Omledning af glukose- og lipidmetabolisme induceret af G-proteinkoblet receptor 17 Silencing muliggør overgangen af ​​oligodendrocyt-progenitorer til myeliniserende celler Ⅱ

3. Resultater

3.1. GPR17 Silencing i differentiering af OPC'er ændrede signifikant udtrykket af gener involveret i lipid- og glukosemetabolisme

For at fremhæve de biologiske processer, der er væsentligt påvirket af GPR17-ekspression under OL-differentiering, interfererede vi med dets ekspression ved at transficere rotte OPC'er med SMART-pool siRNA'er, der er specifikke for rotte GPR17. Efter at have valideret vellykket GPR17-knockdown ved qRT-PCR (Figur S1), udførte vi en mikroarray-analyse af 30.584 rottetranskripter i GPR 17-dæmpede kontra kontrol OPC'er og analyserede de differentielt udtrykte gener (DEG'er) ved hjælp af forskellige bioinformatiske værktøjer. For det første er 640 DEG'erne blevet undersøgt af Meta-Core for at udføre en pathway-berigelsesanalyse og identificere de processer, der forventes at blive væsentligt påvirket. Denne analyse foreslog ændring af mTOR-signaleringen, som allerede har vist sig at være forbundet med GPR17-funktionen [37], og af andre processer, der vides at være relevante for OPC-modning, såsom "ombygning af cytoskelet"og"regulering af lipidmetabolisme" (Tabel 1).

plus

Klik her for at kende Cistanche for knoglevækst

Tabel 1. Softwaren MetaCore er blevet brugt til at udføre en pathway-berigelsesanalyse på DEG'erne efter GPR17 silencing. Tabellen viser de mest signifikante veje, der er resultatet af analysen, antallet af associerede gener og af almindelige gener inkluderet i datasættet

Derefter blev værktøjet Ingenuity pathway analysis (IPA) brugt til at udføre et analysematch, som automatisk identificerer kurerede IPA-datasæt med betydelige ligheder og forskelle sammenlignet med et forespørgselsdatasæt. Denne analyse styrker den forudsagte forbindelse mellem GPR17-ekspression og lipidmetabolisme, hvilket viser, at ekspressionsændringerne af 38 gener i vores datasæt (tabel S1) er forbundet med ændret fedtsyresyntese (figur 1). Blandt disse inducerede GPR17 silencing opregulering af LXR (lever X receptor alfa, NR1H3 i figur 2 og tabel S1, en nuklear receptor, der reagerer på oxysteroler) og SREBP1 (sterol regulatorisk element bindende protein 1, SREBF1 i figur 1 og tabel S1), to), nøglespillere i fedtsyre- og kolesterolsyntese. I vores datasæt observerede vi også, at adskillige ændrede gener, herunder PDH (pyruvat dehydrogenase), Ldha (lactat dehydrogenase alpha) og Pdk1 (pyruvat dehydrogenase kinase 1), er relateret til glucosemetabolisme og Krebs' cyklus, hvilket tyder på den potentielle involvering af GPR17-receptoren i reguleringen af ​​disse metaboliske processer. Ifølge dette afslørede en genontologi-baseret berigelsesanalyse (ToppGene suite) på DEG'erne ændring af "monocarboxylsyremetaboliske proces" (GO:{{20}}032787, p- værdi: 0,02), ud over andre processer relateret til CNS-udvikling og cellemetabolisme, såsom "regulering af nervesystemets udvikling" (GO:0051960, p-værdi: 0,033) og "sfingolipidmetaboliske processer" (GO:0006665, p-værdi : 0,043) (Figur 2; fuld liste i tabel S2).

Globalt tyder disse ændringer på, at GPR17-silencing kan fungere som en trigger til at adressere celler til myelinisering ved at tune adskillige gener, der er involveret i transkriptionel regulering af lipid- og glucose-homeostase, samt ved at udnytte kolesterol og lipider til myelinproduktion.

