Kvantitativ vurdering af inflammatoriske infiltrater i nyretransplantationsbiopsier ved hjælp af multipleks tyramidsignalforstærkning og dyb læring

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Abstrakt

Forsinket graftfunktion (DGF) er en stærk risikofaktor for udvikling af interstitiel fibrose og tubulær atrofi (IFTA) ved nyretransplantationer. Kvantitativ vurdering af inflammatoriske infitrater i nyrebiopsier af DGF-patienter kan afsløre prædiktive markører for IFTA-udvikling. I denne undersøgelse kombinerede vi multiplex tyramidsignalforstærkning (mTSA) og konvolutionelle neurale netværk (CNN'er) for at vurdere det inflammatoriske mikromiljø i nyrebiopsier af DGF-patienter (n=22) taget 6 uger efter transplantation. Patienterne blev stratificeret for IFTA-udvikling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

Introduktion

Forsinket graftfunktion (DGF) efter nyretransplantation er multifaktoriel og hovedsageligt relateret til donorkarakteristika og iskæmitid. DGF beskrives generelt som behovet for dialyse inden for 7 dage efter transplantation og er en stærk risikofaktor for kronisk nyretransplantationsskade [1-3]. En klassisk komponent i kronisk nyreskade er tilstedeværelsen af ​​interstitiel fibrose og tubulær atrofi (IFTA). Det er dog ikke alle DGF-patienter, der udvikler sig til IFTA, og det komplekse forhold mellem DGF og IFTA er stadig dårligt forstået. Dette skyldes først og fremmest forsinkelsen mellem potentielt forårsagende hændelser og funktionelt fald, og for det andet på grund af de variable og komplekse virkninger af potentielle inducere såsom afvisning og bivirkninger af medicin [1, 4]. Den generelle tilstedeværelse af inflammation og specifikke makrofager er blevet beskrevet i adskillige undersøgelser som en forudsigelse for grafttab [5-8]. Imidlertid er de underliggende patologiske processer ikke fuldt ud forstået, og høje niveauer af inflammation fører ikke uvægerligt til langsigtet grafttab. Som et resultat af miljøstimuli erhverver makrofager specialiserede funktioner og polariserer til forskellige fænotyper. Talrige undersøgelser tyder på, at specifikke makrofag-undertyper (alternativt aktiverede makrofager) er involveret i vævsremodellering ved at inducere vævsreparation eller fibrose. Polariseringen mod en vævsomdannelse (nogle gange pro-fibrotisk) fænotype er kendt for at være afhængig af en lang række miljømæssige stimuli, blandt andet leveret af T-hjælper lymfocyt subtyper [9-11]. Vurdering af T-hjælpercellepopulationer i transplantatet på tidspunktet for DGF afslørede en udbredt T-hjælper 1-subtype, men korrelationer til transplantatresultat eller progression til IFTA er ikke blevet undersøgt indtil videre [12]. En omfattende vurdering af det inflammatoriske mikromiljø, der er specifikt fokuseret på makrofager og T-hjælpercelle-undergrupper i nøje udvalgte patientkohorter, kan give indsigt i, hvorfor nogle, men ikke alle DGF-patienter udvikler sig til udviklingen af ​​IFTA.

En omfattende undersøgelse af inflammatoriske infiltrater er dog hæmmet af adskillige (tekniske) begrænsninger. Traditionel immunhistokemi (IHC) og immunfluorescensteknikker understøtter kun visualiseringen af ​​et begrænset antal cellemarkører i et vævssnit. Seriel sektionering af små, værdifulde vævsfragmenter såsom nyrebiopsier er ikke ønsket, og fortolkningen af ​​forhold mellem celler i forskellige sektioner er vanskelig. Derudover kommer kvantitativ vurdering af de inflammatoriske infiltrater ved visuel estimering med et signifikant niveau af interobservatørvariabilitet [13]. Traditionelle billedbehandlingsteknikker såsom pixeltærskel, vandskel og morfologibaseret segmentering er afhængige af forudgående viden om alle morfologiske cellerepræsentationer og vævsfarvningsintensitet gennem et datasæt [14-16]. Derfor mangler disse metoder ofte robusthed for biologiske og tekniske billedvariationer og oversætter dårligt til nye eller eksterne datasæt. Fremkomsten af ​​digital patologi har fremskyndet udviklingen af ​​alternative metoder til vurdering af hele-slide-billeder (WSI) [17, 18]. Deep learning-modeller, specifikt foldningsneurale netværk (CNN'er), har vist sig at være i stand til at segmentere og detektere relevante biologiske strukturer i histopatologiske dias [19-23]. Disse teknikker har potentialet til at bevæge sig fra subjektiv visuel vurdering og traditionel billedbehandling til nøjagtig, objektiv og reproducerbar celledetektering.

Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en metode til objektiv, kvantitativ vurdering af multiple inflammatoriske cellemarkører, der omgår behovet for omfattende seriel slidesektionering. For at gøre det kombinerer vi multipleks IHC, multispektral billeddannelse og dyb læringsmodeller. For at demonstrere anvendeligheden af ​​disse teknikker studerer vi korrelationerne mellem det inflammatoriske mikromiljø, kvantificeret ved hjælp af deep learning-modeller, med udviklingen af ​​IFTA i overvågningstransplantatbiopsier af DGF-patienter.

cistanche-ekstrakt til behandling af nyresygdomme

Materialer og metoder

For at vurdere det inflammatoriske mikromiljø i nyrebiopsier af DGF-patienter udførte vi multiplex IHC på overvågningsbiopsier taget 6 uger efter transplantation. Patienterne blev stratificeret for IFTA-udvikling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Vævsprøver

Vi brugte overvågningsbiopsier fra nyretransplanterede modtagere på Hannover Medical School (Hannover, Tyskland), erhvervet i forbindelse med et prospektivt overvågningsbiopsiprogram. Inklusionskriterier var: DGF-forekomst (defineret som<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA vurdering

Omfanget af interstitiel fibrose (ci) og tubulær atrofi (ct) (IFTA) efter 6 uger og 6 måneder, udtrykt ved hjælp af Banff læsionsklassificeringssystemet [24] blev opnået fra patologirapporten. For at vurdere forholdet mellem tidlige inflammatoriske infiltrater og IFTA-udvikling mere detaljeret, blev alle PAS-farvede dias digitaliseret til genundersøgelse ved hjælp af en Pannoramic 250 Flash II digital diasscanner (3DHistech, Ungarn) med en 20 × objektiv med en opløsning på 0,24 μm/pixel. PAS WSI for begge tidspunkter (6 uger og 6 måneder) blev scoret for omfanget af IFTA (procentdel af overfladeareal, med 10 procent intervaller) af tre nyrepatologer. Patologernes gennemsnitlige IFTA-score blev brugt som en endelig score til at beregne ændringen i IFTA mellem 6 uger og 6 måneder efter transplantationen. Patienterne blev stratificeret efter absolut stigning i IFTA-score på 10 procent eller mere (n=13) og ingen eller<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Derudover blev Banff-læsionsscorerne sammenlignet mellem tidspunkter ved hjælp af Wilcoxon signed ranks test. Dette afslørede signifikante forskelle mellem 6 ugers og 6 måneders biopsier for Banff-kategorierne ti (p=0.017), ci (p=0.004) og ct (p=0.011) .

Multiplex TSA-farvning

Vi udførte multiplex IHC ved hjælp af mTSA for at visualisere flere cellemarkører i de 6 ugers biopsier. Efter inkubation med et primært og sekundært antistof blev vævet behandlet med fluorescensmærket tyramid. Peberrodsperoxidasen fra det sekundære antistof katalyserer dannelsen af ​​aktive tyramidradikaler. Tyramidradikalerne binder kovalent til tyrosinresterne på antigenet. Denne permanente binding muliggjorde varmeinduceret fjernelse af det primære-sekundære antistofkompleks, mens det fluorescerende tyramidaflejring blev bevaret [25]. Dette muliggjorde den efterfølgende successive inkubation med yderligere antistoffer fra den samme art mod målantigenerne.

mTSA blev udført på to på hinanden følgende objektglas fra de 6 ugers overvågningsbiopsier. Vi udviklede to mTSA-paneler til at vurdere det inflammatoriske infiltrat og det peritubulære kapillære omfang i vores patientgrupper. Panel I bestod af anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 og CD34 antistoffer. Panel II blev brugt til at undersøge T-hjælpercelle- og makrofagpolariseringen ved at anvende anti-CD4-, Tbet-, GATA3-, CD68- og CD163-antistoffer. Antistofspecifikationer, fortyndinger og farvningsrækkefølger er anført i den supplerende tabel 1. Alle objektglas blev deparafiniseret i xylen, dehydreret i 95 procent ethanol, vasket i postevand og kogt til epitopudvinding i 10x fortyndet trisborat-EDTA (TBE) , 0658, VWR Life Sciences, USA) buffer. Efter afkøling blev objektglassene vasket i 3 procent hydrogenperoxidaseopløsning til endogen peroxidaseblokering og vasket med en tris-pufret saltvandsbuffer med 0,05 procent Tween 20 (822184, Merck KGaA, Tyskland) (TBS-T). Proteinblokering blev udført under anvendelse af TBS-T med 1 procent bovint serumalbumin (BSA) (mTSA trin 1). Primære antistoffer blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved fire grader Celsius (mTSA trin 2). Efter vask i TBS-T blev objektglassene inkuberet med et HRP-konjugeret sekundært antistof (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Holland) i 30 minutter ved stuetemperatur (mTSA trin 3). Dernæst blev TSA udført ved hjælp af Opal TSA-fluoroforer fra et Opal 7-farve Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) (mTSA trin 4) (fluoroforer og deres tilsvarende antistoffer er angivet i supplerende tabel 1). Antistof-TSA-komplekset blev fjernet med en kogecyklus i TBE-buffer (mTSA-trin 5). mTSA trin 1-5 blev gentaget, indtil objektglassene var farvet med alle antistoffer fra det pågældende panel. Objektglassene blev dækket med fluoromount-G med DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multiplex TSA validering

Gentagne kogecyklusser kan påvirke målepitopaffiniteten. Nogle antistoffer viser et svagere farvningsmønster efter at vævet er kogt flere gange, andre antistoffer har brug for flere kogecyklusser for at nå den optimale farvningsintensitet, og andre påvirkes slet ikke. Vi vurderede denne effekt for alle antistoffer ved hjælp af kromogen IHC på FFPE kontrol tonsilvæv. For hvert testet antistof (n=9) blev seks sektioner skåret (4 μm tykt). Alle objektglassene blev deparafiniseret i xylen, dehydreret i 95 procent ethanol, vasket i postevand og kogt til epitopudvinding i 10x fortyndet TBE (kogecyklus 1). Efter afkøling blev et objektglas pr. testet antistof opbevaret i phosphatpufret saltvand (PBS). De resterende objektglas blev kogt igen. Denne cyklus blev gentaget fem gange. Alle objektglassene blev efterfølgende vasket i 3% hydrogenperoxidaseopløsning og efterfulgt af skylning i PBS. Primære antistoffer (supplerende tabel 1) blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubation blev objektglassene vasket i PBS. Objektglas farvet med anti-CD68-, Tibet- og GATA3-antistoffer krævede en yderligere inkubation med post-antistofblokering (PAB) i 15 minutter (VWRKDPVB-blokering, Immunologic, Holland). Efter inkubation blev objektglassene vasket i PBS og inkuberet med et HRP-konjugeret sekundært antistof (efter PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Holland, for andre, se supplerende tabel 1 for sekundært antistof). Visualisering blev udført ved hjælp af 3,3'-diaminobenzidin (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Holland). Resultaterne er visualiseret i Supplerende Fig. 1. Baseret på disse resultater bestemte vi den optimale antistofrækkefølge for mTSA-eksperimenterne, som anført i Supplerende Tabel 1.

