Social immunitet hos honningbier: Royal Jelly som et køretøj til at overføre bakterielle patogenfragmenter mellem redekammerater

ABSTRAKT

Social immunitet er en række adfærdsmæssige og fysiologiske træk, der gør det muligt for kolonimedlemmer at beskytte hinanden mod patogener og inkluderer oral overførsel af immunologiske forbindelser mellem redefæller. Hos honningbier er kongelig gelé en kirtelsekretion produceret af en undergruppe af arbejdere, der fodres til dronningen og unge larver, og som indeholder mange antimikrobielle forbindelser. En beslægtet form for social immunitet, transgenerational immune priming (TGIP), gør det muligt for dronninger at overføre patogenfragmenter til deres udviklende æg, hvor de genkendes af embryonets immunsystem og inducerer højere patogenresistens hos det nye afkom. Disse patogenfragmenter transporteres af vitellogenin (Vg), et æggeblomme-precursorprotein, der også bruges af sygeplejersker til at syntetisere royal gelé.

Derfor kan royal gelé tjene som et køretøj til at transportere patogenfragmenter fra arbejdere til andre redefæller. For at undersøge dette har vi for nylig vist, at indtagne bakterier transporteres til sygeplejerskers geléproducerende kirtler, og her viser vi, at patogenfragmenter er inkorporeret i kongegeleen. Desuden viser vi, at indtagelse af patogene celler inducerer højere niveauer af et antimikrobielt peptid, der findes i royal gelé, defensin-1.

Oral administration af immunforbindelser kan signifikant påvirke den menneskelige immunfunktion. Disse forbindelser kan forbedre immuniteten ved at styrke eller modulere kroppens immunsystem. Immunitet er kroppens modstand mod sygdom, herunder forsvarsmekanismer som immunceller og antistoffer. Orale immuniseringsforbindelser kan aktivere immuncellernes aktivitet, øge produktionen af ​​antistoffer i kroppen og hæmme spredningen af ​​patogene bakterier og vira og derved forbedre immuniteten og reducere risikoen for infektion. Derudover kan oral administration af immunforbindelser reducere inflammation og reducere smerte og ubehag forbundet med sygdommen og derved forbedre livskvaliteten. Der er således en stærk sammenhæng mellem oral administration af immunforbindelser og immunitet. Ud fra dette kan vi se, at vi skal være opmærksomme på forbedringen af ​​vores immunitet. Cistanche kan øge immuniteten. Polysacchariderne i kødet kan regulere immunresponset i det menneskelige immunsystem, forbedre immuncellernes stressevne og forbedre steriliseringen af ​​immuncellers effekt.

Klik på sundhedsmæssige fordele ved cistanche

SØGEORD:

Honningbier, social immunitet, kongelig gelé, amerikansk foulbrood.

INTRODUKTION

Royal gelé har længe fascineret biologer på grund af den nøglerolle, den spiller i kasteudviklingen af ​​honningbier. Dette kirtelsekret produceres af en undergruppe af arbejderkasten kendt som sygeplejersker og fodres til dronningen gennem hele hendes udvikling og voksne liv, mens arbejderbestemte larver fodres med royal gelé i de første 3 dage af deres liv, før de skiftes til en mere pollenbaseret kost (Johansson, 1955; Haydak, 1970; Townsend og Lucas, 1940). Efterhånden som analytiske kemimetoder udviklede sig, begyndte forskerne at studere ernæringskomponenterne i royal gelé og fandt ud af, at den indeholdt mange patogendræbende forbindelser, der beskytter dronningen og de unge larver mod sygdom (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990; Okamoto et al., 2003; Romanelli et al., 2011; Sugiyama et al., 2012; Vucevic et al., 2007). Overførslen af ​​antipatogene forbindelser mellem redefæller er en form for social immunitet, en række adfærdsmæssige og fysiologiske træk, der hjælper kolonimedlemmer med at beskytte hinanden mod patogener (Cremer et al., 2007).