Figur 1. Opfindsomhedsvejanalyseværktøj (IPA, Qiagen) blev brugt til at analysere datasættet og udforske de sygdomme og biologiske processer, som forudsiges at være stigende eller faldende baseret på mønstret af differentielt udtrykte gener i datasættet. Fra denne analyse ekstrapolerede vi skemaet i figuren, der inkluderer generne relateret til lipidsyntese differentielt udtrykt i vores datasæt (p-værdi=9.67 × 10−4). De fulde navne på disse gener sammen med den relative foldændring (log2-forhold) er rapporteret i tabel S1. I røde opregulerede gener; i grønne, nedregulerede gener

Figur 2. Toppgene suiten er blevet brugt til GO-baseret berigelsesanalyse på DEG'erne. Billedet viser nogle af de væsentlige biologiske processer relateret til centralnervesystemet og cellemetabolisme potentielt ændret af GPR17 silencing. Blå søjler angiver det samlede antal gener forbundet med hvert led; røde søjler angiver generne til fælles med vores datasæt for hvert udtryk. Den komplette liste over biologiske processer som følge af denne analyse og de relative p-værdier er rapporteret i tabel S2.

3.2. Metabolomisk analyse under OPC-differentiering in vitro

For at vurdere korrelationen mellem GPR17-ekspression og aktiveringen af ​​specifikke metaboliske veje udførte vi en metabolomisk analyse af dyrkede OPC'er under deres fysiologiske modning. OPC'er blev opretholdt i et differentieringsmedium og derefter lyseret på fire forskellige tidspunkter (efter 0, 1, 3 og 5 dage i differentiering, DID), som svarer til forskellige stadier af OL-modning. Parallelt hermed blev OPC'er dyrket og farvet til GPR17 og MBP for at vurdere, at modningen i alle eksperimenterne skete med den forventede timing. Resultaterne viste, at antallet af GPR17--udtrykkende celler nåede sit maksimum ved 3 DID og derefter vendte tilbage mod basale niveauer ved 5 DID, hvorimod antallet af MBP-positive celler steg gradvist under modning (figur 3a), i overensstemmelse med tidligere resultater [37]. OPC metabolomisk evaluering blev udført ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) som tidligere beskrevet [38], med fokus på energiske metabolitter involveret i glykolyse, pentosephosphatvejen, Krebs-cyklussen, fedtsyreoxidation, deres cofaktorer NADH, NAD plus , NADPH, NADP plus , ATP, ADP, AMP, aminosyrer og nogle af deres derivater. De metabolomiske profiler for de analyserede fire-tidspunkter er rapporteret i figur 3b. På dag 0 var niveauerne af adskillige metabolitter, der tilhører og/eller er knyttet til Krebs-cyklussen (f.eks. succinat, malat, alfa-ketoglutarat, glutamat, aspartat, alanin og prolin) højere, som forventet fra celler, der kommer fra en stærkt prolifererende tilstand (figur 3c). På mellemstadier (fra DID 1 til 3) viste OPC'er en markant opregulering af molekyler involveret i fedtsyre- og kolesterolsyntese. Derfor observerede vi øgede niveauer af acetyl-CoA (figur 3c), som repræsenterer forløberen for kolesterol og fedtsyrer og for malonyl-CoA, et specifikt mellemprodukt af fedtsyresyntese. Ved DID 5 observerede vi øgede niveauer af adskillige acylcarnitiner og aminosyrer parallelt med en signifikant stigning af fri intracellulær glucose (figur 3c). Vi observerede også faldende niveauer af AMP og ADP fra dag 0 til DID 5 og en forbigående stigning i ATP mellem DID 1 og DID 3. Disse data indikerer, at fra dag 0 til DID 3, svarende til det tidsmæssige vindue, hvorunder GPR17 når sit maksimale udtryk, brugte OPC'er hovedsageligt glucose og aminosyrer til at opretholde kolesterol- og fedtsyrebiosyntese. Ved DID 5, som fremhævet af øgede acyl-carnitin-niveauer, er OPC'er sandsynligvis afhængige af fedtsyreudnyttelse. Tilsammen indikerer disse data, at OPC'er under fysiologisk differentiering gradvist omformer deres energiske metabolisme til at blive modne myeliniserende OL'er.

