Going Micro i Leptospirosis Nyresygdom Ⅱ

4. Værtsimmunitetsresponser på Leptospira spp.

Leptospiras hovedvej er direkte penetrering af slimhinder eller åbnet hud gennem blod, væv, urin eller forurenet vand, som spredes gennem det systemiske kredsløb og spredes til flere organer, som f.eks.lever, lunge og proksimale tubuli afnefron i nyrerne, hvor den kan formere sig og overleve i en måned [51]. I den indledende fase af infektionenmedfødt immunresponsspiller en grundlæggende rolle som den første forsvarslinje i leptospirose, der påvirker responsen afmønstergenkendelsesreceptorer, makrofag fagocytose, induktion af ekstracellulærneutrofil akkumulering, ogindgreb af komplementsystemet [52].

Detimmunresponshos mennesker spiller en væsentlig rolle iudvikling af kliniske tegn, ligesom virulensfaktorerne for nogle patogene stammer. De fleste humane leptospirose er asymptomatisk eller mild, og kun 10 % af tilfældene udvikler alvorlige former med multiorgansvigt og øget dødelighed relateret til encytokin stormog en immuno-lammelse status. Patogene arter stimulerer en humoral reaktion i bakteriemifasen, selvom den efterfølgende adfærd hosimmunresponser uklart. I undersøgelser af patienter med flere kliniske manifestationer af leptospirose er sværhedsgraden af ​​det kliniske billede blevet forbundet med forskellige serumcytokinniveauer, såsom TNF-, IL-10 og IL-6 [53], men denne konklusion er fortsat kontroversiel [54]. Disse tilstande har ført til øget interesse for at forstå immunresponset generelt og de biologiske hændelser, der opstår under infektion.

HVOR LANG TAGE DET FOR CISTANCHE AT VIRKE?

4.1. Leptospira og komplementsystemet

Den proteolytiske aktivitet af Leptospiral proteaser mod den ekstracellulære matrix tillader infektionen at komme ind i kredsløbet. Komplementsystemet i kredsløbssystemet er en af ​​hovedmekanismerne for det medfødte immunrespons på patogen Leptospira. Imidlertid har Leptospira udviklet strategier til at undslippe angrebet af komplementsystemet ved at binde proteiner til komplementmolekyler og producere proteaser, såsom thermolysin, et termostabilt neutralt metalloproteinase-enzym, der påvirker C3-proteinkæden. Patogene stammer binder faktor H (FH), komplementfaktor H-relateret protein 1 (FHR-1), faktor-H-lignende protein 1 (FHL-1) og C4b-bindende protein (C4BP), alle hvoraf er ansvarlige for at hæmme komplementsystemet [55]. Der er tre hovedstrategier for komplementunddragelse af patogen Leptospira [55,56] gennem interferens af værtskomplementregulatorer, værtsprotease og bakteriel protease. Til komplementregulatorer bruger Leptospira Faktor H (FH; en regulator af alternativ komplementvej) og C4-bindingsprotein (C4BP; en regulator af klassiske og lectinkomplement-veje) til at accelerere henfaldet af C3-konvertaserne og fungerer også som cofaktorer for faktor I til spaltning af C3b og C4b [57,58]. Leptospiral protein (LcpA), sammen med vitronectin (Vn; en terminal pathway regulator) binder C9 og hæmmer dets polymerisering [59], hvilket potentielt blokerer membranaktiverende kompleks (MAC) dannelse [60]. Derudover binder patogen Leptospira adskillige værtsproteaser, såsom Urokinase-type plasminogenaktivator (uPA), der inducerer aktiv plasmin [61] (en serinprotease) til fordøjelse af C3b, C4b og C5 på Leptospira-overfladen [62]. Desuden kan metalloproteaser og thermolysin, den endogene Leptospira-protease, spalte og inaktivere adskillige komplementproteiner (C2, C3, C4 og Faktor B) [60]. Kombinationen af ​​komplementregulatorer, fra værten og patogene Leptospira, letter bakteriel kolonisering i værtens målorganer [63].