Hvis epitoper af interesse er co-lokaliseret, kan tyramidaflejringerne interferere med hinanden. For at teste for denne steriske hæmning brugte vi tonsilkontrolvævsglas og farvede disse med vores mTSA-paneler. Antistofekspressionen i mTSA blev sammenlignet med den i enkeltfarvede objektglas, som gennemgik det samme antal kogecyklusser. Vi observerede ikke forskelle i farvningsmønstre mellem enkelt- og multiplexfarvede objektglas (eksempler inkluderet fra panel I, supplerende figurer 2 og 3). Alle primære antistoffer i mTSA'en blev brugt i den samme fortynding, som blev brugt til kromogen IHC. Intensiteten af ​​det fluorescerende signal blev optimeret ved at justere TSA-opløsningsfortyndingerne.

Multiplex TSA-billeddannelse

Multispektral billeddannelse blev udført ved hjælp af et Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) med et 20x objektiv med en opløsning på 0,49 μm pr. pixel og ved hjælp af DAPI, FITC, CY3, Texas Red og Cy5 spektralterninger. Vectra-systemet tillader manuel valg af regioner til multispektral optagelse, som efterfølgende opdeles af systemet i fliser (fig. 1.1). Spektrene for autofluorescens og alle Opal TSA-fluoroforer blev foroptaget i et spektralt "bibliotek" ved hjælp af Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, USA). Spektralbiblioteket gjorde det muligt at nedbryde multipleksflisen til flere enkeltfliser, der repræsenterede bidraget fra hver fluorofor ("unmixing"). Dette resulterede i monokrome, flerkanalsfliser, hvor hver kanal svarede til en enkelt fluorofor og dermed antistof (fig. 1.2).

Konvertering til kunstigt lysfelt IHC

Baseret på lagrede koordinater blev fliserne syet for at skabe en multi-kanal WSI ved hjælp af et brugerdefineret python-script (fig. 1.3). Kanalerne, der repræsenterer DAPI-signalet (IDAPI) og kanalerne, der repræsenterer et af antistofferne (IIHC), blev omdannet til henholdsvis kunstig hæmatoxylin- og DAB-farvning (fig. 1.4 og 1.5). Baseret på kendt kromatisk hæmatoxylin og DAB Cx, Cy-koordinater efter farvetone-mætning-densitet (HSD) transformation, blev farvevektorer erhvervet i tidligere undersøgelser [26, 27]. Disse farvevektorer blev brugt til at beregne de rød-grøn-blå værdier for det kunstige lysfelt IHC (fig. 1.5), som:

med CR, st lysabsorptionen af ​​farvestof st i den røde del af spektret. Værdier for B og G blev beregnet på lignende måde.

Billedanalyse

Interesseområder (ROI'er)

Regioner af interesse (ROI'er) blev kommenteret for hvert tilfælde i kohorten ved hjælp af den automatiserede diasanalyseplatformsoftware (ASAP; version 1.9, tilgængelig som open source-software på GitHub). Disse ROI'er bestod af kortikalt tubulointerstitium og udelukker således kapslen, glomeruli og arterierne. Da betændelse i nyrernes subkapsulære regioner betragtes som ikke-specifik i transplantationspatologi, blev biopsierne i denne undersøgelse primært analyseret eksklusive den subkapsulære region (defineret som 400 µm under kapslen). Sekundært gentog vi analyserne inklusive den subkapsulære region. Visuelle eksempler på ROI'er er inkluderet i Supplerende Fig. 4.

Lymfocytdetektion CNN I

De kunstige lysfelts IHC-billeder, der repræsenterer CD3-, CD4-, CD8- og CD20-farvning, blev analyseret ved hjælp af en eksisterende CNN med en U-Net-arkitektur [22, 28]. Dette netværk blev specielt designet til påvisning af cytoplasmatiske lymfocytmarkører i IHC. CNN-præstation kan udtrykkes i præcision, genkaldelse og en F1--score, hvor:

CNN opnåede en præcision på {{0}}.76, en tilbagekaldelse på 0.79 og en F1-score på 0.78 på testsættet der blev brugt i det originale papir, bestående af traditionel IHC WSI. Påvisning af individuelle positive celler kræver tærskelværdi for CNN-output efterfulgt af efterbehandling. Fordi CD3-farvningen i mTSA-panelet var stærkere sammenlignet med CD4, CD8 og CD20, blev der brugt en lavere objektdetektionstærskel for de tre sidstnævnte (0,4) og den oprindelige objektdetektionstærskel for CD3 (0,7). For at vurdere CNN-præstationen på de kunstige lysfelt IHC WSI'er i denne undersøgelse, blev fire kunstige lysfelt IHC WSI (CD8 og CD20 fra to patienter) brugt som et testsæt i denne undersøgelse. Punktannoteringer (n=1115) blev genereret ved hjælp af ASAP-software. Efter anvendelse af netværket blev præcision, tilbagekaldelse og F1--score beregnet for at vurdere CNN-præstationen. Detektioner blev betragtet som sandt positive, hvis de blev fundet inden for 4 µm (gennemsnitlig lymfocytdiameter) fra en grundsandhedsannotation. Når to detektioner blev fundet inden for et 4 µm-interval, blev kun den detektion, der var tættest på annotationen, betragtet som sand positiv. Efterfølgende blev lymfocytdetektion CNN I brugt til analyse af alle kunstige lysfelt IHC WSI, der repræsenterer cytoplasmatiske lymfocytmarkører (CD3, CD4, CD8 og CD20).