3.3. Metabolomisk analyse efter GPR17 Silencing under OPC-modning in vitro

For at afsløre bidraget fra GPR17-receptoren til at drive de energimetaboliske ændringer, der opstår under celledifferentiering, udførte vi metabolomics på GPR17--dæmpede OPC'er sammenlignet med kontrol-OPC'er, der modtog et scrambled RNA. Vi undersøgte først virkningen af ​​GPR17-silencing på OPC-modning ved immunfluorescensfarvning for GPR17 og MBP. Som forventet fandt vi efter receptordæmpning en reduktion i GPR17-farvning, tydeligt synlig ved 3 DID. Vi observerede også en markant stigning i antallet af modne MBP-positive OL'er ved både 3 DID (ikke vist) og 5 DID (figur S2). Parallelt hermed blev der udført detaljeret qPCR-analyse på fem tidspunkter (0, 1, 2, 3 og 5 dage i differentiering, DID), hvilket i kontrol-OPC'er afslørede en stærk stigning i GPR17-ekspression efter 1 DID, der når signifikante niveauer startende efter 2 DID, en progressiv stigning i MBP-ekspression op til 5 DID og et signifikant fald i den tidlige markør NG2 (figur 4a). Omvendt, efter GPR17-silencing (figur 4b), nåede GPR17 mRNA lavere niveauer ved DID1 og forblev derefter stabilt lavt, MBP-ekspression steg yderligere og NG2 faldt yderligere. En direkte sammenligning af NG2- og MBP-udtryk i GPR17-dæmpede versus kontrol-OPC'er på hvert tidspunkt er vist i figur 4c. Tilsammen tyder disse resultater på, at under disse eksperimentelle forhold accelererede GPR17-dæmpning i OPC'er deres differentieringsproces. Derefter blev OPC metabolomics udført af LC-MS/MS på de fem valgte tidspunkter. Sammenligning af metabolomiske data opnået fra GPR17-dæmpede og kontrollerende OPC'er på hvert tidspunkt gjorde det muligt for os at identificere de metabolitter, der er væsentligt påvirket af GPR17-dæmpning

Figur 3. (a) Grafen viser ændringer i procentdelen af ​​GPR17 plus og MBP plus celler under differentiering. n=3 pr. gruppe; envejs ANOVA med Tukeys test. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) Varmekortet viser metabolitoverflod i hver enkelt prøve stoppet ved 0, 1 , 3 eller 5 DID. Forekomsten af ​​de analyserede metabolitter er repræsenteret ved en kromatisk skala, der spænder fra mørkeblå (meget lav forekomst) til mørkebrun (meget høj forekomst). n=4–5 pr. gruppe. (c) Metabolitter med en abundance, der er signifikant forskellig blandt tilstandene (0, 1, 3 og 5 dage i differentiering, DID; envejs ANOVA med Fishers LSD-test).