4.2. Leptospira og neutrofiler

Under infektion udløser de patogene arter af Leptospira stærk aktivering af neutrofiler og et pro-inflammatorisk respons. Neutrofiler er vigtige for mikroorganismekontrol, men de bidrager også til vævsskade i værten. Det er blevet påvist, at lave niveauer af ekstracellulær neutrofil akkumulering på grund af lav neutrofil aktivitet i cirkulationen øger leptospiremia, hvilket indikerer, at den intravaskulære dannelse af neutrofile rekrutteringer kan være afgørende for at forhindre tidlig spredning af patogen Leptospira [64].

4.3. Leptospira og makrofager

I den indledende fase af Leptospira-infektion spiller makrofager en vigtig rolle i elimineringen af ​​spirokæten. Denne effektormekanisme sammen med en effektiv cytokinrespons er relateret til fagocytisk kontrol og spredning af infektion, selvom Leptospira spp. har vist sig at inducere apoptose i makrofager via Fas/FasL-caspase-8/-3-vejen og lette deres overlevelse og proliferation i værten på grund af frigivelsen af ​​mitokondriel faktor-inducerende apoptose og endonuklease hos inficerede makrofager [65]. Nylig forskning er blevet udført på mikro-transkriptomet af makrofager inficeret med Leptospira for at bestemme de epigenetiske mekanismer, såsom post-transkriptionel regulering af RNA. Makrofager inficeret med Leptospira har vist, at mikroRNA'er (miRNA'er) reguleres af infektion med spirokæten, hvilket viser, at denne regulering er afgørende vigtig i responsen fra disse immunsystemceller ved Leptospira-infektion [66]. I humane makrofager har aktiveringen af ​​inflammationen medieret af reaktive oxygenarter og lysosomal cathepsin B genereret af Leptospira-infektion fremtrædende niveauer af NLRP3 og IL-18, hvilket fremmer produktionen af ​​IL-1 og fører til en høj mulighed for fagocytose og den hurtige modellering af nogle cytokiner korreleret med leptospiroseresistens [67].

4.4. Humoral respons på Leptospira

Det specifikke humorale respons mod Leptospira er karakteriseret ved produktion af IgM- og IgG-antistoffer på den tredje dag efter symptomdebut. Derudover er IgA-produktion blevet rapporteret fra dag et til den niende måned efter infektion; faktisk er stigningen i IgM blevet brugt som et alternativt mål i den tidlige diagnose af leptospirose [68]. Virkningen af ​​det humorale respons hos mennesker med leptospirose gør det muligt at stille den serologiske diagnose efter naturlig infektion [69]. Det vigtigste aspekt af det humorale respons ved Leptospira-infektion kan være dannelsen af ​​beskyttende antistoffer. Vacciner, der i øjeblikket er tilgængelige for leptospirose, er sammensat af komplette cellepræparater og har begrænsninger, såsom lav effektivitet, flere bivirkninger, lav immunhukommelsesgenerering og mangel på krydsbeskyttelse for serovarforskelle. Udviklingen af ​​nye vacciner er således nødvendig for sygdomsbekæmpelse, og der forskes i øjeblikket for at producere vacciner fra genetisk immunisering [70]. Leptospiras OMP'er er blevet betragtet som et antigen med bedre immunogenicitet for B-lymfocytter, som omfatter de strukturelle epitoper OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} og LipL41263-282 [71]. Disse epitoper er lovende kandidater til udviklingen af ​​en universel vaccine.

