Hurtig samtidig bestemmelse af seks effektive komponenter i Cistanche Tubulosa ved nær-infrarød spektroskopi

1. Introduktion

Cistanche (Hoffmg. Et Link) er en flerårig fanerogamisk slægt af Orobanchaceae-familien af ​​planter. De fleste arter, der tilhører Cistanche-slægten, har været brugt som lægeplante i årtusinder i Kina; have et ry som en overlegen tonic; og er kendt som "Ginseng of the Deserts". Cistanche tubulosa er en obligatorisk parasit af rødderne af den flerårige plante Tamarix chinensis. Det er blevet dokumenteret i den kinesiske farmakopé som den autentiske kilde tilCistanches Herba(kinesisk navn: Roucongrong) fra 2005-udgaven. Moderne farmakologisk forskning på Cistanche-arter blev indledt i 1980'erne. Farmakologiske undersøgelser viste, at ekstrakterne af Cistanche-planter besidder et bredt spektrum af aktiviteter, såsom helbredelse af nyremangel og senil forstoppelse, fremme af evnen til at lære og huske, anti-Alzheimers sygdom, forbedre immunitet, anti-aldring, anti-træthed osv. I de sidste tre årtier er omfattende og systematiske farmakologiske undersøgelser blevet kombineret med fytokemiske undersøgelser for at belyse det materielle grundlag for de gavnlige virkninger af rødderne af Cistanche-planter. Disse undersøgelser indikerer, at phenylethanoidglycosider (PhG'er) var de vigtigste effektive komponenter i Cistanche-planter, der spiller en nøglerolle i behandlingen af ​​nyremangel, impotens, anti-aging og anti-Alzheimers sygdom. Indholdet af to PhG'er (echinacoside og verbascoside) var påkrævet i kinesisk farmakopé. I mellemtiden ejer kulhydrater såsom mannitol, saccharose, glucose og fructose i Cistanche-planter den afførende funktion og kulhydratklyngerne afCistanche planterhar været brugt til behandling af forstoppelse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vilde ressourcer af C. tubulosa er hovedsageligt fordelt i området omkring Taklamakan-ørkenen i den sydlige Xinjiang Autonome Region i Kina. I lighed med mange andre arter, der bruges som traditionelle kinesiske lægemidler (TCM'er), er C. tubulosa af stor økonomisk værdi og er næsten uddød i sit vilde habitat på grund af overopsamling. Dyrkning af C. tubulosa begyndte i 1990'erne i Kina for at sikre forsyningen af ​​råvarer til Cistanches Herba samt beskytte vilde planteressourcer. Fra 2017 eksisterer der næsten 13 tusinde ha dyrket C. tubulosa i Hotan-præfekturet i Xinjiang. Der kræves fremskridt inden for planteteknologi for at udvide dyrkningen samt forbedre kvaliteten af ​​C. tubulosa.

Det primære formål med at dyrke C. tubulosa er at producere Cistanches Herba, der er rig på disse effektive komponenter. Men indholdet af de effektive komponenter iCistanches Herba, såsom PhG'er og oligosaccharider, kan blive væsentligt påvirket af mange faktorer under produktionen. Et realtidsdetektionssystem for kvaliteten af ​​C. tubulosa bør undersøges. Derfor er det nødvendigt at udvikle en høj gennemløbsmetode for at opfylde kravet om at analysere et stort antal prøver inden for en kort periode. Traditionelt blev bestemmelsen af ​​de primære effektive komponenter, såsom PhG'er og kulhydrater, i C. tubulosa normalt opnået ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC). Selvom det er nøjagtigt og pålideligt, er det tidskrævende og besværligt at indsamle og behandle data. Derudover kræves der også megen tid og kræfter til prøveforberedelse, som normalt involverer pulverisering, ekstraktion og filtrering af HPLC-assays. Derfor er der brug for et klart princip og let betjeningsværktøj for at få en forholdsvis stor mængde data. Heldigvis er nær-infrarød spektroskopi (NIRS) blevet brugt i vid udstrækning til at vurdere landbrugsprodukter, fødevarer, medicinske prøver og farmaceutiske produkter, fordi den er hurtig såvel som ikke-destruktiv. Derfor kunne NIRS nøjagtigt matche kravene til effektive målinger af TCM'er, og ikke overraskende er NIRS blevet anvendt til kvalitativ identifikation og kvantificering af forbindelser i TCM'er.