Ved DID 1 (figur 5a) fandt vi ikke væsentlige ændringer. Ved DID 2 (figur 5b) fandt vi en signifikant stigning i nogle metabolitter i Krebs-cyklussen (malat, fumaratcitrat), en beskeden stigning i frit carnitin (CO), acetyl-carnitin (C2), propionyl-carnitin (C3: 0), butyryl-carnitin (C4:0), valeryl-carnitin (C5:0), hexadecanoyl-carnitin (C16:0og en betydelig reduktion af glukose , lactat, kreatin og ornithin. Reduktionen af ​​olieaktat og kreatin og stigningen af ​​propionylcarnitin (C3) blev også observeret ved DID3 (figur 5c). Ved DID 5 (figur 5d) fandt vi stadig en stigning i fri carnitin ( CO), acetylcarnitin (C2), propionylcarnitin (C3:0), butyrylcarnitin (C4:{{30}}), valerylcarnitin (C5:0 )tetradecanoyl-carnitin (C14:0), hexadecanoyl-carnitin (C16:0), octadecanoyl-carnitinC18:0), octadecenoyl-carnitin (C18:1), svarende til hvad der oprindeligt blev observeret i mere differentierede celler (se figur 3), en stigning i dihydroxyacetone-3-phosphat/glyceraldehyd3-phosphat (DHAP/GAP), fumarat og citrat og et fald i acetyl-CoA, Met-SOcreatin, taurin og carnosin.

Figur 4. Effekt af GPR17-dæmpning på OPC-modning. Ekspressionsniveauerne for GPR17 (grøn), NG2blå) og MBP (rød) blev evalueret ved real-time PCR under differentiering i kontrolbetingelser (celler transficeret med scramble RNA og efter GPR17 silencing (b), og normaliseret versus ekspression ved T{{ 6}} (indstillet til 0). n=6 pr. hvert tidspunkt. Envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest (a): ** p < {{10} }.001 vs. DID 0-2-3-5, @ p < 0.05 vs. DID 3-5; ## p < 0.01 vs. dag 0; SSS p < {{30}}.001 VS. DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 vs. DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 vs. dag 0, # p < 0,05, ### p < 0,001 vs. dag 0.S p < 0,05, SS p < 0,01, SSS p < 0,001 V. DID 5. (C) NG2- og MBP-udtryk i GPR17-dæmpede OPCsvs. kontrollerer OPC'er (sat til 0) på hvert tidspunkt. Foldændring (FC) er blevet rapporteret som LOG,(FC). Én prøve t-test, * p < 0,05, * p < 0,01; *** p < 0,001 vs. relativ DID i kontrol OPC'er.

Figur 5. Metabolomiske ændringer induceret af GPR17 silencing i OPC'er. (a–d) Forekomsten af ​​hver metabolit efter GPR17-dæmpning er blevet normaliseret til den i den relative kontrolprøve. De resulterende foldændringer blev brugt til at generere et vulkanplot for hvert tidspunkt (1, 2, 3, 5 dage i differentiering). Punkterne over den stiplede vandrette linje repræsenterer de metabolitter, der har vist en statistisk signifikant ændring (Fishers LSD korrigeret med FDR; p.adj < 0.1). I grønt, metabolitter med lavere udtryk, i rødt, dem med højere udtryk, efter GPR17-dæmpning. n=7-9 pr. hver gruppe. DID: dage i differentiering.

3.4. GPR17 modulerer laktatfrigivelse under OPC-modning

Baseret på de ovenfor beskrevne metabolomiske resultater blev GPR17-dæmpning fundet at reducere de intracellulære niveauer af laktat. For at vurdere, om denne reduktion afspejler et generelt fald i lactatmetabolisme eller en øget frigivelse af denne metabolit, målte vi dens niveauer i cellelysater og i de tilsvarende medier på forskellige tidspunkter. Som vist i figur 6 nåede intracellulært lactat under kontrolbetingelser den højeste mængde ved DID 2 (figur 6a) (når GPR17-receptorekspression også er maksimal), og derefter reduceredes det, når cellerne blev modne. I stedet, efter GPR17-silencing, blev stigningen af ​​intracellulært laktat afskaffet, og dets niveauer faldt yderligere mod differentiering. Faktisk fremhævede en sammenligning af lactatniveauer i GPR17-dæmpede OPC'er versus kontrol-OPC'er på hvert tidspunkt en reduktion i dets niveauer ved DID 2 og 3 (figur 6b). Det ekstracellulære lactat fulgte forskellig kinetik og viste en signifikant reduktion sammenlignet med DID 1 ved DID 2-3-5 i kontrolforhold, hvorimod den i GPR17-dæmpede OPC'er forblev stabilt højere og faldt derefter signifikant ved DID 5 (figur 6c) ). Men når man sammenlignede laktatniveauer på de forskellige tidspunkter mellem de to eksperimentelle forhold, hæmmede GPR17-dæmpning den fysiologiske reduktion,øget tilstedeværelse af laktati mediet ved DID 2 og 3 (figur 6d),tyder på en øget frigivelse.