4.5. Adaptiv immunrespons på Leptospira: T-celler og cytokiner

Patogene arter af Leptospira inducerer et immunrespons medieret af T- og B-lymfocytter, ledsaget af ekspression af cytokiner, der kan være forbundet med gravitationsdiagrammer. Aktivering af T-celler under infektion med Leptospira initierer det inflammatoriske respons, hovedsageligt gennem cytokinproduktion. Dette er kritisk i den tidlige eliminering af infektion, men den ukontrollerede produktion af pro-inflammatoriske cytokiner kan også resultere i cytokinoverproduktion efterfulgt af en tilstand af immuno-lammelse, som kan føre til sepsis og multiorgansvigt. T-lymfocytter producerer IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- og TNF-, som fungerer som kemo-tiltrækkende midler til at rekruttere leukocytter på infektionsstedet. Interessant nok prolifererede de naive δ T-celler in ex vivo i kulturer af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) stimuleret med antigener fra Leptospira sammen med at producere både IL-17 og IFN [72]. Ydermere, mens leptospirose-inficerede vildtype mus viste højere niveauer af masser af cytokiner, herunder IL-4, IL-10 og IL-13 sammenlignet med uinficerede mus, Leptospira-induceret murine kroniske nefritis (Daf1-/- mus) viste højere ekspression af glatmuskelaktin, IL-10, IL-13, men ingen forskel på IL-12 og IL{{21} } niveauer [73]. Som sådan kan Daf1 og IL-17 spille en afgørende beskyttende rolle i CKD-progression som forbindelsen mellem Leptospira-induceret murin CKD med nyrefibrose [72,73]. Hypotesen om udvalgt cytokinrespons i sygdomsprogression er dog stadig inkonklusiv i human leptospirose indtil videre. Hos patienter med svær leptospirose og pulmonal involvering blev der opnået forhøjede niveauer af IL-6, CXCL8 og IL-10 sammenlignet med patienter med mild leptospirose [53]. Disse høje koncentrationer af cytokiner hos patienter med leptospirose fremhæver deres nøglerolle i udviklingen af ​​svær leptospirose.

Hos patienter med alvorlig infektion findes CD4+ T-lymfocytter med en pro-inflammatorisk profil og producenter af IL-2 og IFN-, mens CD4+ CD25-høje producenter af IL-10 er næsten fraværende. Reguleringen af ​​T-lymfocyt-medieret immunrespons ser ikke ud til at forhindre vævsskade genereret af det inflammatoriske respons på Leptospira. I CD4+ T-lymfocytter hos mennesker med svær leptospirose er produktionen af ​​TNF- og andre pro-inflammatoriske cytokiner højere end hos dem med den milde form af sygdommen, hvilket indikerer, at disse cytokiner kan bruges som markører for sværhedsgrad i den immunologiske fase af infektion [74]. Produktionen af ​​IL-10 er blevet forbundet med risikoen for død hos mennesker med leptospirose; imidlertid associerede en undersøgelse udført på eksponerede og asymptomatiske mennesker produktionen af ​​dette cytokin med kontrol af det inflammatoriske respons og overlevelse [74]. Under Leptospira-infektion reguleres inflammatoriske mediatorer og virkningen af ​​nogle leukocytceller, såsom T-lymfocytter, hurtigt hos resistente individer, i modsætning til hvad der sker hos personer med svære former for leptospirose [75].

For at opsummere er immunresponset på Leptospira-infektion ikke fuldt ud forstået på grund af den kliniske adfærd hos patienter med leptospirose, som interagerer med de forskellige virulensfaktorer i bakteriegenomet, hvilket giver Leptospira en solid patogen kapacitet.

5. Kliniske manifestationer

De kliniske manifestationer af leptospirose er forskellige, lige fra milde, uspecifikke symptomer, såsom influenzalignende symptomer (feber, myalgi og hovedpine), til alvorlige symptomer sammen med organskader i slutstadiet (f.eks. AKI, akut leversvigt , og blødende diatese, også kendt som Weils syndrom), akut hæmoptyse fra pulmonal blødning, akut forvirring fra aseptisk meningoencephalitis og akut hjertesvigt fra akut eller subakut myocarditis [7]. Følgelig består de tre indikatorer for mistanke om leptospiroseinfektion af (i)akut febersygdom, (ii) gulsot og (iii)akut nyreskade[12]. Forudsigelsesfaktorerne for en alvorlig form for leptospirose er alvorlig myalgi ved debut, alvorlig blødningstendens og markant gulsot. Interessant nok, tilstedeværelsen af ​​enten allerede eksisterendekronisk nyresygdom(lille nyrestørrelse) eller forstørrede, overbelastede nyrer med anuri er relateret til det værste resultat [12]. Patienter med leptospirose-associeret nyresygdom bør derfor behandles omgående.

6. Diagnose

6.1. Klinisk diagnose

En diagnose af leptospirose er baseret på historien om eksponering, risikofaktorer og kliniske manifestationer. Et højt mistankeindeks kan omgå senere organskader. Imidlertid forveksles symptomer på leptospirose ofte med andre årsager til akut febril syndrom, såsom dengue-infektion, malaria, hepatitis og aktiv autoimmun sygdom. Manglen på patognomoniske tegn på leptospirose betyder, at diagnosen foreløbigt er baseret på vurderingen af ​​feber og myalgi hos patienter fra et endemisk område. Af denne grund er laboratoriediagnose af leptospirose afgørende.