En beslægtet form for social immunitet, transgenerationel immun priming (TGIP), har også fået stor opmærksomhed i de seneste år (Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López et al., 2014; Knorr et al., 2015; Salmela et al., 2015). Her kan huninsekter, der overlever et patogenangreb, overføre patogenfragmenter til deres æg og producere afkom, der er mere sygdomsresistente. Disse patogenfragmenter indeholder patogen-associerede molekylære mønstre, strukturelle komponenter, der findes i cellevæggene i mikrobielle celler, som udløser et immunrespons hos det udviklende afkom. Mens TGIP er blevet påvist i honningbier, var undersøgelserne baseret på at injicere dronninger med et podestof, og dette gav et problem: hvordan ville en dronning blive podet med patogener under naturlige forhold, da hun udelukkende lever af royal gelé og ikke har mulighed for at indtage potentielt forurenet nektar og pollen indsamlet af hendes foderbrugere? En stor opdagelse fra vores gruppe antydede en ny mulig vej. Dronninger overfører patogenfragmenter til deres æg ved hjælp af vitellogenin (Vg) (Salmela et al., 2015), et æggeblomme-precursorprotein, der også bruges af sygeplejersker til at syntetisere royal gelé (Amdam et al., 2003).

Honningbier kan således bruge royal gelé som et middel til at overføre patogenfragmenter mellem sygeplejersker og dronninger og larver som en del af en immunvej på koloniniveau. Som et første skridt til at belyse denne vej viste vi, at sygeplejersker, der indtog bakterier, var i stand til at overføre det fra deres mellemtarm til deres geléproducerende kirtler, og at nedbrydning af vg-ekspression forhindrede denne proces (Harwood et al., 2019). Nu søger vi at afgøre, om sygeplejersker, der indtager bakterielle patogener, kan inkorporere dem i deres royale gelé, og om indtagelse af patogener også øger koncentrationen af ​​andre antimikrobielle komponenter i royal gelé.

Forståelse af immunveje hos honningbier er vigtigt ikke kun for feltet af organismebiologi, men også for menneskelig fødevaresikkerhed. Honningbier er den førende insektbestøver i landbruget og tilføjer mindst 15 milliarder dollars årligt til værdien af ​​afgrøder alene i USA (USDA pressemeddelelse, 6. april 2020.

Høje årlige kolonitab fortsætter dog med at plage amerikanske biavlere (United States Department of Agriculture, 2019), på grund af flere stressfaktorer som pesticideksponering og dårlig ernæring. Men biskadedyr og patogener er også store bidragydere og opdages ofte i kolonier, der er omkommet (United States Department of Agriculture, 2019). Disse patogener omfatter et væld af bakterier, svampe og vira, hvoraf mange ikke har nogen farmakologisk behandling. At forstå, hvordan social immunitet medierer patogene infektioner, kunne give mulighed for mere omfattende behandlingsregimer og hjælpe med at reducere sygdomsbyrden, der bidrager til kolonitab.

Det er vigtigt at forstå, hvordan mekanismer for social immunitet modtaget den 12. juni 2020; Accepteret den 17. februar 2021 supplerer det immunologiske forsvar, der findes i individuelle bier.

Honningbier har flere lag af forsvar, startende med strukturelle barrierer som en vandtæt neglebånd, der blokerer patogenindtrængning (Moret og Moreau, 2012). Patogener, der indtages, vil ende i mellemtarmen, det organ, der er ansvarlig for fordøjelse og absorption, og her står de over for en anden fysisk barriere, den peritrofiske matrix (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009). Dette er et kitinholdigt stof, der udskilles fra mellemtarmsepitelcellerne, der fungerer som en sigte for at blokere store partikler som patogenceller fra at blive absorberet.

Hvis patogener overtræder disse fysiske barrierer, detekteres de af patogenmønstergenkendelsesreceptorer, der aktiverer adskillige cellulære og humorale immunresponser. Cellulært forsvar kan omfatte fagocytose af hæmocytter (Evans og Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine og Strand, 2002), mens humorale reaktioner kan omfatte produktionen af ​​melanin til at indkapsle fremmede partikler (González-Santoyo og Córdoba-Aguilar, 2012) og produktionen af ​​antimikrobielle peptider (AMP'er), der direkte dræber patogener (Bulet og Stöcklin, 2005; Bulet et al., 1999; Evans et al., 2006). Melaniseringsreaktionen induceres, når bigift serinprotease (Bi-VSP) aktiverer phenoloxidasekaskaden, der fører til produktionen af ​​melanin (Choo et al., 2010). AMP'er, såsom lysozym og defensin-1, induceres efter aktivering af Toll- eller immundefekt- (IMD)-vejene (De Gregorio et al., 2002).