Lymfocytdetektion CNN II

Analysen af ​​kunstigt lysfelt IHC WSI med nukleare farvningsmønstre (som præsenteret af T-bet og GATA3) kanaler, der repræsenterer DAPI og CD4, blev udvalgt til at blive kombineret i én WSI (4). Farvevektorer erhvervet i tidligere undersøgelser blev brugt til kunstigt at farve DAPI-signalet blåt (hæmatoxylin) og CD4-signalet brunt (DAB), hvilket resulterede i et kunstigt lysfelt IHC WSI (5).

krævet træning, validering og test af et nyt CNN. Til dette formål blev ni objektglas skåret fra nyre-, tonsil- og appendiks FFPE-kontrolvæv. Disse objektglas blev IHC-farvet med anti-Tibet (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) og anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Holland) antistoffer. Sliderne blev digitaliseret ved hjælp af en Pannoramic 250 Flash II digital diasscanner med en opløsning på 0,12 μm/pixel. To observatører producerede 5726 prik-anmærkninger på tværs af forskellige regioner ved hjælp af ASAP-software. Annoteringer fra fem dias blev brugt til at træne en U-Net-arkitektur CNN ved hjælp af patches på 256 × 256 pixels med en pixelstørrelse på 0,49 μm/pixel. To WSI blev brugt til validering af CNN og til at bestemme objektdetektionstærsklen (0,4). CNN-præstationen på traditionel IHC WSI blev vurderet på et tilbageholdt testsæt med to IHC WSI. CNN-præstation på kunstigt lysfelt IHC WSI blev vurderet på et sekundært testsæt bestående af fire kunstige lysfelt IHC WSI (Tibet og GATA3 fra to patienter) med 1082 prikkerannotationer. Præcision, genkaldelse og F1-score blev beregnet for at vurdere ydeevnen på begge testsæt. Detektioner blev betragtet som sandt positive, hvis de blev fundet inden for 4 µm fra en grundsandhedsannotation. Når to detektioner blev fundet inden for et 4 µm-interval, blev kun den detektion, der var tættest på annotationen, betragtet som sand positiv. Efterfølgende blev lymfocytdetektion CNN II brugt til analyse af alle kunstige lysfelt IHC WSI'er, der repræsenterer nukleare (lymfocyt) markører (Tibet og GATA3).

Makrofagedetektion CNN

I modsætning til lymfocytdetektion er identifikationen af ​​individuelle makrofager ikke entydig. Især i klyngede scener kan der forventes et betydeligt niveau af observatørvariabilitet. Derfor blev et meget større antal tilfælde og menneskelige annotationer brugt til at træne en dedikeret, tredje CNN til påvisning af CD68 plus og CD163 plus makrofager. IHC-farvede objektglas (n=111) fra naturligt og transplanteret nyrevæv blev indsamlet. IHC-farvninger blev udført med anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danmark eller klon KP1, M0876, Dako, Danmark) eller anti-CD163 (klon MRQ -26 eller 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antistof. IHC-diasene blev digitaliseret ved hjælp af en panoramisk 250 Flash II digital diasscanner eller en Aperio AT2 diasscanner (Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) med en opløsning på 0.24 eller 0 .25 μm/pixel, hhv. Fire observatører producerede 37.709 punktannoteringer på tværs af flere ROI'er i WSI'erne ved hjælp af en protokol for makrofagannotering, som blev aftalt efter indledende pilotforsøg. Annoteringerne fra 101 slides blev brugt til at træne en YoloV2-arkitektur CNN [29]. Yolo er specielt velegnet til opgaver rettet mod detektionsopgaver. Netværket, der består af syv foldningslag, blev trænet på patches på 256×256 pixels ekstraheret med en opløsning på 0,98 μm/pixel med afgrænsningskasser på 21 μm (baseret på gennemsnitlig makrofagstørrelse). Ti WSI blev brugt til validering af CNN og til at bestemme objektdetektionstærsklen (0,45) og ikke-maksimum undertrykkelsesparametre (0,05). CNN-præstationen på traditionel IHC WSI blev vurderet på et tilbageholdt testsæt på ti IHC WSI. CNN-præstation på kunstig lysfelt IHC WSI blev vurderet på et sekundært testsæt bestående af fire kunstige lysfelt IHC WSI (CD68 og CD163 fra to patienter) med 1033 prik annotationer. Præcisions-, genkaldelses- og F1-score blev beregnet for at vurdere ydeevnen på begge testsæt. Detektioner blev betragtet som sandt positive, hvis de blev fundet inden for 21 µm (gennemsnitlig makrofagdiameter) fra en grundsandhedsannotation. Når der blev fundet flere påvisninger inden for et område på 21 µm, blev kun den påvisning, der var tættest på annotationen, betragtet som sand positiv. Efterfølgende blev makrofagdetektionen CNN brugt til analyse af alle kunstige lysfelter IHC WSI, der repræsenterer makrofagmarkører (CD68 og CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dobbelt positivitet

Cellernes positivitet for to markører (dobbelt positivitet) blev vurderet ved at bestemme antallet af pixels mellem celledetekteringer i de forskellige kanaler. Hvis afstanden mellem to lymfocytpåvisninger var<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Celletal blev beregnet inde i ROI'erne, og celletætheder var baseret på celleantal og arealet af det kommenterede ROI.