I denne undersøgelse er indholdet af seks effektive komponenter, herunderechinacosid, verbascosid, mannitol, saccharose, glucose og fructosei 116 partier af C. tubulosa-prøver, der blev indsamlet fra Hotan-præfekturet i Xinjiang i 2013-2015, blev først bestemt ved HPLC. Bagefter blev kalibreringsmodellerne for disse seks komponenter etableret med metoden med partiel mindste kvadraters regression (PLSR). Disse modeller blev derefter valideret med korrelationskoefficienterne og forudsigelsesfejlene i kalibreringssættene. Resultaterne viste, at den udviklede metode kunne anvendes som en pålidelig metode til kvantitativ analyse af C. tubulosa.

2. Resultater

2.1. HPLC-analyse

Indholdet afechinacoside og verbascosideblev bestemt ved en veldefineret HPLC-UV-metode i litteraturen, og fire kulhydrater (mannitol, saccharose, glucose og fructose) blev bestemt ved en veldefineret HPLC-ELSD-metode i litteraturen for alle de 116 prøver. Prøveforberedelse og -bestemmelsesmetoder blev beskrevet i afsnit 3.1 og 3.3. Figur 1 viser de karakteristiske kromatogrammer for de blandede standarder. Det kan ses, at alle seks effektive komponenter var baseline-separerede og derfor kunne kvantificeres. HPLC-metoden blev valideret før prøvetestningen. Hovedresultaterne af HPLC-metoden er anført i tabel 1. En gunstig lineær relation (r=0.9998) og genvinding (98.5%) af metoden til bestemmelse af echinacosid er vist i resultaterne, det samme resultat som alle fem komponenter. Derfor kan indholdet af de seks effektive komponenter bestemmes nøjagtigt. Alle bestemte indholdsintervaller er opsummeret i tabel 1.

2.2. NIRS Analyse

Figur 2 viser NIR-spektrene (4000–10,000 cm−1) af C. tubulosa-prøverne. Signifikante absorptionstoppe optrådte fra 4000 cm−1 til 7500 cm−1 i alle prøver, mens der optrådte blide udsving fra 7500 cm−1 til 10.000 cm−1. Basislinjedrift af NIR-spektrene opstod, fordi prøven let blev påvirket af faktorer som partikelstørrelse og farve (figur 2A). Matematiske forbehandlinger af spektrene blev brugt til at reducere indflydelsen af ​​unødvendig information til en vis grad. De matematiske forbehandlinger omfattede første afledning (1. afledning), anden afledning (2. afledning), standard normal sort (SNV) og multiplikativ spredningskorrektion (MSC). Figur 2B viser den 2. afledning af NIR-spektrene for C. tubulosa, og de signifikante variationer, der fandt sted fra tre regioner, 4000-4500 cm-1, 5000-5500 cm-1 og 7000-7500 cm-1, er observeret.

2.3. Etablering af kvantitative kalibreringsmodeller

Partiel mindste kvadraters regression (PLSR) er en klassisk modelleringsmetode, og den er blevet brugt bredt i kvantitative modeller på grund af resultaternes høje kvalitet. Fordelene ved PLSR inkluderer dens gode prognoseevne og relative enkelhed. PLSR er også blevet anvendt i vid udstrækning i etableringen af ​​kvantitative kalibreringsmodeller af TCM'er [25]. Baseret på de forbehandlede NIR-spektre blev der etableret en NIR kvantitativ analysemodel for de seks effektive komponenter i C. tubulosa ved hjælp af PLSR-metoden med HPLC-analysedata som de sande værdier. De 116 prøver blev tilfældigt opdelt i kalibrerings- og valideringssæt med et 3:1-forhold. De mest egnede betingelser for kalibreringen blev valgt ved lav RMSEC og høj korrelationskoefficient.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Valg af bølgebånd til kalibreringsmodellerne