På trods af et robust anti-patogen arsenal besidder honningbier færre immunrelaterede gener end solitære biarter (Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006), i høj grad takket være udviklingen af ​​social immunitet. Royal gelé indeholder mange af de netop omtalte enzymer og peptider, herunder Bi-VSP, lysozym og defensin-1 samt glucoseoxidase, som producerer hydrogenperoxid, der også dræber patogener (Fontana et al., 2004; Fujiwara). et al., 1990; Romanelli et al., 2011; Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012). Denne berigede føde er især vigtig for de mest sårbare kolonimedlemmer, de unge larver, hvis immunforsvar stadig er under udvikling. For eksempel har unge larver lavere niveauer af pro-phenoloxidase (Chan og Foster, 2008; Chan et al., 2009) (vigtigt i melaniseringskaskaden) og AMP'er (Chan og Foster, 2008) og deres stadig modne mellemtarm og peritrofisk matrix efterlader deres mellemtarmsepitel sårbart over for brud (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez og Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016).

Som et resultat er larver modtagelige for nogle sygdomme, der er ret uskadelige for voksne. Dette omfatter amerikansk foulbrood, forårsaget af de sporedannende Gram-positive bakterier Paenibacillus larver (Genersch, 2010; Hansen og Brødsgaard, 1999). Amerikansk foulbrood-infektion er ikke kun dødelig for kolonier, men også dyr for biavlere, fordi sporer er modstandsdygtige og forbliver levedygtige i årevis, hvilket betyder, at biavlere er tvunget til at ødelægge inficerede bistader. Således kan larverne drage fordel af mad suppleret med forbindelser, der dræber patogener, eller med patogenpartikler, der kan fremkalde immunpriming.

I denne undersøgelse var vores mål todelt: for det første at afgøre, om sygeplejersker, der indtager amerikanske vegetative foulbrood-celler, kunne inkorporere patogenfragmenter i deres royale gelé, og for det andet at fastslå, om dette inducerer højere niveauer af immunproteiner fundet i royal gelé. Til dette formål fodrede vi sygeplejersker med fluorescensmærkede og varmedræbte P. larvae-celler og undersøgte den kongelige gelé, de producerede derefter. Vi brugte fluorescensmikroskopi til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​bakteriecellefragmenter i royal gelé og massespektrometri for at sammenligne den proteomiske profil af royal gelé fra udfordrede kolonier og kontrolkolonier. Især testede vi hypotesen om, at royal gelé fra udfordrede kolonier ville være højere i immunproteinerne glucoseoxidase, Bi-VSP, lysozym og defensin-1.

MATERIALER OG METODER

Dyrkning af patogene bakterier

Vegetative celler af P. larver blev opnået fra Göteburg University kultursamling og dyrket under normale bakteriedyrkningsbetingelser. Kort fortalt blev celler suspenderet i MYPG-bouillon og holdt ved 37 grader natten over i en rysteinkubator, før de blev udpladet på MYPG-agar og efterladt til inkubation i 1 uge ved 37 grader. Derefter blev vegetative celler høstet og suspenderet i 1 x fosfatpufret saltvand (PBS), før de blev varmedræbt i en autoklave. De resulterende ikke-levedygtige bakterieceller blev derefter konjugeret til et fluorescerende farvestof ved hjælp af pHrodo™ Red Phagocytosis Particle Labeling Kit (Invitrogen #a10026) efter producentens instruktioner. Efter farvet blev P. larvae-celler suspenderet i 1 x PBS til en koncentration på 10 mg ml-1 og opbevaret ved 4 grader indtil klar til brug.

Bier og fodringseksperiment

Naturligt parrede europæiske honningbier, Apis mellifera Linnaeus 1758, blev holdt i standard Langstroth-kubekasser på Helsinki Universitet på Vikki-campus i Finland. Disse standard Langstroth bistader tjente som donorer til mindre dronningløse kolonier anbragt i mini-parrende bistader. For at etablere disse mindre dronningløse kolonier blev en sektion af yngelkam indeholdende 1-daggamle larver, der målte 12 cm×12 cm, skåret ud fra donorstaden og overført til en miniparrende Nuc-boks. Omtrent 100-200 sygeplejersker blev også overført fra samme donorstade og anbragt i den mini-parrende Nuc-boks. Sygeplejersker blev identificeret som de individer, der blev set gå ind i yngelceller og fodre larver i donorstaden.