Rumlige forhold

Automatiseret celledetektering i WSI muliggør undersøgelse af rumlige forhold mellem celler. Den gennemsnitlige korteste afstand blev bestemt (i regioner ekskl. den subkapsulære region) for CD68 plus celler og CD3 plus, CD3 plus CD8 plus og CD20 plus celler i WSI af panel I for begge patientgrupper og mellem CD163 plus celler og CD4 plus , CD4 plus Tbet plus og CD4 plus GATA3 plus i WSI for begge patientgrupper.

Peritubulær kapillær udstrækning

For at vurdere den peritubulære kapillære udstrækning blev ublandede WSI'er, der repræsenterer CD34-kanalen, analyseret i Fiji (ImageJ version 2.0.0, USA, makroer og plugins: "Open and Duplicate", "ASAP ROI Reader") [30]. Positive pixels blev bestemt via automatisk tærskelværdi og efterfølgende udtrykt som procentdelen af ​​det samlede antal pixels inde i ROI'et.

Statistisk analyse

Tæthederne af følgende cellepopulationer blev beregnet i de 6 ugers biopsier: T-lymfocytter (CD3 plus ), cytotoksiske T-lymfocytter (CD3 plus CD8 plus ), B-lymfocytter (CD20 plus ), makrofager (CD68 plus , panel I og II), polariserede makrofager (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), T-hjælper 1 lymfocytter (CD4 plus Tbet plus) og T-hjælper 2 lymfocytter (CD4 plus GATA3 plus). Spearmans korrelationskoefficienter blev beregnet for at vurdere, om der var en sammenhæng mellem T-hjælper 1 og T-hjælper 2 lymfocytdensitet (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) og polariseret makrofagtæthed (enten CD68 plus CD163 plus eller CD163 plus). Vi observerede CD68-signal (fluorophore 540 nm) i de kunstige CD4 (fluorophore 520 nm) IHC'er af et panel I. Derfor rapporterer vi desuden celletæthederne for CD3 plus CD8− celler. For at vurdere forskelle mellem patientgrupper med forskellige IFTA-resultater rapporterer vi median, minimum og maksimum celletæthedsværdier pr. gruppe. Signifikante forskelle i celletæthed og peritubulær kapillærudstrækning (defineret som CD34-positiv pixelprocent) mellem grupper blev vurderet ved hjælp af Mann-Whitneys U-test for uafhængige prøver. Hvorvidt patienter med forskellige IFTA-resultater viser signifikant forskellige CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus celleforhold, blev vurderet ved hjælp af en t-test for uafhængige prøver. Forskelle mellem patientgrupper i rumlige forhold mellem CD68 plus- og CD163 plus-celler med andre immunceller blev vurderet for signifikans ved hjælp af Mann-Whitneys U-test for uafhængige prøver.

Resultater

CNN-baseret påvisning af IHC-positive celler

For at anvende eksisterende CNN'er, som oprindeligt blev udviklet til lysfeltsmikroskopi, blev mTSA fluorescensbilleder transformeret til kunstige lysfeltsbilleder. Eksempler på mTSA-farvede områder med deres tilsvarende kunstige lysfelt IHC-billeder er inkluderet i fig. 2. Et eksempel på en kunstig lysfelt IHC WSI er demonstreret i supplerende fig. 4. Multi-opløsnings WSI'erne kunne åbnes og ses i digital diasvisning software såsom ASAP og Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Som visualiseret i fig. 2 var det kunstige lysfelt IHC WSI velegnet til automatiseret analyse af CNN'er, der oprindeligt blev udviklet til traditionel IHC WSI.

Tre CNN'er blev brugt til den kvantitative vurdering af inflammatoriske celler i de 6 ugers mTSA-farvede transplantationsbiopsier: til lymfocytdetektion med cytoplasmatisk (CNN I) og nuklear (CNN II) IHC-farvning og til makrofagdetektion. Tabel 2 viser CNN-ydeevne (præcision, genkaldelse og F1-scores) for hold-out-sæt af både DAB-farvede IHC WSI'er og kunstige lysfelt IHC WSI'er. CNN-præstationen var typisk lige så god som eller bedre end den tidligere beskrevne baseline-CNN (med en F1-score på 0.78), som viste sig at have præstationer sammenlignelig med erfarne manuelle observatører [22] . Mens lymfocytdetektionen CNN II viste noget reduceret ydeevne på virtuelle lysfeltbilleder sammenlignet med de rigtige DAB-billeder (som CNN blev trænet på), blev det modsatte observeret for CNN til makrofagdetektion.

Et eksempel på en vellykket automatisk dobbelt positivitetsvurdering er inkluderet i fig. 3.

