-billeddannelse kan være ex-vivo [18F]-NaF PET-billeddannelse af normotermiske perfunderede nyrer eller in vivo [18F]-NaF mikroPET-dyreundersøgelser26,27. For det fjerde kan klinisk anvendelse af denne teknik hæmmes af omkostningerne ved at udføre en [18F]-NaF PET/CT-procedure og den iboende strålingseksponering. De nye digitale PET-kamerasystemer med en højere følsomhed kan dog reducere begge dele på grund af kortere scanningstid og lavere injiceret aktivitetsdosis.

Styrken ved denne proof of concept-undersøgelse ligger i den detaljerede en-til-en sammenligning af mikrokalcifikationer identificeret ved [18F]-NaF autoradiografi og histologi. Te [18F]-NaF-optagelse i forskellige prøver kunne sammenlignes uden behov for yderligere justeringer, da alle prøver blev inkuberet i den samme [18F]-NaF-opløsning. Desuden giver denne undersøgelse de første data, der viser en visuel og statistisk match mellem [18F]-NaF-optagelse og histologisk beviste mikrokalcifikationer i nyreprøver.

Cistanche-nyre funktion

For at konkludere giver vi de første data til brugen af ​​[18F]-NaF i en autoradiografiundersøgelse for at identificere mikrokalcifikationer i aktivenefrocalcinoseefternyretransplantation. Dette ex-vivo [18F]-NaF proof of concept-studie er det første skridt mod den potentielle anvendelse af klinisk [18F]-NaF PET/CT hos nyretransplanterede modtagere.

Metoder

Humannyreprøver.

Nyrevæv blev opnået efter transplantektomi (n=13) og fra kasserede nyrer fra afdøde donorer (n=7) i tilfælde af tilbagegang af donorens nyre af tilknyttede transplantationscentre. Kliniske data fra nyretransplanterede modtagere og donorer blev hentet fra patienternes lægejournaler, herunder tilstedeværelsen af ​​hyperparathyroidisme, hyperphosphatæmi og diabetes mellitus før transplantektomi og klinisk patologisk vurdering af nyre-allotransplantatprøver rapporteret ved hjælp af Banf-klassificeringen af ​​nyreallograftpatologi28. Forskningsaktiviteter blev udført i overensstemmelse med erklæringen om Helsinki's etiske principper for medicinsk forskning, der involverer menneskelige forsøgspersoner, og det institutionelle revisionsudvalg gav godkendelse til denne undersøgelse (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle transplantationsmodtagere, og der blev givet godkendelse før donation til brug af kasserede nyrer fra afdøde donorer til forskningsformål. De kliniske og forskningsmæssige aktiviteter var i overensstemmelse med principperne i Istanbul-erklæringen som beskrevet i 'Istanbuls erklæring om organhandel og transplantationsturisme.

Standard Operation Procedure (SOP) for vævsprøvetagning var som følger: Prøver blev taget i det kirurgiske teater umiddelbart efter nyreekstraktion (til transplantektomi) eller ved ankomsten af ​​den kasserede donornyrei vores transplantationscenter. Prøverne anvendt til dette eksperiment blev taget i det tværgående plan af den øvre pol, inklusive kortikalt og medullært nyrevæv, med en størrelse mellem 25 mm × 15 mm og 20 mm × 40 mm. Disse prøver var formalinfikserede og paraffinindlejrede. Ved anvendelse af et mikrotom præcisionsskæreinstrument blev der fremstillet tre µm paraffinindlejrede sektioner. Disse sektioner blev monteret på adhæsionsmikroskopglas (TOMO, Matsunami Glass, USA). Seriesektioner, dvs. tilstødende sektioner, der afslører sekventielle lag afnyrevævsprøver, blev brugt til autoradiografi og histologisk analyse. Før sporinkubation og histologisk farvning blev sektioner afparafniseret, rehydreret i demineraliseret vand og midlertidigt opbevaret i phosphatpufret saltvand (PBS).

[18F]-NaF inkubation og autoradiografi.

Ex-vivo-eksperimentet var baseret på den protokol, der blev brugt i de tidligere undersøgelser af Hop et al. og Reijrink et al.22,29. Det første studie er et autoradiografisk studie af [18F]-NaF-optagelse i carotis plaques fra slagtilfældepatienter under operation, med CT-baseret indikation af forkalkning som sammenligning. Den anden undersøgelse er en autoradiografiundersøgelse af [18F]-FDG-optagelse i fedtvævsprøver med immunhistokemi af serielle snit som en sammenligning. En af hver tre serielle sektioner blev badet i en opløsning af [18F]-NaF i en koncentration på 618 millibecquerel (MBq) i 300 ml PBS ved stuetemperatur i 30 min. Vask blev udført ved tre gange at skylle med kold PBS og to gange med koldt vand. Prøver blev tørret i fri luft, og en blanket fosforskærm blev placeret over prøverne. Eksponering blev udført natten over i en periode på 24 timer og 30 minutter. Bestemmelse af vævsaktivitetsfordeling og intensitet blev udført på en fosforskærm under anvendelse af Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, USA).