I alt blev der etableret N{{0}} små dronningløse kolonier, hver fra en separat donorkube. Kolonierne blev gjort dronningløse for at stimulere sygeplejersker til at producere mere royal gelé for at lave en ny dronning (Sahinler og Kaftanoglu, 1997). Sygeplejerskerne og de unge larver blev forseglet i de miniparrende Nuc-kasser i 3 dage og forsynet med en 30 procent saccharoseopløsning i en sprøjteføder ophængt fra loftet. N=3-kolonier modtog en kontroldiæt, mens N=3 havde fluorescensmærkede P.-larver tilsat deres saccharose til en endelig patogenkoncentration på 0,6 mg ml−1. Kontrol- og patogenbaserede diæter blev suppleret med frisk mad dagligt. Efter de 3 dage blev nyaflejret royal gelé høstet fra arbejdernes yngelkamme fra hver koloni og opdelt i en af ​​to arbejdsgange: fluorescensmikroskopi eller proteomisk analyse.

Fluorescensmikroskopi

Royal gelé fra hver kam blev overført til 200 µl reaktionsrør. For at estimere volumenet af gelé opnået fra hver bikube fyldte vi 30 reaktionsrør med stigende mængder vand i området fra 1 til 30 µl og fik to observatører uafhængigt og blindt til at vurdere, hvilket vandvolumen der matchede royal gelévolumenet. I alle 6 tilfælde modtog hver kongelig geléprøve det samme volumen-estimat fra de to observatører. Derefter blev hver royal geléprøve fortyndet med 1 x PBS (pH 7,4) til en slutkoncentration på 10 volumenprocent og vortexbehandlet. Prøver blev derefter påført et hæmocytometer og undersøgt under et Leica DM6000 fluorescensmikroskop. På hæmocytometeret er synsfeltet ligeligt opdelt i 9 sektioner, og vi har lavet observationer på 5 sektioner i alt: de 4 hjørnesektioner og midtersektionen. Dette gjorde det muligt for os at beregne koncentrationen af ​​fluorescerende partikler pr. mikroliter royal gelé (C) ved hjælp af følgende formel:

hvor P er det samlede antal positive fluorescerende partikler observeret i hver prøve, S er det samlede antal kvadrater observeret på hæmocytometeret (N{{0}}), V er rumfanget af hver firkant observeret på hæmocytometeret (0,1 µl) og D er fortyndingsfaktoren for den royale gelé (10× fortynding). Alle prøver blev observeret under identiske mikroskopindstillinger.

Kameraet blev indstillet til {{0}}bit opløsning (Waters, 2009), hvilket giver en lysstyrkeintensitetsværdi fra 0 til 65.535. For at identificere positive fluorescenssignaler i vores patogen-diætprøver var vi først nødt til at etablere et basisniveau for baggrundsstøj, over hvilket vi kunne bestemme, om et signal var ægte fluorescens eller blot en artefakt. For at gøre dette undersøgte vi intensitetsværdierne fra hvert billede af vores kontroldiætprøver, og i hvert billede trak vi minimumsintensitetsværdien fra den maksimale intensitetsværdi for at opnå en række baggrundsstøj (Waters, 2009). Vi sammenlignede derefter alle vores kontrol-diætprøvebilleder for at opnå en gennemsnitlig og standardafvigelse af baggrundsstøjområdet. Derefter anså vi ethvert signal, vi observerede i vores patogen-diætprøver, som værende et positivt fluorescenssignal over baggrundsstøj, hvis det var mindst 3 standardafvigelser (P mindre end eller lig med 0,01) over det gennemsnitlige baggrundsintensitetsområde. Det gennemsnitlige (sd) baggrundsintensitetsområde var 329±27

Yderligere positive og negative kontroller

For at bekræfte, at mærkede bakterier kan fluorescere i royal gelé, indsamlede vi royal geléprøver fra flere europæiske og nordamerikanske regioner (Østrig, Norge, Arizona og Illinois, USA), fortyndede dem til 10 procent i PBS-buffer, og tilsat mærkede bakterier (1 volumenprocent) direkte til prøverne. Vi brugte PBS-buffer ved standard pH 7,4 (som anvendt ovenfor) eller ved reduceret pH 4.0, der matcher surhedsgraden af ​​royal gelé for at bestemme, om surheden i miljøet påvirker niveauet af fluorescens, som angivet af producent af mærkningssæt. Desuden udførte vi også en yderligere negativ kontrol (pH 4,0 PBS, ingen mærkede bakterier) for at bekræfte, at observationer af fluorescens ikke skyldtes mikroskopiske artefakter eller autofluorescens af materialekomponenter. Vi fandt, at royal geléprøver fra alle geografiske regioner viste fluorescens, når mærkede bakterier blev tilsat, uanset pH-værdien af ​​den anvendte buffer (fig. S1). Dette mikroskopi arbejde blev udført på en Zeiss AxioZoom V16 ved hjælp af et Axiocam HRm monokrom kamera.

