Sidt2 er et nøgleprotein i den autofagi-lysosomale nedbrydningsvej og er afgørende for vedligeholdelse af nyrestruktur og filtreringsfunktion Ⅱ

DISKUSSION

Et stort antal undersøgelser har vist, at LMP'er er involveret i nyrefunktion eller strukturel homeostase [21-25]. Vores tidligere undersøgelse viste, at LMP Sidt2 påvirker den inflammatoriske signalvej og forårsager skade på musens glomerulære mesangiale celler [28]. I denne undersøgelse undersøgte vi for første gang virkningerne på strukturen og funktionen af ​​musenyrer forårsaget af LMP Sidt2. Det blev fundet, at Sidt2-deletion førte til sammensmeltning af musenyrefodsprocesserne, fortykkelse af basalmembranen, renalt tubulært epitelcelleødem, mikrovilli-beskadigelse og øget proteinuri efter 24 timer, hvilket indikerer, at tabet af Sidt2 fører til nedsat filtrationsfunktion. og strukturen af ​​musenyren, men dens detaljerede mekanisme er ikke klar.

Fordi LMP'er er vigtige funktionelle enheder af lysosomet [17] oglysosomal dysfunktioner en af ​​de almindelige patogene faktorer for mange kroniske nyresygdomme (CDK'er) (ref. [4, 29]), har vi udført relaterede undersøgelser af lysosomer efter Sidt2-deletion og fundet, at antallet af sure lysosomer faldt, og pH-værdien af lysosomer øges in vitro. Der var dog ingen åbenlyse ændringer i antallet af primære lysosomer bundet til autophagosomer og de totale lysosomer ved elektronmikroskopianalyse. Cathepsiner repræsenterer den største gruppe af proteolytiske enzymer i lysosomer [30], blandt hvilke CTSB er en af ​​de mest udbredte lysosomale proteaser [31].

Da cathepsiner skal forsures for modning (aktivering), vil en ændring i pH i sidste ende føre til en signifikant reduktion i proteinnedbrydning [32]. In vivo og in vitro niveauer viste nedsat aktivitet og indhold af lysosomal syrehydrolase, hvilket yderligere bekræfter, at Sidt2 hæmmer lysosomal funktion ved at påvirke modningen af ​​proteaser i lysosomerne.

KLIK HER FOR AT FÅ URTEFORMULERING AF CISTANCHE TIL NYRE

I mellemtiden fungerer lysosomet som et genbrugscenter for nedbrydning af cellulære metabolitter og affaldsprodukter i slutningen af ​​autofagi [1]. Normal lysosomal nedbrydningsfunktion er afgørende for autofagi, opretholdelse af cellehomeostase og gør det muligt for celler at overleve i fysiologiske tilstande [33-36]. Forekomsten og udviklingen af ​​mange nyresygdomme har vist sig at være relateret til unormal autofagi [37-39]. Nylige undersøgelser har fundet ud af, at Sidt2 er en lysosomal DNA/RNA-transportør. De ukonventionelle typer af autofagi gennem RNautophagy og DNautophagy (RDA) er vigtige for selektiv RNA/DNA-nedbrydning [40]. Vi har tidligere fundet ud af, at deletionen af ​​Sidt2 beskadiger fusionen af ​​autophagosomer og lysosomer, hvilket forårsager, at beskadigede mitokondrier ikke kan nedbrydes, hvilket resulterer i skader på strukturen og funktionen af ​​skeletmuskulaturen [41]. Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse autofagi, når nyreskade var forårsaget af Sidt2-sletning. Vi observerede, at autophagolysosomer blev akkumuleret i nyrerne på Sidt2-/- mus gennem elektronmikroskopi. Autofagi er en dynamisk proces, herunder dannelsen af ​​autofagosomer og dannelsen og nedbrydningen af ​​autophagolysosomer. Dannelsen af ​​tidlige autophagosomer styres af Atg-genet, og dannelsen af ​​LC3-II er et tegn på autophagosomdannelse [42]. Vi fandt ud af, at udtrykkene af autofagi-relaterede proteiner Atg og LC3-II begge steg efter Sidt2-deletion, hvilket indikerer, at autofagi-aktiviteten kan blive forbedret. Akkumuleringen af ​​LC3-II kan dog også være forårsaget af blokering af autophagolysosomes pathway i slutningen af ​​autofagi