Alizarin rød og von Kossa farvning.

Alizarin-rødfarvning blev udført for at visualisere calciumakkumulering i tidligt stadie af forkalkning. Prøver blev inkuberet i 2% vægt/volumen Alizarin rød (opløst i demineraliseret vand) opløsning, pH 4,2 i 5 minutter30. Vask blev udført ved 20 gange skylning i 1:1 acetone/xylen og 20 gange skylning i 100 procent xylen. Von Kossa-farvning blev udført for at visualisere tilstedeværelsen af ​​uorganiske fosfatmolekyler i konsoliderede forkalkninger. Kort fortalt blev prøver inkuberet i 1 procent sølvnitrat (AgNO3) opløsning i 1 time, mens de blev udsat for sollys30. Skiftet med tre gange skylning i demineraliseret vand, blev inkubation udført med natriumthiosulfat i 5 minutter, efterfulgt af inkubation i nuklear hurtig rød i 3 minutter.

Billedbehandling og analyser.

Farvede vævssnit blev digitaliseret med Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), og billeder blev inspiceret ved hjælp af Aperio ImageScope softwareversion 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Tyskland). Autoradiografi og kvantitative computeriserede billedanalyser blev udført med ImageJ-software, version 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Baggrundssubtraktion blev anvendt for alle histologibilleder, idet der blev indsat en kontur ved grænsen af ​​histologiprøven. Halvautomatisk påvisning af forkalkninger i Alizarin red og Von Kossa-farvningen blev udført med ImageJ—BioVoxxel Toolbox31. Der blev anvendt tærskler for alle prøver, og detekterede områder med forkalkning blev udvidet med 6 iterationer for at optimere visualiseringen. Til autoradiografibillederne blev rotation og omstørrelse udført baseret på de originale histologiprøver. Der blev anvendt tærskelværdier for alle prøver, hvilket resulterede i områder med sporstofoptagelse efter fremgangsmåden beskrevet af Irkle et al.: billeder blev tærskelværdier ved hjælp af Otsu-metoden, efterfulgt af Gaussisk sløring og tærskelværdi med Li-metoden16. Overlejringsbilleder blev erhvervet ved at matche konturerne fra de tilstødende histologibilleder med den efterfølgende matchning af histologi- og autoradiografiresultaterne (fig. 1). Pixelbaseret kvantificering af forkalkning og sporareal (som en procentdel af prøvearealet) blev udført med værktøjet ImageJ—Analyze Particles.

Cistanche-nyresygdom symptomer

Statistiske analyser.

Statistik blev udført med Statistical Package for the Social Sciences version 23 (IBM Corporation, Armonk NY, USA), grafer blev lavet med GraphPad Prism 7.02 til Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, USA), og figurer blev produceret ved hjælp af Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, USA). Resultaterne blev præsenteret som median- og interkvartilområdet (IQR) for skæve data og som frekvens og procent, når data var kategoriske. Vi sammenlignede grupper ved hjælp af Mann-Whitney U-tests (to-tailed pvalue<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Datatilgængelighed

Afdøde donor nyre ognyretransplantationsmodtager autoradiografibilleder af [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) optagelse, med overlejringsbilleder af [18F]-NaF optagelse med Alizarin rød farvning af mikrokalcifikationer og Von Kossa farvning af forkalkninger er online tilgængelige som supplerende information. Alle yderligere data vil blive stillet til rådighed efter anmodning i overensstemmelse med IRB-reglerne fra University Medical Center Groningen.

Referencer

1. Gwinner, W. et al. Tidlig forkalkning af nyreallotransplantater påvist ved protokolbiopsier: årsager og kliniske implikationer. Er. J. Transplantation. 5, 1934-1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Hvad ernefrocalcinose?. Nyre Int. 88, 35-43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontin beskytter mod høj fosfatinduceretnefrocalcinoseog vaskulær forkalkning. Nyre Int. 89, 1027-1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Den tidlige tilstedeværelse af calciumoxalataflejring inyregraftebiopsier er forbundet med dårlig langsigtet graftoverlevelse. Er. J. Transplantation. 5, 323-329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Lokalisering, ætiologi og indvirkning af calciumfosfataflejringer i nyre-allotransplantater. Er. J. Transplantation. 9, 2470-2478 (2009).