Prøveforberedelse til proteomisk analyse

Royal Jelly-prøverne blev fortyndet ved tilsætning af 15 0 µl 8 mol 1-1 urinstof og sonikeret i et vandbad. Proteinkoncentrationen blev justeret til 2,1 mg ml-1 ved hjælp af Bradford-assayet med et slutvolumen på 100 µl. Cysteinbindinger blev reduceret med 45 mmol 1-1 dithiothreitol (#D0632, Sigma-Aldrich) i 20 minutter ved 37 grader og alkyleret med 0,1 mol 1-1 iodacetamid (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich) ved stuetemperatur. Prøver blev fordøjet ved at tilsætte 0,75 µg trypsin (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega) natten over ved 37 grader. Efter fordøjelse blev peptider oprenset med C18 mikrospin-søjler (Harvard Apparatus) ifølge producentens protokol. De tørrede peptider blev rekonstitueret i buffer A (30 µl 0,1 procent trifluoreddikesyre i 1 procent acetonitril).

Væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri (LC-MS/MS)

Analysen blev udført på en EASY-nLC1{{10}}00 væskekromatograf (Thermo Fisher Scientific) forbundet til et Velos Pro-Orbitrap Elite hybrid massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) med en nanoelektrospray ionkilde ( Thermo Fisher Scientific). LC-MS/MS-prøverne blev adskilt ved hjælp af en to-søjleopsætning bestående af en 2 cm C18-Pepmap-fældesøjle (Thermo Fisher Scientific), efterfulgt af en 15 cm C18-Pepmap-analytisk kolonne ( Thermo Fisher Scientific). Den lineære separationsgradient bestod af 5 procent buffer B (0,1 procent trifluoreddikesyre i 98 procent acetonitril) i 5 minutter, 35 procent buffer B i 60 minutter, 80 procent buffer B i 5 minutter og 100 procent buffer B i 10 minutter ved et flow hastighed på 0,3 µl min−1. For hver LC-MS/MS-kørsel blev 6 ul af prøven injiceret og analyseret. En fuld MS-scanning blev opnået med en opløsning på 60,000 ved det normale masseområde i orbitrap-analysatoren og fulgt med CID-MS2 top 20 mest intense precursorioner i ionfælden (energi 35). Data blev indhentet ved hjælp af LTQ Tune-software.

Protein identifikation

I en shotgun proteomics tilgang fordøjes proteiner enzymatisk til mindre peptider, og disse peptider matches derefter til proteiner i et kommenteret genom. Nogle af disse peptidsekvenser kan deles af flere proteiner, mens nogle er unikke for et enkelt protein i proteomet. Vores analyse gav i alt 496 proteinhits indeholdende mindst 1 peptidspektrummatch (PSM) og 1 unikt peptid.

For yderligere at udelukke falske positiver betragtede vi kun proteiner med mindst 2 unikke peptider som værende pålidelige proteinhits, som det er blevet gjort i andre royal jelly proteomics undersøgelser (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), og dels fordi eksperimentel variation i prøveforberedelsestrin i høj grad påvirker de mindst rigelige proteiner i massespektrometriske prøver (Zhang et al., 2010). Proteiner blev annoteret til Amel_4.5 honningbi-genomet, og vi brugte UniProt og GenBank til at bekræfte deres identiteter og funktioner. Vi sammenlignede derefter overfloden af ​​4 immun-relaterede proteiner i kontrol-diæt og patogen-diæt royal gelé: glucoseoxidase, BiVSP, lysozym og defensin-1.

Statistisk analyse

For at evaluere overfloden af ​​immunrelaterede proteiner mellem kontrol-diæt og patogen-diæt royal gelé sammenlignede vi PSM-værdierne for vores valgte proteiner. Vi brugte ikke-parametriske Wilcoxon-rangsumtests til at adressere vores begrænsede stikprøvestørrelse (N=3 pr. behandling). Vi brugte en-halede sammenligninger, da vores planlagte hypoteser forudsagde, at disse udvalgte immunproteiner ville blive opreguleret i royal gelé fra patogenfodrede kolonier. Fold-ændringer i proteinoverflod blev beregnet som (PSMpathogen-PSMcontrol)/PSMcontrol. Alle analyser blev udført i R (version 3.5.2).