6.2. Laboratoriediagnose

Leptospirose er vanskelig at diagnosticere i laboratoriet, især i den akutte fase. Det kan udføres ved direkte at identificere spiroketter eller deres komponenter i kropsvæsker eller væv, isolere leptospirer i kultur eller påvise bestemte antistoffer gennem forskellige kliniske faser. Leptospirose er vanskelig at skelne fra sygdomme, såsom malaria, denguefeber, rickettsia, influenza, hepatitis og gul feber på grund af dets vage kliniske udseende. Som et resultat er laboratorieprøver nødvendige for at bekræfte diagnosen. Påvisningen af ​​antistoffer mod leptospirer, leptospirer selv eller deres deoxyribonukleinsyre er grundlaget for disse tests (DNA). Nuværende laboratoriediagnose omfatter både direkte identifikation (påvisning af Leptospira spirochetes eller DNA i prøverne eller isolering af organismen fra prøver) og indirekte påvisning (serologisk diagnose eller serologi til identifikation af Leptospiral infektion, som er baseret på påvisning af specifikke antistoffer mod diverse Leptospirale antigener) (tabel 1).

6.2.1. Direkte mikroskopisk undersøgelse, kultur og antigenpåvisning

Leptospirer er tynde, lyse, aktivt bevægelige spiraler med karakteristisk hurtig spinning (twitching-motilitet) under det konventionelle darkfield-mikroskop (DFM), og ca. 10 leptospirer/ml er nødvendige for påvisning af én celle pr. felt. Med en uge længere i infektionens varighed er der ca. 10 % afdøde i udbytte af DFM (fra 100 til 90 %). For at øge følsomheden, flere specielle farvningsmetoder; Warthin-Stjernesølvfarvning [76] og immunfarvning (immunhistokemi, immunfluorescens, immunomagnetisk antigenindfangning og immunoperoxidasefarvning [77]), der kræver de serovarspecifikke primære antistoffer (isoleret eller i kombination).

Tabel 1. Laboratorieundersøgelser for leptospirosediagnose.

LAMP, loop-medieret isotermisk amplifikation; PCR, polymerasekædereaktion; NGS, næste generations sekventering; IHA, indirekte hæmagglutination; ELISA, enzym-linked immunosorbent assay; IgM, immunoglobulin M; MAT, makroskopisk agglutinationstest; MCAT, mikrokapselagglutinationstest; DNA, deoxyribonukleinsyre; DFM, mørkfeltsmikroskopi

Parallelt hermed er Leptospira-dyrkning fra blod, urin, cerebrospinalvæske og biopsivæv mulig i løbet af de første par dage til 10 dage efter debut af sygdomssymptomer (leptospirosestadiet). Da de er langsomtvoksende (6-8 timers fordoblingstid), kræsne og tilbøjelige til kontaminering, skal dyrkningsprøverne opbevares i mindst 3-4 måneder, før de kasseres som negative) med kun 23 % følsomhed, men det er nødvendigt til lægemiddelfølsomhedstesten [6]. Som sådan består EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) medier (olein-albuminkompleks) af bovint serumalbumin (fraktion V), Tween 80, ammoniumchlorid thiamin, monokaliumphosphat, dinatriumphosphat og forskellige næringsstoffer [78] er de fleste almindeligt anvendt, mens de mere specialiserede T80/40/LH-medier (polysorbat 40, lactalbuminhydrolysat, superoxiddismutase og kaninserum) er påkrævet for nogle serovarer [79]. Til den primære isolering af det store og mangfoldige udvalg af kræsne patogene leptospirer synes Hornsby-Alt-Nally (HAN), at være et godt medium [80].