6. Nankvell, BJ et al. Den naturlige historie af kronisk allograft nefropati. N. Engl. J. Med. 349, 2326-2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Risikofaktorer for kronisk allograft nefropati efter nyretransplantation: en protokolbiopsiundersøgelse. Nyre Int.67, 341-348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Oxalataflejringer i biopsier fra indfødte og transplanterede nyrer og indvirkning på graftfunktionen. Nephrol. Urskive. Transplantation. 24, 1319-1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Oxalataflejring i nyreallotransplantatbiopsier inden for 3 måneder efter transplantation er forbundet med allograftdysfunktion. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Har vi glemt billeddiagnostik før og efter nyretransplantation?. Eur. Radiol. 28, 3263-3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: EANM procedureretningslinjer for knoglebilleddannelse. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767-1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Koronar arteriel 18F-natriumfluorid optagelse. J. Am. Saml. Cardiol. 59, 1539-1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. 18F-natriumfluoridoptagelse er en markør for aktiv forkalkning og sygdomsprogression hos patienter med aortastenose. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371-378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Gennemførlighed af 18F-natriumfluorid PET/CT til billeddannelse af aterosklerotisk plak. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Målidentifikation til diagnosticering og intervention af sårbare aterosklerotiske plaques ud over 18F-fluorodeoxyglucose positron emissionstomografi billeddannelse: lovende sporstoffer i horisonten. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251-265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Identifikation af aktiv vaskulær mikrokalcifikation ved 18F-natriumfluorid positron emissionstomografi. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. 18 F-fluorid-signalforstærkning identificerer mikrokalcifikationer forbundet med aterosklerotisk plaque-ustabilitet i positronemissionstomografi/computertomografibilleder. Circ. Cardiovasc. Billedbehandling 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Vaskulær optagelse på 18F-natriumfluorid positron emissionstomografi: forløber for vaskulær forkalkning? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. et al. Korrelation af inflammation vurderet af 18F-FDG PET, aktiv mineralaflejring vurderet ved 18F-fluorid PET og vaskulær forkalkning i aterosklerotisk plak: en dual-tracer PET/CT-undersøgelse. J. Nucl. Med. 52, 1020-1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. Prædiktiv værdi af18F-natriumfluorid positron emissionstomografi til påvisning af højrisiko koronararteriesygdom i kombination med computertomografi. J. Am. Heart Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Endogene forkalkningshæmmere til forebyggelse af vaskulær forkalkning: en konsensuserklæring fra COST-aktionen EuroSofCalcNet. Foran. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. 18F-natriumfluorid positron emissionstomografi vurderede mikrokalcifikationer i skyldige og ikke-skyldige humane carotis plaques. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064-1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nephrectomy efter transplantationsfejl: nuværende praksis og resultater. Er. J. Transplantation. 7, 1961-1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Tre timers forsinket billeddannelse forbedrer vurderingen af ​​koronar 18F-natriumfluorid PET. J. Nucl. Med. 60, 530-535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Holdningspapir fra Cardiovascular Committee i European Association of Nuclear Medicine (EANM) om PET-billeddannelse af åreforkalkning. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780-792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. DCD-grisens nyrer analyseret ved MRI for at vurdere ex vivo deres levedygtighed. Transplantation 97, 148-153 (2014).

27. Pool, M. et al. Infusion af mesenkymale stromale celler i svinnyrerunder normotermisk maskinperfusion: intakte MSC'er kan spores og lokaliseres til glomeruli. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. En referencevejledning fra 2018 til Banf-klassificeringen af ​​nyreallotransplantatpatologi. Transplantation 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F]FDG-optagelse i fedtvæv er ikke relateret til inflammation ved type 2-diabetes mellitus. Mol. Billedbehandling Biol.23, 117-126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. Vaskulær forkalkning og aorta-fbrose en bifunktionel rolle for osteopontin i diabetisk arteriosklerose. Arter. TrombVascBiol 31, 1821-1833 (2011).

31. Brocher, J. Kvalitativ og kvantitativ evaluering af to nye histogrambegrænsende binariseringsalgoritmer. Int. J. Billedproces. 8, 30-48 (2014).

Anerkendelser

Dette forskningsprojekt er støttet af en bevilling fra De Cock-Hadders Foundation (projektkode 2018-03).

Forfatterbidrag

SB bidrog til design, erhvervelse og analyse og udarbejdede manuskriptet. IFA, MR og MLCB bidrog til design, erhvervelse og analyse og reviderede manuskriptet væsentligt. SPB, CM og MHdB bidrog til undfangelsen og reviderede manuskriptet væsentligt. JLH, RHJAS og RAP bidrog til udformningen, designet og analysen og reviderede manuskriptet væsentligt.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.