RESULTATER

Patogenfragmenter i royal gelé

Vi fandt ud af, at royal geléprøver fra alle patogen-diætkolonier indeholdt partikler, der fluorescerede med en signifikant højere intensitet end vores etablerede baggrundsfluorescenstærskel (se Materialer og metoder), hvilket tyder på, at bakteriefragmenterne var inkorporeret i royal geléen. Ingen kontrol-diæt royal geléprøver indeholdt partikler, der oversteg denne tærskel (fig. 1). I gennemsnit havde patogen-diætkolonier 66,67±28,87 (gennemsnit±sd) fluorescerende partikler pr. mikroliter royal gelé (N=3), mens kontrolfodrede kolonier havde 0 fluorescerende partikler pr. mikroliter royal gelé ( N=3) (fig. 1).

Proteomics

Vi fandt i alt 496 proteinhits, og af disse havde 44 mindst 2 unikke peptider tildelt dem (tabel 1). De mest rigelige proteiner i alle prøver var store royal geléproteiner, som det var forventet. Generelt var de proteiner, vi observerede i vores prøver, ret i overensstemmelse med andre nyere proteomiske undersøgelser af royal gelé (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), men der er nogle få proteiner identificeret i denne undersøgelse, som ikke er blevet rapporteret andre steder. Disse omfatter Transferrin, et jerntransportmolekyle (Kucharski og Maleszka, 2003), der også findes i honningbiens giftkirtelvæv (Peiren et al., 2008); Serpin-5, en serinproteasehæmmer, der er kendt for at regulere prophenoloxidaseaktivering i andre insekter (Li et al., 2016); Artiskok, et kemosensorisk protein med funktioner i larvebevægelse i Drosophila melanogaster (Andrés et al., 2014); og NPC2-lignende, en kolesteroltransportør med implicitte alloparentale funktioner i honningbier (Thompson et al., 2006). Vi fandt også 3 yderligere proteiner i vores patogen-diæt royal geléprøver: Glutathionperoxidase, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase og et ukarakteriseret protein (LOC725202). Disse proteiner blev også fundet i vores kontrol-diætprøver, men de opfyldte ikke vores kriterier om at have 2 unikke peptider (tabel 1).

Når vi sammenlignede kontrol-diæt- og patogen-diætprøver, observerede vi meget lidt ændring i den relative proteinoverflod i royal gelé (tabel 1). Blandt vores fokale immunproteiner fandt vi ingen signifikant forskel i proteinniveauer mellem behandlinger for glucoseoxidase (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5, P=0.134), eller lysozym (U=2, P=0.184). Vi fandt dog betydeligt mere af AMP-defensinet-1 i patogen-diætprøver end i kontroldiætprøver (U=0, P=0.05) ( Fig. 2). Den havde en fold-ændring på plus 0,68.

DISKUSSION

Denne undersøgelse viser, at sygeplejersker, der indtager celler fra patogenet P. larver, ser ud til at inkorporere fragmenter af cellerne i den royale gelé, de producerer (fig. 1). Vi har for nylig vist, at bakterier indtaget af arbejdere transporteres til hypopharyngeal kirtlerne, stedet for royal gelésyntese (Harwood et al., 2019), og her viser vi, at de er inkorporeret i royal gelé. Dette fund repræsenterer en overset social immunitetsvej, der kan tillade redekammerater at dele immunologisk hukommelse. Vores resultater tyder også på, at kongelig gelésammensætning kan være følsom over for fremmedmateriale, der cirkulerer systemisk i hæmolymfen. I en lignende nyere undersøgelse fandt forskere ud af, at sygeplejersker fodret med dobbeltstrenget RNA (dsRNA) var i stand til at inkorporere disse molekyler i den kongelige gelé og overføre dem til larver, hvor dsRNA'et forblev biologisk aktivt (Maori et al., 2019). dsRNA aktiverer den antivirale RNA-interferens (RNAi)-vej, der fremkalder sekvensspecifik gendæmpning, og syntetisk dsRNA bruges ofte til målrettede gen-knockdown-undersøgelser (Fire et al., 1998). Ydermere viste en anden undersøgelse, at sygeplejersker fodret med pesticider også kan inkorporere spormængder af disse landbrugskemikalier i deres kongelige gelé (Böhme et al., 2018), selvom der her blev lagt vægt på, hvor godt hypopharyngeale kirtler forhindrer systemiske pesticider i at trænge ind i royal gelé. .