Påvisning af leptospirale antigener ved immunoperoxidase, immunfluorescens eller et immunomagnetisk antigenindfangningssystem er blevet udviklet til prøver med lav bakteriebelastning eller mørkfeltsmikroskopi kan ikke anvendes, men udføres ikke rutinemæssigt på grund af begrænsningen på primært antistof [77]. I modsætning hertil nukleinsyregenkendelse med ny DNA-amplifikation; polymerasekædereaktion (PCR) (dvs. nested-PCR, kvantitativ PCR [qPCR]), loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) og næste generations sekventering (NGS) er værdifulde for en tidlig og præcis laboratoriediagnose, især med Leptospira-isolering ved hjælp af biologisk mediepodning og DNA-hybridisering (DNA-probe) [81,82]. En række forskellige leptospirale mål (såsom 16S ribosomalt RNA) eller DNA kan amplificeres til diagnose [83] og real-time PCR (RT-PCR) er mere følsom og specifik end standard PCR [84]. Fordi nogle RT-PCR-primere kan binde til et ikke-specifikt sted, hvilket fører til falske positive resultater, er de seneste multiplekse PCR-analyser i realtid blevet udviklet ved hjælp af to sæt primere [85]. Nested PCR hjælper også med at detektere mere specifikke og følsomme DNA-steder med yderligere sæt primere [86,87]. Men de nuværende tendenser for leptospirose-diagnose er brugen af ​​både serologiske og molekylære teknikker, såsom PCR og ELISA (lettere end den guldstandard serologiske MAT), for ressourcebegrænsede lande [88,89]. Derudover er LAMP-teknikken [90] til påvisning af et 16S rRNA-gen (rrs) en omkostningseffektiv, hurtig og højudbytte til påvisning af de patogene leptospirer i urinen. I øjeblikket er NGS den mest præcist baserede kulturuafhængige metode til analyse af kernegenom i kropsvæsker (blod og urin) [91] og den fremtidige retning for leptospirose-tests ville være at bevæge sig mod den molekylære klassificering af leptospirer, som overvinder begrænsningen af kulturisolering af leptospirer fra kliniske prøver. Derfor er værdien af ​​PCR i den kliniske diagnose af leptospirose særlig god, og flere moderne teknikker er ved at dukke op

6.2.2. Anti-Leptospira antistofpåvisning

Der anvendes flere serologiske diagnoser; for eksempel slægtsspecifikke antistoftests (indirekte hæmagglutination [IHA], enzym-linked immunosorbent assay [ELISA], Lepto Dri Dot [latexagglutination], mikrokapselagglutination [MCAT]) og serovarspecifikke antistoftests (mikroskopisk agglutinationstest [ MAT]) [92,93]. Som sådan er MAT-kriterier for diagnose (i) en firedobbelt titerstigning i parrede sera (serokonvertering af den aktuelle infektion) eller (ii) en enkelt høj titer (Større end eller lig med 1:400 eller 1:800, højere i epidemi områder) (seropositivitet) (antistoffer kan vare ved i nogen tid efter infektion eller krydsreaktion med andre sygdomme). Derudover kræver MAT et live panel af alle Leptospira serovarer i regionen med et panel af lokalt standardiserede serovarer [93,94] efter Verdensorganisationen for Dyresundhed (19 antigener, der er repræsentative for 15 serogrupper) [95]. Fordi antistoffer kan påvises 5-7 dage efter infektion, kan MAT-testen være negativ (titer < 1:50) i løbet af de første par dage af infektion. Diagnose af leptospirose kan udføres ved urinprøver [96] ved brug af både serologi og molekylær detektion (16S rRNA), især hos patienter med nylig infektion (MAT større end eller lig med 1:800 eller ELISA IgM-positiv eller begge dele) [97] .

Med begrænsede ressourcer er en klinisk forudsigelsesscore [98] baseret på den relevante kliniske historie og relaterede laboratorietests med scoring i syv aspekter som følger: hypotension (3), gulsot (2), muskelsmerter (2), AKI (1,5) , lav hæmoglobin (3), hypokaliæmi med hyponatriæmi (3) og neutrofili (1) foreslås (en cutoff opsummeret score på 4 har arealet under modtagerens funktionskarakteristiske kurve {{10}}.78 ( 95 % CI 0.68-0.89) for leptospirose-diagnose [77]). Denne sandsynlighedsscore for Thai-Lepto-ved-indlæggelse kunne være et diagnostisk værktøj til tidlig formodet diagnose af leptospirose hos patienter med alvorlig klinisk mistanke om sygdommen.