Valget af et passende bølgebånd var et vigtigt skridt for opbygning af kalibreringsmodel. I denne undersøgelse blev NIR-intervalspektrene på 4000-7500 cm−1 (anbefalet af TQ-analytikersoftware) og 4000-10.000 cm−1 sammenlignet. Det blev observeret, at dette interval er uegnet til kalibrering i intervallet mellem 4000 cm−1 og 7500 cm−1 fra tabel 2. Derfor blev spektralintervallerne for de seks kemiske bestanddele i den aktuelle undersøgelse alle valgt fra intervallet fra 4000 til 10.000 cm−1 ved at sammenligne ydeevnen af ​​RMSEC og korrelationskoefficient.

2.3.2. Valg af det optimale antal faktorer for kalibreringsmodellerne

PLSR forklarer den maksimale mængde af variabilitet i dataene ved at reducere dimensionaliteten af ​​spektradataene ved beregning af faktorer. Problemet med "underfittedness" optrådte på grund af utilstrækkelig information, som skyldtes et begrænset antal faktorer; Hvis man vælger de faktorer, der er større end de optimale værdier, der er indført i modellen, vil problemet med "overfittedness" opstå. Enten "underfittedness" eller "overfittedness" vil reducere de etablerede modellers forudsigelseskraft [22]. Figur 3 viser sammenhængen mellem RMSECV og faktorer for alle seks forbindelser. Derfor valgte vi de faktorer, der svarer til de laveste værdier af RMSECV. Det optimale valg af faktorer for kalibreringsmodellerne er angivet i tabel 3.

2.3.3. Valg af spektral forbehandling til kalibreringsmodellerne

En anden kritisk indflydelsesrig faktor for kalibreringsmodeller er spektral forbehandling, som er rettet mod at reducere indflydelsen af ​​spredning og baseline-drift, forbedre signal-til-støj-forhold og fjerne uregelmæssige variationer. Multiplikativ spredningskorrektion (MSC) og standard normal variate (SNV) metoder blev brugt til at eliminere indflydelsen af ​​strålingsspredning. For at løse virkningerne af baseline-drift blev 1. og 2. afledte spektre sammenlignet, og 2. afledning blev udvalgt. For den ønskede effekt udjævnede vi spektrene med Savitzky-Golay (SG) filteralgoritmen før udledning for at forhindre støjforstørrelse. Tabel 3 viser informationen om spektral forbehandling og dens resultater for kalibreringsmodellerne.

2.4. Evaluering af de etablerede modeller

En god NIRS-kalibreringsmodel bør have lave RMSEC- og RMSEP-værdier, samt en høj korrelationskoefficient (r) og små forskelle mellem RMSEC og RMSEP. Kalibreringsmodellerne for de seks udvalgte forbindelser blev etableret ifølge procedurerne nævnt ovenfor (tabel 3). RMSEC- og r-værdierne for kalibreringssættet af echinacosid var henholdsvis 27,6 og 0.9808. Ydeevneparametrene for andre modeller af kemiske forbindelser er anført i tabel 3, hvorfra vi kan konkludere, at de etablerede modeller fremkommer tilfredsstillende forudsigelsesresultater og kan bruges til hurtig kvantitativ analyse af C. tubulosa. Spredningsplot af de seks kemiske forbindelser er vist i figur 4 for at gøre kalibreringsmodellerne mere beskrivende og observerede visuelt. Som vist i figur 4 opstod der mindre forskelle mellem de forudsigelige og målte værdier, fordi de fleste prikker var fordelt rundt om den regressive kurve med en ligning som y=x. Derfor blev fremragende prædiktive præstationer observeret i figur 4.

3. Materialer og metoder

3.1. Prøveforberedelse

Et hundrede seksten C. tubulosa prøver blev indsamlet fra Hotan Prefecture i Xinjiang autonome region fra 2013 til 2015. Alle prøver blev dyrket, men de blev indsamlet på forskellige vækststadier. Den friske vægt af prøverne varierede fra 20 g til 1000 g. Efter soltørring blev de tørrede prøver knust og sigtet gennem en 60-masket sigte.