Ikke desto mindre indikerer disse resultater, at kongelig gelésammensætning kan være følsom over for ammebiers tilstand. Disse resultater indebærer, at royal gelé kan tjene som en kanal for AB. Fig. 1. Fluorescens- og lysfeltmikrofotografier af royal geléprøver fra kontrol-diæt- og patogen-diætbehandlinger observeret på et hæmocytometer. Alle prøver (A, kontrol-diæt-behandling; B, patogen-diæt-behandling) blev fremstillet samtidigt ved anvendelse af identiske protokoller og observeret under identiske mikroskopindstillinger under anvendelse af en Leica DM6000. Mørke billeder i venstre kolonne blev taget med en TRITC-laser for at identificere fluorescens i Texas Red-bølgelængden, mens billeder i højre kolonne er lysfeltbilleder af det samme område for at vise aflejringen af ​​royal gelé på hæmocytometeret. Positive fluorescenspletter (hvide pile) blev kun observeret i patogen-diætprøverne (B) og ikke i kontroldiætprøverne (A). 4 umiddelbare spørgsmål.

For det første, hvordan fører eksponering for et patogen til, at sygeplejersker producerer forhøjede niveauer af defensin-1 i royal gelé? En mulighed er, at P. larvae-fragmenter binder til patogenmønstergenkendelsesreceptorer i Toll-vejen (for Gram-positive bakterier) og inducerer større gentranskription af defensin-1, men beviset for dette er noget inkonsekvent. Undersøgelser har vist, at voksne arbejdere, der er udsat for bakterier, inklusiv amerikansk fjollet, vil øge ekspressionen af ​​defensin-1 (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994), men en nylig undersøgelse kunne ikke observere signifikant opregulering af defensin-1-ekspression i sygeplejerske-hovedvæv efter eksponering for amerikansk foulbrood (López-Uribe et al., 2017).

Ikke desto mindre kan insekt-AMP'er som defensin-1 observeres i hæmolymfe i uger efter patogeneksponering (Casteels, 1998), selv da transskription af sådanne AMP-gener aftager i løbet af den tid (Uttenweiler-Joseph et al., 1998), så kun måling af genekspression kan gå glip af vigtig information om tilgængeligheden af ​​de endelige peptidprodukter. Alternativt kan patogeneksponering opregulere translationen af ​​defensin-1 mRNA til peptider eller øge hastigheden af ​​post-translationelle modifikationer, der bruges til at aktivere peptidet (Casteels-Josson et al., 1994), men dette skal studeret videre.

Det andet spørgsmål, som disse resultater rejser, er, om en relativ fold-ændring på plus 0.68 i defensin-1 er biologisk relevant. Konventionelt vælger mange humane proteomiske undersøgelser en plus 1,2-tærskel for signifikant opregulering (Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009), så defensin-1 ville ikke opfylde dette kriterium. Selv beskedne stigninger i defensin-1-koncentrationen i royal gelé kan dog forbedre larvernes modstandsdygtighed over for amerikansk foulbrood. Ikke kun har defensin-1 vist sig direkte at hæmme amerikansk snavs (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001), men det er også effektivt mod gram-positive bakterier i koncentrationer så lave som 1 µmol l− 1 (Fujiwara et al., 1990). Endvidere er flere komponenter i det medfødte immunsystem kendt for at arbejde synergistisk, hvorved to komponenter, der arbejder sammen, har større patogenhæmmende virkninger end summen af ​​hver komponent, der arbejder uafhængigt.