For yderligere at udforske virkningen af ​​Sidt2 på den renale autofagi-tilstand blev ekspressionen og dannelsen af ​​P62-lastprotein målt, og også virkningerne af lægemidler, der retter sig mod autofagi (CQ og RAPA), blev undersøgt. P62 skal kombineres med LC3B og derefter nedbrydes i lysosomet. En stigning i niveauet af P62-protein repræsenterer ofte en blokering af autophagy-fluxen [43]. For at eliminere årsagen til stigningen i P62-produktionen målte vi mRNA-niveauet af P62 og fandt ud af, at produktionen af ​​P62 var reduceret, så akkumuleringen af ​​LC3-II skyldtes sandsynligvis forhindret nedbrydning. For yderligere at udforske processen med autofagi udførte vi et chloroquine flip-eksperiment. Klorokin kan neutralisere det sure miljø i lysosomet og efterfølgende ødelægge lysosomets funktion og hæmme autofagi [44]. Stigningen i LC3-II-protein før og efter CQ-behandling afspejler antallet af autofagosomer, der nedbrydes af lysosomer, hvilket kan afspejle aktiviteten af ​​autofagi. Den samme CQ flip-test kan også bruges til at bestemme mængden af ​​P62-nedbrydning gennem autophagolysosom-vejen. I overensstemmelse med vores resultater førte sletningen af ​​Sidt2 til en reduktion i autophagy flow på grund af den blokerede ende af autophagy. På samme tid, i RAPA-eksperimentet, steg LC3-II- og P62-proteinniveauer signifikant i Sidt2−/−-gruppen, hvilket yderligere kan understøtte, at manglen på Sidt2 forringer slutfasen af ​​autofagi.

Slutfasen af ​​autofagi omfatter dannelse og nedbrydning af autophagolysosomer. Vi brugte LAMP1 og LC3B immunofluorescens co-lokaliseringseksperimenter til at detektere fusionen af ​​autophagosomer og lysosomer [45, 46], og resultaterne viste, at fusionen af ​​autophagosomes og lysosomer blev blokeret efter Sidt2 deletion. Ad-mCherry-GFP-LC3B dobbeltmærkningseksperimentet detekterer dannelsen og nedbrydningen af ​​autophagolysosomer [27]. Det bekræftede endvidere, at blokeringen af ​​dannelsen og nedbrydningen af ​​autophagolysosomer er hovedårsagen til skaden på nyrestruktur og funktion efter Sidt2-deletion.

Fra ovenstående resultater kan vi konkludere, at fraværet af Sidt2 forårsager et fald i antallet af sure lysosomer, og at forsuringsdysfunktionen af ​​lysosomerne påvirker modningen af ​​hydrolyserede enzymer. Dette kan være den vigtigste årsag til skade på autofagi-lysosom-nedbrydningsvejen ud over autophagosom- og lysosomfusionsforstyrrelser. I mellemtiden kan den svækkede autofagi-proces være tæt forbundet med den beskadigede nyrestruktur og filterfunktion efter Sidt2-deletion (fig. 8). Vores undersøgelse behandler kun en del af virkningerne af Sidt2 på nyrernes struktur og funktion, men det interessante er, at ophobningen af ​​nøgleautofagiproteiner og svækkelsen af ​​nyrestrukturen og -funktionen forårsaget af Sidt2-deletion ligner ændringerne i nøgleautofagiproteiner og signifikant øget proteinuri set ved diabetisk nefropati [37, 47]. Reparationen af ​​lysosomfunktionen kan være en potentiel ny strategi til behandling af diabetisk nefropati [37]. Vi forventer, at Sidt2 vil give en måde at udforske patogenesen og behandlingen af ​​nyresygdomme i fremtiden.