Korrelation af forskellige celletyper

Den stærkeste korrelation blev observeret mellem CD4 plus GATA3 plus celletæthed og CD163 plus celletæthed (Spearmans koefficient 0.75, p < 0.001)="" i="" 6="" ugers="" biopsi="" (supplerende="" fig.="" 5a).="" denne="" korrelation="" var="" svagere="" mellem="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celletæthed="" og="" cd163="" plus="" celletæthed="" (spearmans="" koefficient="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (supplerende="" fig.="" 5b)="" .="" ved="" begrænsning="" af="" cellepopulationen="" til="" dobbeltpositive="" makrofager="" (cd68="" plus="" cd163="" plus="" ),="" var="" spearmans="" korrelationskoefficient="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" med="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" celler="" og="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" med="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celler="" (supplerende="" fig.="" 5c,="" d).="" at="" inkludere="" den="" subkapsulære="" region="" i="" analyserne="" ændrede="" ikke="">

Sammenligning af inflammatoriske infiltrater mellempatienter, der udvikler sig til IFTA versus ikke-IFTA

Patienter, der udviklede sig til IFTA efter 6 måneder, viste signifikant højere CD163 plus celletætheder i biopsierne taget 6 uger efter transplantation (median 505 celler/mm2) sammenlignet med patienter, der ikke udviklede sig til IFTA (median 370 celler/mm2; p=0 .043) (tabel 3). Inkludering af den subkapsulære region resulterede i en lille reduktion af denne effekt (p=0.051). CD68 og CD4 blev brugt i begge paneler. Objektglas farvet med mTSA panel I viste mere CD68-positivitet end objektglas farvet med mTSA panel II. CD4-celletætheden er højere i mTSA-panel II sammenlignet med mTSA-panel I (tabel 3).

Den peritubulære kapillære udstrækning var ens i 6 ugers biopsier af DGF-patienter med forskellige IFTA-resultater (tabel 3), både når man ekskluderede (p=0.74) og inkluderede (p=0.90) den subkapsulære region fra/i analysen.

Vurdering af CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus celleforhold viste et signifikant højere forhold hos patienter med<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Den gennemsnitlige korteste afstand fra CD68 plus celler til CD3 plus , CD3 plus CD8 plus og CD20 plus celler (panel I) og fra CD163 plus celler til CD4 plus , CD4 plus Tbet plus og CD4 plus GATA3 plus celler (panel II) gjorde ikke adskiller sig væsentligt mellem patientgrupper. Resultaterne er visualiseret i fig. 4.

cistanche ekstrakt: forbedre nyrefunktionen og fysisk styrke

Diskussion

I denne undersøgelse udviklede vi en metode til nøjagtig og objektiv kvantificering af inflamatoriske celleinfitrater i transplantatbiopsier af nyretransplanterede patienter med DGF, som omgår omfattende seriel opskæring af nyrebiopsimateriale. Til dette formål kombinerede vi multiplex IHC, tyramidsignalforstærkning, multispektral billeddannelse og kvantificering af CNN'er. Vi var de første til at konvertere flisebelagte multispektrale data til et enkelt kunstigt kromogent billede pr. cellemarkør, hvilket letter WSI-analyse og anvendelse af CNN'er designet til lysfelt IHC. Vi designede to nye CNN'er til påvisning af nuklear-farvede lymfocytter og makrofager og demonstrerede generaliserbarheden af ​​CNN'er udviklet på traditionel IHC WSI til kunstigt lysfelt IHC WSI. Anvendeligheden af ​​vores metode blev demonstreret ved at bruge de kvantitative resultater opnået af CNN'erne til at studere korrelationer af det inflammatoriske mikromiljø i 6 ugers biopsier af DGF-patienter med udvikling af IFTA 6 måneder efter transplantation.

Vi brugte et kommercielt tilgængeligt manuel farvningskit til multiplex IHC til at visualisere immunceller og peritubulære kapillærer i overvågningsbiopsier opnået 6 uger efter transplantation. Multiplex-farvningsproceduren bestod af flere vaske-, inkubations- og vævskogningstrin og involverer adskillige reagensopløsninger. Omfattende metodevalideringer og kvalitetskontroller er derfor af stor betydning, og det anbefales at bruge specifikke antistoffer, der giver en ensartet farvningsintensitet. På trods af de udførte valideringstrin blev makrofaglignende farvningsmønstre set i CD4-kanalerne på objektglas fra mTSA-paneler I og II. CD4- og CD68-farvningscyklusser blev ikke udført fortløbende, hvorfor dette fænomen ikke kunne være forårsaget af ufuldstændig stripning af CD68-antistoffet (Supplerende tabel 1). Selvom sjældne forekomster af makrofag dobbelt-positivitet med CD4 er blevet beskrevet [31], ligger en mere plausibel forklaring i nærheden af ​​fluoroforernes emissionsspektre, der blev brugt til CD4 (520 nm) og CD68 (540 nm) visualisering, begge dækket ved hjælp af FITC filterterningen på fluorescensmikroskopet. Dette kan forårsage "blødning" af det stærke CD68-signal ind i CD4-kanalen. Meget af dette signal blev udelukket fra analyse i panel I, fordi kun CD4 plus-celler, der var dobbeltpositive med CD3, blev brugt til generel T-hjælpercelleanalyse. Ikke desto mindre besluttede vi også indirekte at vurdere generelle T-hjælperceller ved at bruge CD3 plus CD8− som erstatning. I panel II blev CD4 udelukkende brugt i kombination med Tibet og GATA3, hvilket begrænsede risikoen for brugen af ​​falsk-positive påvisninger.

Lavere CD68-positivitet blev observeret i panel II sammenlignet med panel I. Vi antager, at dette er resultatet af sterisk hæmning af tyramidaflejring tilhørende CD163 ("paraplyeffekt") [32]. Vi observerede signifikant flere CD163-positive celler i den undersøgte kohorte end i tonsilvæv, der blev brugt til at kontrollere for sterisk hæmning, hvilket muligvis forklarer, hvorfor denne effekt ikke blev opdaget under valideringen.