For eksempel har bakterievækstinhiberingsassays vist, at AMP'er og lysozym arbejder sammen for i høj grad at forbedre hinandens effektivitet (Chalk et al., 1994). Lysozym har også vist sig at bekæmpe patogener synergistisk med apolipoprotein-III (ApoLp-III) (Zdybicka-Barabas et al., 2013), et lipidtransporterende protein med anti-patogene funktioner i insekter (Whitten et al., 2004; Kim og Jin, 2015), der findes i royal gelé (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Zhang et al., 2014; Fujita et al., 2013). Endelig kan unge honningbilarvers modnende immunsystem kæmpe for at producere deres defensin-1, når de angribes af amerikansk fjollet, da undersøgelser har vist, at en sådan udfordring inducerer ringe eller ingen defensin-1-ekspression i larver (Romanelli et al. al., 2011 Cremer et al., 2007; Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009, dog se Bachanová et al., 2002 for undtagelse). Således kan yderligere defensin-1 fra udsatte sygeplejersker supplere larvernes mangel på denne afgørende AMP. Tilsammen tyder disse resultater på, at selv beskedne stigninger i defensin-1 i kongelig gelé kan være biologisk relevant for at beskytte koloniens mest sårbare medlemmer.

Denne undersøgelse viste også yderligere den kritiske rolle, som proteinet Vg spiller i honningbi-immunitet. På grund af sin rolle som en patogen mønstergenkendelsesreceptor, som er blevet dokumenteret i en bred vifte af dyretaxa (Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al. al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011), såvel som dets rolle i ægdannelsen, er Vg blevet identificeret som bærerproteinet, der transporterer immunelicitorer ind i dronningens æg (Salmela et al. al., 2015). Ligeledes tyder nyere fund hos sygeplejersker på, at Vg spiller en nøglerolle i transporten af ​​indtagne patogener til hypopharynxkirtlerne (Harwood et al., 2019). Vg optages af sygeplejerskernes hypopharyngeale kirtler for at blive brugt som aminosyredonor i produktionen af ​​royal gelé (Amdam et al., 2003), og Vg kan transportere bakterier ind i kirtlerne for at blive inkorporeret i geléen. Vg kan således spille en rolle i alle stadier af TGIP på koloniniveau hos honningbier, fra første podning og inkorporering i kongelig gelé til levering til dronningen eller larverne og til sidst i transporten ind i dronningens æggestokke.

Denne undersøgelse har vist, at kongelig gelésammensætning kan ændres af en patogen udfordring, både ved inkorporering af patogenfragmenter og gennem øgede niveauer af AMP-defensinet-1. Evnen til at overføre patogenfragmenter i royal gelé betyder, at transgenerationel immunpriming kan fungere på et koloniomfattende niveau hos honningbier. Ud over en vertikal overførsel af immunelicitorer fra en reproduktiv hun til hendes afkom, kan honningbier have en mere kompleks vej, der går fra voksent afkom (sygeplejersker) til reproduktivt hunkøn til fremtidigt afkom, såvel som horisontal overførsel fra voksent afkom til umodent. afkom. Fordelen her ville være, at larver inokuleres med et større repertoire af immunelicitorer akkumuleret fra den kollektive immunologiske erfaring fra arbejdere, der samler ressourcer uden for reden, hvilket gør larver mere modstandsdygtige over for patogener, de sandsynligvis vil støde på, når de begiver sig ud af reden. .

Anerkendelser

Vi takker Siiri Fuchs, Salla Lohi, Mati Leponiemi, Franziska Dickel, Maarit Nurminen, Marianne Teichmann og Taina Stark for deres hjælp med dataindsamling og analysekonsultation. Vi takker også Austin Cyphersmith for teknisk assistance med mikroskopi.

Konkurrerende interesser

GH og GA erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser. HS og DF er opført som opfindere på et patent (WO2017017313A1) for en spiselig bivaccine. Dette patent er tildelt Dalan Animal Health Inc., hvor DF fungerer som Chief Scientific Officer. Den forskning, der præsenteres i denne artikel, blev udført uafhængigt, uden økonomiske, materielle eller analytiske ressourcer leveret af Dalan Animal Health Inc. eller nogen anden kommerciel virksomhed.

Forfatterbidrag

Konceptualisering: GH, HS, GA; Metode: GH, HS; Validering: GH; Formel analyse: GH, HS; Undersøgelse: GH, HS; Ressourcer: HS, DF, GA; Datakurering: GH; Skrivning - originalt udkast: GH; Skrivning - anmeldelse & redigering: GH, HS, DF, GA; Visualisering: GH; Supervision: GA; Projektadministration: DF, GA; Finansieringsanskaffelse: GH, DF, GA

Finansiering

GH blev støttet af Arizona State University Graduate Research and Support Program (LM51097GH). DF blev støttet af et Business Finland-stipendium (2348/31/2017) og et Academy of Finland-stipendium (6303369). GA blev støttet af Norges Forskningsråd (262137).

For more information:1950477648nn@gmail.com