Urinproteintest i mus Tilfældigt udvalgte 12-ugegamle WT-mus og Sidt2−/− hanmus blev placeret i metaboliske bure og fastede, men fik vand. 24 timers urinprøver blev indsamlet og derefter testet for urinprotein (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (se venligst det supplerende materiale for detaljerede metoder). Celler MPC5 muse glomerulære podocytter blev købt fra BeNa Culture Collection og dyrket med 10% FBS (Excell Bio, Sydamerika, FSP500) og lav-glucose DMEM (Sigma-Aldrich, 6046). SV40 MES 13 muse glomerulære mesangiale celler blev købt fra den typiske kulturkonserveringskomité cellebank i det kinesiske videnskabsakademi og dyrket med 10% FBS (Excell Bio, Sydamerika, FSP500) og høj glucose DMEM (Sigma-Aldrich, 6429) . Cellekulturboksens CO2-koncentration blev holdt på 5 %, og temperaturen blev holdt på 37 grader. Chloroquin (CQ) og rapamycin (RAPA) blev købt fra Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ og 25 mg/ml rapamycin blev begge opløst i ultrarent vand. CQ blev tilsat til petriskålen, så den endelige koncentration var 50 μM, og inkuberet i 16 timer som en autophagy-inhibitor. Rapamycin blev tilsat til petriskålen i en slutkoncentration på 15 μM og inkuberet i 2 timer som en autofagi-aktivator. CRISPR/Cas9 genredigerende lentivirus vektorsystem blev brugt til at fjerne Sidt2 genet Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) plasmider blev købt, og sgRNA online designværktøjet (http://crispr.mit.edu/) blev brugt til at design sgRNA målrettet mod Sidt2.