Multiplex IHC er blevet kombineret med multispektral billeddannelse til undersøgelse af tumormikromiljøet i flere onkologiske undersøgelser, og for nylig også til analyse af nyre-allograft-afstødning [33-35]. For at udtrække bidraget fra alle markører i mTSA-objektglas afbildes sektioner med et Vectra-system eller et lignende fluorescensmikroskop med en multispektral opsætning. Efter optagelse af et oversigtsbillede med lav forstørrelse opdeler Vectra-systemet vævet i fliser og scanner automatisk fliserne multispektralt. Dette resulterer i billedfliser med flere bidragende spektre. Fordi spektrene for de enkelte fluoroforer kendes fra det forudindspillede spektrale "bibliotek", er det muligt at dekomponere multiplekse fliser i flere enkelte fliser, der repræsenterer bidraget fra hver fluorofor ("unmixing"). I de fleste undersøgelser analyseres de ublandede billeder efterfølgende med kommerciel software. I mange tilfælde understøtter disse programmer ikke WSI-analyse, har svært ved at analysere klyngede celler og er ofte ikke modstandsdygtige over for artefakter og farvningsvariationer. Konvertering af de ublandede fliser til kunstige lysfelt IHC WSI'er gjorde det muligt for os at anvende en eksisterende CNN, der er specielt designet til lymfocytdetektion i IHC [22] (benævnt lymfocytdetektion CNN I). Dette netværk kan detektere individuelle og klyngede lymfocytter med høj nøjagtighed, mens det er modstandsdygtigt over for baggrundsfarvning (fig. 2, CD3). Derudover trænede vi to nye CNN'er til påvisning af celler med nukleare farvningsmønstre (Tibet, GATA3) (lymfocytdetektion CNN II) og til påvisning af makrofager. Makrofager er notorisk vanskelige at opdage på grund af deres spredte farvningsmønster. Makrofagdetektionen CNN blev derfor trænet ved hjælp af annoteringer fra fire forskellige eksperter. Inden annoteringerne blev lavet, var der planlagt flere møder, hvor kriterierne for annotering af makrofager blev diskuteret og vurderet. Dette resulterede i et netværk, der kan detektere makrofager på en reproducerbar måde, mens den er robust til ikke-specifik farvning (tabel 2, fig. 2 og supplerende fig. 6). Så vidt vi ved, er dette den første algoritme til makrofagdetektion i scannede histopatologiske snit. Vi testede ydeevnen af ​​alle tre netværk på et testsæt bestående af traditionel IHC WSI (svarende til dem, der blev brugt under træning) og på et sekundært testsæt, der bestod af kunstigt lysfelt IHC WSI, genereret ud fra de multispektralt optagne billeder. Alle CNN'er viser meget god ydeevne på de primære testsæt og lignende F{11}}scores på de sekundære testsæt. Ydeevnemålingerne for lymfocytdetektion CNN I blev beregnet på normalt væv, artefakter og celleklynger. Det kunstige lysfelt IHC i det andet testsæt indeholdt ingen vævsartefakter og færre celleklynger. Dette kan forklare den overordnede bedre ydeevne af dette netværk på det andet testsæt. Makrofagdetektionen CNN blev trænet og testet på annoteringer fra fire forskellige annotatorer. Mens annotationskriterier især blev diskuteret, blev der alligevel observeret variationer i annotationsstil. CNN's følsomhed er derfor sandsynligvis et sted midt i annotationsstilens ekstremer. Annoteringerne til det andet testsæt blev genereret af en annotator, der tilsyneladende matchede CNN-følsomheden.

Ved at bruge de beskrevne CNN'er fik vi mulighed for at undersøge det inflammatoriske infiltrat med hidtil uset nøjagtighed i en unik serie af strengt udvalgte tidlige overvågningsbiopsier af transplanterede patienter med DGF.

Desværre måtte flere prøver udelukkes fra analyse, for det meste på grund af utilstrækkeligt restvæv efter diagnostisk oparbejdning. Selv med den begrænsede størrelse af datasættet fandt vi signifikant højere CD163 plus celletætheder i biopsier af DGF-patienter, der udviklede sig til udviklingen af ​​IFTA, hvilket er i overensstemmelse med disse cellers potentielt profibrotiske rolle [11]. Mens den observerede tendens var i overensstemmelse med publicerede data, kunne vi ikke bekræfte den skadelige effekt af den tidlige tilstedeværelse af CD68 plus makrofager, som tidligere er blevet rapporteret for andre nyretransplanterede patientgrupper [7, 36, 37]. Vi fandt en positiv sammenhæng mellem tæthederne af CD4 plus GATA3 plus celler og CD163 plus celler, hvilket kunne bekræfte bidraget fra T-hjælper 2 lymfocytter mod et pro-fibrotisk mikromiljø. Selvom der ikke blev opdaget nye forudsigelige biomarkører for IFTA-udvikling hos DGF-patienter i denne undersøgelse, udviklede vi med succes metoder til nøjagtig, reproducerbar og skalerbar vurdering af inflammatorisk infiltrat i sparsomt væv, såsom transplantationsbiopsier. Disse metoder er værdifulde for fremtidige kvantitative undersøgelser af inflammation i histopatologisk væv.

For at lindre binyretræthed med cistanche, klik her for at få flere detaljer

Datatilgængelighed

Samarbejdsanmodninger, der involverer brug af data præsenteret i denne undersøgelse, kan rettes til den tilsvarende forfatter (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) eller FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Anerkendelser

Vi takker Mark Gorris og Kiek Verrijp for deres råd om mTSA-farvning og billeddannelse, Merijn van Erp for at udvikle tilpasset ImageJ-funktionalitet og Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg og Martijn Otten for at generere grundsandhed til makrofagdetektionsnetværket. Derudover takker vi Irina Scheffner for hendes hjælp til den kliniske dataindsamling.

ForfatterbidragMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH og JAWML

designet undersøgelsen. Patientmateriale og kliniske data blev indsamlet og leveret af JS, WG og FF. FF koordinerede indsatsen på MHH. JHB, EJS og JK scorede PAS-sliden for IFTA-procent. MH udførte mTSA-farvning, validering af panel I og II og billeddannelse og afblanding af panel I. VV-billede og ublandet panel II. DJG udviklede metoderne til at konvertere mTSA-fliser til kunstigt lysfelt WSI. MH udførte konverteringerne. ZS-C udviklede lymfocytdetektions-CNN'erne og skrev scripts til lymfocytkvantificeringer. JL udviklede makrofagdetektions-CNN'erne og skrev scripts til makrofagkvantificeringer. MH udførte celle- og kapillærkvantificeringerne. NSS beregnede celleafstandene. MH, BS, LBH og JAWML analyserede dataene. MH lavede figurerne og udarbejdede papiret. Den endelige version af manuskriptet blev revideret og godkendt af alle forfattere.

FinansieringDette arbejde blev støttet af ERACoSysMed-initiativet (projekt SysMIFTA) som en del af Den Europæiske Unions Horizon 2020-rammeprogram udbudt af ZonMw (bevilling nr. 9003035004), med medfinansiering af det tyske ministerium for forskning og uddannelse (BMBF), bevillingnr. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) og FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML modtog konsulenthonorarer fra Philips (Holland) og tilskud fra

ContextVision, Philips (Holland) og Sectra (Sverige), uden for det indsendte arbejde. JK modtog økonomisk støtte fra Dutch Kidney Foundation (projekt DEEPGRAFT, bevilling nr. 17OKG23).

Overholdelse af etiske standarder

interessekonfliktForfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Etisk godkendelse og samtykke til deltagelseDataindsamling og analyse blev udført med informeret patientsamtykke og med godkendelse af etisk råd (nr. 2765) på Hannover Medical School.

Forlagets noteSpringer Nature forbliver neutral med hensyn til jurisdiktionskrav i offentliggjorte kort og institutionelle tilknytninger.

Åben adgangDenne artikel er licenseret under en Creative Commons Attribution 4.0 International License, som tillader brug, deling, tilpasning, distribution og reproduktion i ethvert medie eller format, så længe du giver passende kredit til den eller de originale forfattere ) og kilden, angiv et link til Creative Commons-licensen og angiv, om der er foretaget ændringer. Billederne eller andet tredjepartsmateriale i denne artikel er inkluderet i artiklens Creative Commons-licens, medmindre andet er angivet i en kreditgrænse til materialet. Hvis materiale ikke er inkluderet i artiklens Creative Commons-licens, og din påtænkte brug ikke er tilladt i henhold til lovbestemmelser eller overskrider den tilladte brug, skal du indhente tilladelse direkte fra indehaveren af ​​ophavsretten.

Referencer

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Forsinket graftfunktion i nyretransplantationen. Am J Transplantation. 2011;11:2279-96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Risikofaktorer for langsigtet grafttab hos nyretransplanterede modtagere med kronisk allograft dysfunktion. Exp Clin Transplantation. 2010;8:277-82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Sammenhæng mellem forsinket graftfunktion og allograft- og patientoverlevelse: en systematisk gennemgang og meta-analyse. Nephrol skivetransplantation. 2009;24:1039-47.

4. Schröppel B, Legendre C. Forsinket nyretransplantatfunktion: fra mekanisme til translation. Nyre Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Scoring af total inflammation er overlegen i forhold til den nuværende Banff-inflamationsscore til at forudsige resultatet og graden af ​​molekylær forstyrrelse i nyre-allotransplantater. Am J Transplantation. 2009;9:1859-67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Forudsigelse af efterfølgende fald i nyre allograft funktion fra tidlige overvågningsbiopsier. Am J Transplantation. 2005;5:2464-72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Makrofagernes rolle i udviklingen af ​​human renal allotransplantatfibrose i det første år efter transplantation. Am J Transplantation. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Alternativt aktiverede makrofager i patogenesen af ​​kronisk nyre allograft skade. Børnelæge Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofager plasticitet og interaktion med lymfocytundergrupper: cancer som et paradigme. Nat Immunol. 2010;11:889-96.

10. Anders HJ, Ryu M. Renale mikromiljøer og makrofagfænotyper bestemmer progression eller opløsning af nyrebetændelse og fibrose. Nyre Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofager i organtransplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T-hjælper 1, 2 og 17 celleundergrupper hos nyretransplanterede patienter med forsinket graftfunktion. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Scoring af tumorinfiltrerende lymfocytter: fra visuel vurdering til maskinlæring. Seminar Cancer Biol. 2018;52:151-7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. En billedanalysebaseret metode til kvantificering af kroniske allograftskadeindeksparametre. AMPS. 2006;114:440-8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Anvendelse af vandskelalgoritmer til segmentering af klyngede kerner. Cytometri. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Effektiv cirkulær tærskelværdi. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992-1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. En undersøgelse om dyb læring i medicinsk billedanalyse. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Billedanalyse og maskinlæring i digital patologi: udfordringer og muligheder. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostisk vurdering af deep learning algoritmer til påvisning af lymfeknudemetastaser hos kvinder med brystkræft. JAMA. 2017;318:2199-210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Dyb-læring baseret histopatologisk vurdering af nyrevæv. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968-79.