Figur 6. GPR17-silencing i OPC'er ændrer laktatmetabolismen. (a) Laktatoverflod under OPC-modning under kontrolforhold (grøn linje) og efter GPR17-dæmpning (orange linje). n=7–9 pr. gruppe. Envejs ANOVA med Tukeys test af flere sammenligninger. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 vs. DID1 siGPR17 (b ) Lactatniveauer efter GPR17-dæmpning blev normaliseret i forhold til kontrolprøver (sat til 1) på hvert tidspunkt (n=7–9). ** p < 0,01; en prøve t-test. Konditionerede medier fra GPR17-dæmpede OPC'er og kontrol-OPC'er blev indsamlet fra den samme kultur, der blev brugt til metabolomisk analyse. Laktatniveauer i mediet blev evalueret ved LC-MS/MS. (c) Mængden af ​​laktat i det ekstracellulære rum under OPC-modning under kontrolforhold (grøn linje) og efter GPR17-silencing (orange linje). Envejs ANOVA med Tukeys test af flere sammenligninger. ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. DID1 CTL; § p < 0,05 vs. DID5 siGPR17. (d) Ekstracellulære laktatniveauer efter GPR17-dæmpning blev normaliseret versus kontrolprøver (sat til 1) på hvert tidspunkt. * p < 0,05; ** p < 0,01; en prøve t-test. Effekten af ​​MCT1-hæmning i kontrol- (f.eks.) og GPR17--dæmpede (f,h) OPC'er er blevet evalueret ved at analysere udtrykket af MBP i inhibitorbehandlede prøver vs. relative kontroller (bilbehandlede) ved 3 og 5 dages differentiering. n=6 pr. gruppe.

En af de mekanismer, hvorvedOPC'er kan frigive laktater gennem monocarboxylattransportøren MCT1. Desuden rapporterede nyere undersøgelser, at OPC'er selv kan erhverve ekstracellulært laktat gennem MCT-receptorer, der fremmer deres cellecyklus og -differentiering [39]. Derfor spekulerede vi på, om den øgede frigivelse af laktat induceret af GPR17-silencing kunne medieres af MCT1, og om dette kan være delvist ansvarlig for den effekt, der observeres på OPC-modning under de samme forhold (figur 4). Til dette formål behandlede vi OPC'er med AR-C155858, en selektiv hæmmer af MCT1, under normal differentiering og efter GPR17-dæmpning. Som forventet blev laktatfrigivelse med succes hæmmet under begge betingelser (figur S3). Virkningen af ​​MCT1-hæmning på OPC-modning under de forskellige eksperimentelle forhold blev evalueret ved at analysere ekspressionsniveauerne af MBP. En beskeden reduktion i genekspressionen af ​​MBP, som er tæt på statistisk signifikans (p=0.07), er kun blevet fundet i prøver transficeret med specifik siRNA for GPR17 (figur 6e–h); der opstod imidlertid ingen signifikant variation i prøverne transficeret med kontrol-RNA (siNEG). Disse resultater tyder på, at stigningen i ekstracellulært laktat medieret af GPR17-nedregulering fremmer modningen af ​​OPC'er; det lille omfang af MBP-reduktion indikerer dog, at denne metabolit ikke er den eneste faktor, der er involveret i processen.