Primersekvenserne var som følger: F: 5'-ACCACACCGTGACCC CAC-3', R: 5'-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3', syntetiseret af et bioteknologisk firma (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Ved at bruge CRISPR/Cas9 lentivirussystemet blev Lenticrispr-v2-plasmidet lineariseret og koblet til den annealede sgRNA-dupleks for at konstruere det rekombinante Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2-plasmid. Vigofect (Vigorous Biotechnology, Beijing, CHN) transfektionsreagens blev brugt til at transficere Lenticrispr-v2-plasmidet og det rekombinante Lenticrispr-v2-Sidt2-plasmid for at konstruere lentivirusset. Det opnåede lentivirus blev transficeret ind i MPC5-cellerne og SV40 MES 13-cellerne. Efter 48 timer blev cellerne inkuberet med purinomycin i 72 timer til selektion. De overlevende celler var Sidt2+/+-gruppen og Sidt2−/−-gruppen, der var blevet transficeret med succes. RNA-isolering og real-time PCR-assay Trizol (Invitrogen) blev brugt til at ekstrahere RNA fra musenyreceller, og den specifikke RT-PCR-metode var som beskrevet tidligere [21]. Primersekvenserne for RT-PCR var som følger: Actin (sense: F: 5'- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3', R:5'-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3'), P62 (sense: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(sans: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5'CAAGGTCAGTCAGT {48}}′). Western blotting Den specifikke metode er som nævnt før [28]. I denne undersøgelse inkluderede primære antistoffer kanin anti-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), kanin anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719), muse anti- -Actin (1:1000; Sigma Aldrich) A5316), kanin anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), kanin anti-Atg5 (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), kanin anti-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , kanin anti-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), muse anti-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), kanin anti-cathepsin B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Cellerne blev podet på Nunc-petriskåle med glasbund. Efter vækst til en passende tæthed blev Ad-mCherry-GFP-LC3B tilsat (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), hvilket resulterede i en slutkoncentration på 10-11 vp/ml. Efter stimulering i 48 timer blev antallet af mCherry- og GFP-fluorescenspunkter observeret direkte under det konfokale lasermikroskop (Leica SP8, Tyskland). Immunfluorescens Cellerne blev inokuleret på petriskåle med glasbund og fikseret med paraformaldehyd. Efter blokering blev cellerne inkuberet natten over med primært antistof og derefter inkuberet med sekundært antistof i 90 minutter i mørke. Cellerne blev fotograferet ved hjælp af laserscanning konfokalmikroskop (Leica SP8, Tyskland) efter farvning af kernerne med DAPI (1 ug/ml). Primære antistoffer inkluderede P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); sekundære antistoffer inkluderede anti-mus sekundær anti Cy3-konjugeret Affinipure ged anti-muse IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-konjugeret Affinipure ged anti-muse-IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594--konjugeret Affinipure gede-anti-kanin-IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Til LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046) inokulerede vi også cellerne på petriskåle med glasbund. Efter vækst til en passende tæthed blev cellekulturvæske indeholdende en LysoTracker slutkoncentration på 75 nM tilsat til cellerne, som blev fotograferet efter 45 m stimulering. Brug ImageJ til at tælle antallet af fluorescerende prikker og Pearson-korrelationskoefficienten. Transmissionselektronmikroskopobservationer Fra hver gruppe blev 3-5 12-ugers Sidt2-/- og WT hanmus tilfældigt udvalgt til at forberede elektronmikroskopiprøver af nyrevævet, og den specifikke metode er som beskrevet tidligere [48] , tag tilfældigt billeder af snittene ved hjælp af et elektronmikroskop, der er mere end 10 billeder taget fra nyresnit for hver mus, vælg tilfældigt 3-5 billeder med 8000× forstørrelse fra elektronmikroskopbillederne af hver mus, beregn antallet af autophagolysosomer på billedet, og sammenlign Sidt2−/−-gruppen med WT-gruppen. Med hensyn til klargøring af celleelektronmikroskopprøver, skrab ikke mindre end 105 celler med en celleskraber og opsaml dem i et EP-rør, centrifuger derefter ved 800 rpm/min i 5 m, kasser supernatanten og fyld den med elektronmikroskopfikseringsmidlet. Efter at have været opbevaret i et 4 graders køleskab i mere end 1 time, kan den sendes til eftersyn. Elektronmikroskopbilledet blev taget af KingMed Diagnostics (Guangzhou, Kina). LysoSensor Cellerne blev inokuleret på en 96-brøndplade. Efter vækst til en passende tæthed blev et forvarmet (37 grader) medium indeholdende 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545) tilsat. Cellerne blev inkuberet i 5 minutter ved 37 grader, og derefter blev mediet fjernet og erstattet efter vask af cellerne tre gange med PBS. WellScan-tilstand blev brugt til at læse pladen i BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA). Fluorescens blev målt under anvendelse af Ex360nm/Em450nm og Ex380nm/Em540nm excitations/emissionsbølgelængder, og lysosomets pH blev bestemt ud fra forholdet mellem Em540 og Em450. Statistisk analyse Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SEM. Statistisk sammenligning mellem to grupper blev udført ved hjælp af uparrede t-tests. Når Graphics 8.0-software blev brugt til statistisk analyse, blev P < 0,05 betragtet som statistisk signifikant. Hver gruppe af eksperimenter i denne undersøgelse blev gentaget mindst tre gange uafhængigt. DATA TILGÆNGELIGHED De datasæt, der genereres og/eller analyseres under den aktuelle undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter rimelig anmodning.

REFERENCER

1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Signaler fra lysosomet: et kontrolcenter for cellulær clearance og energimetabolisme. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14:283-96.

2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lysosom: Den metaboliske signaleringshub. Trafik. 2019;20:27–38.

3. Ballabio A. Det fantastiske lysosom. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.

4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, et al. Fedtrig diæt-induceret lysosomal dysfunktion og nedsat autofagisk flux bidrager til lipotoksicitet i nyrerne. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1534-51.

5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Rørbeskadigelse og regenerering i rottenyren efter akut eksponering for gentamicin: en tidsforløbsundersøgelse. Ren Fail. 1992;14:507-21.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Shop for flere specifikationer detaljer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIGE ØKOLOGISKE CISTANCHE EKSTRAKT MED 25% ECHINACOSIDE OG 9% ACTEOSIDE TIL NYRE