3.2. NIR spektroskopisk dataindsamling

NIR-spektrene for prøverne blev opsamlet med et 8 cm−1 interval over spektralområdet på 4000-10.000 cm−1 med et Antaris MXFT-NIR System (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) udstyret med en håndholdt optisk fiberreflektansadapter. Hvert spektrum blev opnået ved at tage 64 scanninger i gennemsnit. Alle prøver fik lov til at ækvilibrere til stuetemperatur (25 ◦C) før NIR-spektrascanning for at sikre, at prøverne blev analyseret ved samme temperatur. Luftfugtigheden i laboratoriet blev holdt på et omgivende niveau.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF NYREFUNKTIONEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC dataindsamling

3.3.1. Ekstraktionsforberedelse

Et gram C. tubulosa-pulver blev ekstraheret med 50 ml 50% methanol i en konisk kolbe med ultralydbehandling (500 W, 40 KHz) i 30 min. Ekstrakten blev opbevaret ved 4 ◦C. Supernatanten af ​​ekstrakten blev filtreret for at opnå en prøve til HPLC-analyse.

3.3.2. Samtidig bestemmelse af Echinacoside og Verbascoside med HPLC-UV

Væskekromatografisk analyse blev udført på et Shimadzu UHPLC-system (Shimadzu, Kyoto, Japan) bestående af to LC-20ADXR opløsningsmiddelleveringsenheder, en LC-20AD pumpe, en SIL-20ACXR auto sampler, en CTO-20AC-søjleovn, en SPD-M20A DAD-detektor, DGU-20A3R-afgasser og en CBM-20A-controller.

En Grace Prevail Carbohydrate ES-søjle (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) anvendt til de kromatografiske separationer blev holdt ved 35 ◦C. Den mobile fase bestod af acetonitril (A) og 0,1 % vandig myresyre (B) og blev leveret efter gradientprogrammet som følger: 0–7 min, lineær gradient på 10–20 % EN; 7-15 min, 20 % A; og 15-20 min, lineær gradient på 20-10% A. Strømningshastigheden af ​​den mobile fase var 0,4 ml/min. UV-overvågning blev udført ved 330 nm.

3.3.3. Samtidig bestemmelse af mannitol, saccharose, glukose og fructose med HPLC-ELSD

HPLC blev udført på et Agilent 1100-seriens LC-system (Palo Alto, CA, USA) bestående af en G1322A afgasser, en G1311A kvaternær pumpe, en G1311A autosampler, en G1316A kolonnetemperaturregulator og en G1315B DAD detektor.

En Sigma Prevail Carbohydrate ES-søjle (4,6 × 25 0 mm, 5 µm) blev anvendt til kromatografiske separationer og holdt ved en kolonnetemperatur på 25 ◦C. Den mobile fase var sammensat af acetonitril og vand (77:23, v/v) og isokratisk allieret tilført med en strømningshastighed på 0,7 ml/min. Spildevandet blev overvåget ved hjælp af en fordampningslysspredningsdetektor (ELSD) med standardparametre.

3.4. Databehandling

TQ Analyst (version 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) blev brugt til at udføre opdelingen af ​​kalibrerings- og valideringssættene, matematisk forbehandling af spektrene, etableringen af ​​kalibreringsmodellerne og andre beregninger . Oprindelse (version 9.1) blev brugt til at lave figurerne.

4 konklusioner

I denne undersøgelse foreslog vi en hurtig og ikke-destruktiv metode til samtidig analyse afechinacosid, verbascosid, mannitol, saccharose, glucose og fructoseiC. tubulosaaf NIRS. Analyser af RMSEC, korrelationskoefficient, RMSEP og Rp-værdier viste, at de etablerede kvantitative NIR-modeller kunne bruges til nøjagtigt at forudsige indholdet af de seks udvalgte effektive komponenter iC. tubulosa. I sammenligning med HPLC kan NIRS-metoden rapporteret i denne undersøgelse spare betydelig arbejdskraft og tid, samtidig med at den bibeholder tilfredsstillende kvantitativ analyseevne. Derfor har den her rapporterede metode potentiale til at blive brugt i kvalitetskontrollen afC. tubulosaog dermed at styre udviklingen af ​​dyrknings- og procesteknologi tilC. tubulosa.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%