3.5. Lipidomisk analyse efter GPR17 Silencing under OPC-modning

Resultaterne af den transkriptomiske analyse efter GPR17-silencing fremhævede også en potentiel sammenhæng mellem dens funktion og de syntetiske veje af lipider og kolesterol, som er hovedkomponenterne i myelin. For yderligere at undersøge GPR17's rolle i lipidmetabolisme anvendte vi LC-MS/MS til den lipidomiske analyse af GPR17-silented OPC'er efter 2, 3 og 5 dages differentiering sammenlignet med dag 0. Listen over de analyserede lipider, relative foldændringer og p-værdier er rapporteret i tabel S4. De to mest udbredte lipidklasser i forsøgsgrupperne var fedtsyrer og diacyl-phosphatidylcholin (PCaa) familien. Under differentieringen af ​​kontrol OPC'er fandt vi ikke nogen signifikante ændringer i mængden af ​​nogen lipidklasse. I stedet viste GPR17-dæmpede OPC'er en tendens til en ændret overflod af frie fedtsyrer, ceramider, acyl-alkyl-phosphatidylcholin (PCae) og phosphatidylinositol (PI) sammenlignet med kontrol-OPC'er, især ved DID 3 og 5, men kun diacyl-phosphatidylethanolamin (PEaa) og sphingomyelin (SM) viste en statistisk signifikant ændring (figur 7).

Figur 7. Ændringer i lipidklassernes overflod induceret af GPR17-silencing under OPC-differentiering. Forekomsten af ​​hver lipidklasse under kontrolforhold på forskellige tidspunkter er rapporteret (a) Kinetikken af ​​hver lipidklasse efter GPR17 silencing blev analyseret: (b) fedtsyrer, (C) ceramider (d) LysoPC (lysophosphatidyl-choliner), (e) LysoPE (lysophosphatidylethanolaminer), (f) PCaa(diacyl-phosphatidyl-choliner), (g) PCae (acyl-alkyl-phosphatidyl-choliner), (h) PEaa (di-acylphosphatidyl-ethanolaminer), (i) PEae (acyl-alkyl-phosphatidyl-ethanolaminer), (i) PI (phosphatidylinositoler), (k) PS (phosphatidyl-seriner), (D SM (sphingomyeliner). n=5 for hver gruppe. Kinetik: Tovejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest siGPR17: Tovejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligningstest * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0,01.

Sammenligning af lipidomiske data opnået fra GPR17-silencing og kontroller på hvert tidspunkt gjorde det muligt for os at identificere de lipider, der var signifikant påvirket af GPR17 silencing. Efter 2 DID blev der ikke fundet væsentlige ændringer (data ikke vist). Efter 3 DID var diacylphosphatidylcholin (PCaa) C40:4 mindre udbredt, og diacylphosphatidylethanolamin PEaa) C34:3 var mere udbredt i GPR17-dæmpede OPC'er (figur 8a). Efter 5 dages differentiering førte GPR17 silencing til adskillige ændringer i lipidoverflod: reduktion af flere diacyl-PC'er og diacyl-PE og en samtidig stigning i adskillige plasmalogener (acylalkyl-PC) sammen med sphingomyelin (SM) C18:1 og SM (OH) C16:1 (figur 8b). Disse data indikerer, at nedreguleringen af ​​GPR17 ændrer lipidprofilen af ​​hovedkomponenten af ​​myelin som PC og PE.

Figur 8.Lipidomiske ændringer induceret af GPR17 silencing i OPC'er. (a,b) Abundancen af ​​hvert lipid efter GPR17 silencing er blevet normaliseret til den i den relative kontrolprøve. De resulterende foldændringer blev brugt til at generere et vulkanplot for hvert tidspunkt (3, 5 dage i differentiering). Punkterne over den stiplede vandrette linje repræsenterer de metabolitter, der har vist en statistisk signifikant ændring (Fishers LSD korrigeret med FDR; p.adj < 0.1). I grønt, lipider med lavere udtryk, i rødt, dem med højere udtryk, efter GPR17 silencing. n=5 pr. gruppe.

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: plus 86 15292862950

BUTIK:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop