Kvantificering af neuritdegeneration med øget nøjagtighed og effektivitet i en in vitro-model af Parkinsons sygdom, del 1

Abstrakt

Neuritdegeneration er forbundet med tidlige stadier af neurodegenerative lidelser såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom (PD) og amyotrofisk lateral sklerose. En metode, der almindeligvis bruges til at analysere neuritdegeneration, involverer beregningen af et Degenerationsindeks (DI) efter brugen af værktøjet Analyze Particles fra ImageJ til at detektere neuritfragmenter i mikrofotografier af dyrkede celler. DI-analyser er dog tilbøjelige til flere typer af målefejl, kan være tidskrævende at udføre og er begrænset i anvendelse.

Neurodegeneration refererer til ændringer, der sker i eller omkring neuroner, som kan påvirke menneskets kognitive funktion, intelligens, følelser, adfærd osv. Mange mennesker tror, at neurodegeneration er tæt forbundet med hukommelsesforringelse, men det er måske ikke tilfældet.

For det første betyder neurodegeneration ikke nødvendigvis, at hukommelsen falder med alderen. Nogle mennesker kan bevare en god hukommelse og endda være i stand til at forstå retfærdighed. Dette skyldes, at en persons hukommelse påvirkes af en kombination af faktorer som motion, kost og livsstil.

For det andet kan den menneskelige hjerne genetablere nye neurale forbindelser og danne nye minder, som kaldes plasticitet. Uanset alder lærer hjernen konstant og danner nye minder. Derfor er neurodegeneration simpelthen en naturlig forandring i hjernen og betyder ikke nødvendigvis, at hukommelsen forringes.

Endelig kan opretholdelse af en optimistisk holdning også forbedre en persons hukommelse. Bekymring og stress kan have negative virkninger på hjernen, hvilket fører til hukommelsestab. En positiv holdning kan fremme hjernens sundhed og forbedre hukommelsen og kognitive evner.

For at opsummere, så fører neurodegeneration ikke nødvendigvis til hukommelsestab, og en optimistisk holdning til livet kan hjælpe os med at bevare en god hukommelse og kognitiv evne. Derfor bør vi bevare en optimistisk holdning og styrke træning, kost og livsstilsstyring for at opretholde hjernens sundhed og hukommelse. Det kan ses, at vi skal forbedre vores hukommelse. Cistanche kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche også kan regulere balancen af neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer. Disse stoffer er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan kød også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelig næring og energi og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

increase brain power

Klik på kender måder at forbedre hjernens funktion

Her beskriver vi en forbedret metode til at udføre DI-analyser. Nøjagtigheden af målingerne blev forbedret gennem modifikation af udvælgelseskriterier til detektering af neuritfragmenter, fjernelse af billedartefakter og ikke-neuritmaterialer fra billeder og optimering af billedkontrasten. Sådanne forbedringer blev implementeret i en ImageJ-makro, der muliggør hurtig og fuldautomatisk DI-analyse af flere billeder. Makroen indeholder operationer til automatiseret fjernelse af cellelegemer fra mikrofotografier, hvilket udvider anvendelsen af DI-analyser til brug i eksperimenter, der involverer dissocierede kulturer.

Vi præsenterer eksperimentelle resultater, der understøtter, at sammenlignet med den konventionelle metode giver den forbedrede analysemetode målinger med øget nøjagtighed og kræver betydeligt mindre tid at udføre.

Desuden demonstrerer vi anvendeligheden af metoden til at undersøge neuritdegeneration i en cellekulturmodel af PD ved at udføre et eksperiment, der afslører virkningerne af c-Jun N-terminal kinase (JNK) på neuritdegeneration induceret af oxidativt stress i humane mesencephaliske celler. Denne forbedrede analysemetode kan bruges til at opnå ny indsigt i faktorer, der ligger til grund for neuritdegeneration og progressionen af neurodegenerative lidelser.

Nøgleord:

Axonal degeneration; degenerationsindeks; neuritdegeneration; neurodegeneration; oxidativt stress; Parkinsons sygdom.

Betydningserklæring

Neuritdegeneration er en cellulær begivenhed forbundet med de tidlige stadier af flere typer neurodegenerative lidelser. Molekylære faktorer, der regulerer neuritdegeneration, forbliver dårligt forstået, og eksisterende metoder til at studere neuritdegeneration har begrænset anvendelse og effektivitet. Her identificerer vi modifikationer til en meget brugt procedure til analyse af neuritdegeneration, der reducerer målefejl.

Sådanne metodiske forbedringer blev inkorporeret i en ImageJ-makro, hvilket letter hurtig og fuldstændig automatiseret analyse af neuritdegeneration ved hjælp af store sæt mikrofotografier. Ved hjælp af en cellekulturmodel for Parkinsons sygdom (PD) demonstrerer vi, at makroen letter mere nøjagtige og effektive neuritdegenerationsmålinger, samtidig med at analysemetodens egnethed udvides til eksperimenter, der involverer dissocierede kulturer.

Introduktion

Neuritdegeneration er en cellulær proces, hvor axoner eller dendritter gennemgår progressiv dysfunktion og morfologiske ændringer, hvilket fører til tab af neuritintegritet. Neuritdegeneration er en evolutionært bevaret proces, der er afgørende for korrekt etablering af neurale netværk under udviklingen af centralnervesystemet (Neukomm og Freeman, 2014).

Processen udløses dog også som reaktion på forskellige former for skade, såsom mekaniske skader eller eksponering for lægemidler, der bruges til kemoterapi (Salvadores et al., 2017). Desuden er neuritdegeneration forbundet med progressionen af en række aldersrelaterede neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons sygdom og amyotrofisk lateral sklerose.

Interessant nok, for alle sådanne neurodegenerative lidelser, tyder akkumulerende beviser på, at neuritdegeneration er en vigtig begivenhed i tidligt stadie, der går forud for neuronal død eller indtræden af kliniske symptomer (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert og Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). Således kan undersøgelser, der udforsker faktorer, der regulerer denne cellulære proces, afsløre nye mål til behandling af en række neurodegenerative tilstande.

Undersøgelse af neuritdegeneration er særlig vigtig for at forstå PD, en sygdom karakteriseret ved akkumulering af proteinaggregater indeholdende a-synuclein, progressivt tab af dopaminerge neuroner i substantia nigra pars compacta (SNpc) og udvikling af en række motoriske og kognitive symptomer (Aarsland et al., 2017).

Beviser fra postmortem og humane billeddannelsesundersøgelser indikerer, at a-synuclein-aggregater er mere udbredt i neuronale fibre end i cellelegemerne, og nedbrydning af dopaminerge axoner forekommer i højere grad end tab af dopaminerge neuroner i SNpc i den periode, der fører til klinisk debut. (Tagliaferro og Burke, 2016).

Mens de molekylære interaktioner, der bidrager til den progressive forringelse af dopaminerge neuritter, forbliver ufuldstændigt forstået, tyder nyere bevis på, at neuritdegeneration kan medieres af hændelser, der er uafhængige af signaleringskaskader, der ligger til grund for neuronal død (Fukui, 2016; Geden og Deshmukh, 2016). Undersøgelser, der direkte evaluerer de fysiologiske grundlag for neuritdegeneration, er således afgørende for udviklingen af terapier, der hæmmer tidlig PD-progression.

improve your memory

Som svar på beviserne for en central rolle for neuritdegeneration i progressionen af neurodegenerative lidelser er der udviklet en række metoder til at måle neuritdegeneration ved hjælp af mikrografier af dyrkede neuroner. For eksempel er der etableret flere forskellige metoder til at måle neuritdegeneration ved hjælp af software til at detektere nedsat neuritantal eller længde (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Men da sådanne metoder ikke direkte evaluerer neuritfragmentering, kan fortolkningen af resultaterne for at bestemme virkningen af en variabel på neuritdegeneration forvirres af variablens potentielle virkninger på neuritudvækst. Visse forskningsgrupper har også målt neuritdegeneration ved subjektivt at score billeder af neuritter baseret på morfologiske træk og graden af tilsyneladende fragmentering (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Denne alternative metode er dog tidskrævende og kan introducere efterforskerfejl.

En metode, der letter objektiv og direkte måling af neuritfragmentering, involverer brugen af algoritmen Analyze Particles fra ImageJ til at måle arealet af neuritfragmenter i mikrofotografier af dyrkede celler. Målingerne bruges til at beregne et degenerationsindeks (DI), en skala mellem {{0}}.0 og 1,0, der afspejler graden af neuritdegeneration (Sasaki et al., 2009).

Mens DI-analyser kan bruges til at detektere forskellige grader af neuritfragmentering, er nøjagtigheden af målingerne almindeligvis begrænset af flere fejlkilder, og anvendelsen af metoden har primært været begrænset til eksplantationskulturer eller celler dyrket i kompartmentaliserede mikrofluidiske enheder. Desuden er DI-analyser tidskrævende, når de ekstrapoleres til store billedsæt. Således søgte vi at overvinde disse begrænsninger ved at ændre DI-analyseproceduren for at lette større nøjagtighed og effektivitet, mens vi udvidede anvendeligheden.

I nærværende undersøgelse identificerer vi flere fejlkilder, der almindeligvis forbindes med DI-analyser, og rapporterer metodiske revisioner, der reducerer de forskellige fejlformer. Vi inkorporerer de proceduremæssige forbedringer i en ImageJ-makro kaldet Automated Neurite Degeneration Index (ANDI) for fuldstændig at automatisere DI-analyser fra store billedsæt. Betjening af ANDI-makroen kræver kun software og filer, der er open source og frit tilgængelige. Målinger opnået ved hjælp af ANDI drager fordel af øget nøjagtighed, samtidig med at den tid, der kræves til at udføre analyserne, reduceres væsentligt.

Desuden demonstrerer vi, hvordan den nye analysemetode kan anvendes til at udføre nøjagtig og hurtig måling af neuritdegeneration i en cellekulturmodel af PD, der involverer dissocierede celler dyrket uden kompartmentalisering. Tilsammen kan disse metodiske forbedringer føre til ny indsigt i faktorer, der ligger til grund for en vigtig cellulær proces forbundet med neurodegeneration.

Materialer og metoder

Cellekultur

Kulturer af Lund humane mesencephalic (LUHMES) celler blev etableret i Lab Tek II otte-brønds kammerglas belagt med poly-L-ornithin (PLO) og fibronectin, poly-D-lysin (PDL) og laminin, alle fire substrater, eller ej substrater, som angivet. For at overtrække med PLO og fibronectin blev objektglassene inkuberet natten over ved stuetemperatur med en opløsning indeholdende 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655).

Efter vask med sterilt vand (Avantor) blev objektglassene inkuberet med 2 mg/ml fibronectin (Sigma-Aldrich, katalog #F0895) i 3 timer ved 37 grader. Objektglassene blev derefter vasket med steril PBS (Corning Life Sciences, katalog #21-040-CV) og fik lov til at lufttørre. For at overtrække med PDL og laminin blev objektglassene inkuberet ved stuetemperatur med en opløsning indeholdende 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog #P7280) og 10 mg/ml laminin (Corning, katalog #354232).

Efter inkubation natten over blev objektglassene vasket med sterilt PBS og lov til at lufttørre. For at belægge med alle fire substrater blev de førnævnte procedurer udført sekventielt. LUHMES-celler (ATCC, RRID: CVCL_B056) blev udpladet i de coatede kammerglas ved de angivne tætheder i differentieringsmedium bestående af DMEM/F12 (Invitrogen, katalog #11330057) suppleret med 2 mM glutamin (VWR), 1 % (v/v) N-2-tilskud, 1 mg/ml tetracyclin (Sigma-Aldrich, katalognr.87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladenosin-cAMP (db-cAMP) ; Enzo Life Sciences, katalog #BML-CN125-0100) og 2 ng/ml glialcellelinjeafledt neurotrofisk faktor (GDNF; R&D Systems, katalog #212-GD-010).

Medmindre andet er angivet, blev alle kulturer udpladet med en tæthed på 115,000 celler pr. brønd. En 50% volumen medieudskiftning blev udført hver 48. time indtil behandling. For at forhindre genetisk drift blev cellebestande, der var blevet passeret seks eller færre gange, brugt til alle eksperimenter.

Eksperimenter, der involverede primære kulturer af sympatiske neuroner, blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved Eastern Kentucky University eller University of Virginia. Superior cervikale ganglier blev dissekeret fra postnatal dag 0-6 C56Bl/6 mus, inkuberet ved 37 grader i en enzymatisk dissociationsbuffer og vasket med vækstmedier for at fjerne proteolytiske enzymer og tritureret.

Cellesuspensioner blev udpladet med en tæthed på 7000 celler pr. brønd i Lab Tek II kammerglas med otte brønde. Medier blev skiftet på dag in vitro (DIV) 1, efterfulgt af medieudskiftning hver anden dag. Medier blev suppleret med cytosin arabinofuranosid (Ara-C, Millipore-Sigma) på DIV1-DIV3 for at forhindre vækst af ikke-neuronale celler, efterfulgt af fjernelse af Ara-C fra mediet i mindst 24 timer før behandling som angivet. Til eksperimenter udført ved Eastern Kentucky University, der involverede hydrogenperoxidbehandling, blev kammerglassene belagt med 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, katalog #P3655), 2 mg/ml fibronectin, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, katalog) #P7280) og 10 mg/ml laminin (Corning, katalog #354232) før brug, og dissociation blev udført via 30-min inkubation i buffer bestående af DMEM (ThermoFisher, katalog #11960- 044) indeholdende 0,025 % trypsin (Corning Life Sciences, katalog #25-053-CI) og 0,3 % collagenase (Worthington Biochemical, katalog #LS004176).

Vækstmedier til sådanne eksperimenter bestod af DMEM suppleret med 10 % føtalt bovint serum (Invitrogen, katalog #26140-079), 2 mM L-glutamin (Corning, katalog #25-005-CI) og 40 ng/ml nervevækstfaktor (Fisher Scientific, katalog #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) blev anvendt til fjernelse af ikke-neuronale celler.

Til eksperimenter udført ved University of Virginia, der involverede NGF-tilbagetrækning, blev celler udpladet på kammerglas belagt med 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) og 10 mg/ml laminin (Invitrogen), og dissociation blev udført via 20-min. inkubation i buffer bestående af DMEM/F12 indeholdende BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), collagenase type 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), deoxyribonuclease 1 (Millipore Sigma) og hyaluronidase (Sigma-Aldrich). Vækstmedier til sådanne eksperimenter bestod af DMEM suppleret med 10 % føtalt bovint serum (Invitrogen), 1 U/ml penicillin/streptomycin (Invitrogen) og 45 ng/ml NGF (oprenset fra spytkirtler); 10 mM Ara-C blev anvendt til fjernelse af ikke-neuronale celler.

Cellebehandlinger

Differentierede LUHMES-celler blev udsat for de angivne koncentrationer af {{0}}hydroxydopamin (6-OHDA; Sigma-Aldrich, katalog #162957) eller vehikelopløsning på deres femte dag i differentieringsmediet. Stambeholdninger af 6- OHDA blev fremstillet i afkølet PBS indeholdende 0,02% ascorbat (Sigma-Aldrich, katalog #A5960), og aliquoter blev opbevaret i lysbeskyttede hætteglas under inert gas ved 80 grader. Efter 24 timers behandling blev cellerne fikseret ved inkubation i PBS indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA) i 25 minutter ved stuetemperatur.

For at bestemme rollen af c-Jun N-terminal kinase (JNK) i neuritdegeneration induceret af oxidativt stress, blev kulturer forbehandlet i 1 time med 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, katalog #S5567) eller vehikelopløsning før fuldstændig udskiftning af medier med medier, der indeholder 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA og 10 mM SP600125 eller vehikelløsninger. Stambeholdninger af SP600125 blev fremstillet ved at opløse inhibitoren i sterilt dimethylsulfoxid (DMSO), og frosne portioner blev opbevaret i lysbeskyttede hætteglas fyldt med inert gas ved 20 grader. Behandlinger blev udført således, at cellerne ikke blev eksponeret for mere end 0,1 % DMSO.

Primære kulturer af sympatiske neuroner blev behandlet på DIV5. Til eksperimenter, der involverede neuritdegeneration induceret af hydrogenperoxid, blev kulturerne udsat for 500 mM hydrogenperoxid (Sigma-Aldrich, katalog #H1009-100ML) eller vehikelopløsning bestående af sterilt vand (Cytiva, katalog #SH30529.02) i 24 timer.

For eksperimenter, der involverede NGF-tilbagetrækning, modtog SCG-kulturer enten en medieerstatning med vækstmedier eller blev udsat for NGF-deprivation. SCG-kulturer, der skulle fratages NGF, blev skyllet tre gange med NGF-fri vækstmedier og derefter inkuberet i NGF-fri vækstmedier i 80 timer uden medieændringer. Efter behandling blev cellerne fikseret ved inkubation i 4% PFA i PBS i 30 minutter, efterfulgt af fjernelse af PFA ved skylning med PBS.

Farvnings- og fluorescensmikroskopi

Til eksperimenter med LUHMES-celler såvel som eksperimenterne, der involverede sympatiske neuroner behandlet med hydrogenperoxid, blev kammerglas med otte brønde indeholdende fikserede celler permeabiliseret med 0.1 % Triton X-100 i PBS og blokeret for 1 time med 10% normalt gedeserum i PBS indeholdende 0,1% Triton X-100. Objektglassene blev derefter inkuberet med et primært antistof specifikt for b I tubulin (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) i en blokerende opløsning ved 4 grader natten over. Efterfølgende blev objektglassene vasket med PBS, inkuberet med et sekundært antistof koblet til Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) i 90 minutter ved stuetemperatur og udsat for yderligere vask.

Til eksperimenter, der involverede tyrosinhydroxylase (TH)-farvning, blev objektglassene underkastet en yderligere inkubation i PBS indeholdende 10% normalt gedeserum, 0,1% Triton X-100, et antistof specifikt for TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) ved 4 grader natten over. Objektglassene blev derefter vasket med PBS, inkuberet med et sekundært antistof koblet til Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) og udsat for yderligere PBS-vaske.

Efter afslutning af immunmærkning for bIII-tubulin eller TH blev objektglassene inkuberet med 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-phenylindol (DAPI; katalog #D9542) i PBS i 5 min. Objektglassene blev derefter vasket med PBS, og dækglas blev monteret ved hjælp af Fluoromount G monteringsmedium (Southern Biotech, katalog #0100-01).

For eksperimenter, der involverede sympatiske neuroner udsat for NGF-tilbagetrækning, blev objektglassene blokeret i 1 time ved inkubation ved stuetemperatur i en buffer bestående af 5 % normalt gedeserum (Life Technologies) og 0.0005 % Triton X-100 i PBS, efterfulgt af inkubation i primær antistofopløsning indeholdende muse-anti-mus Tuj1 (1:1000, Covance) natten over ved 4 grader. Efterfølgende blev objektglassene skyllet med PBS, inkuberet i 1 time i gede-anti-muse IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) og 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) i blokerende buffer, udsat for yderligere PBS-skylninger og tilladt at tørre. Objektglassene blev monteret med Fluoromount-G (Southern Biotech, katalog #0100-01) og opbevaret ved stuetemperatur.

Objektglas indeholdende LUHMES-celler blev visualiseret med et 20 objektiv af et Nikon Eclipse II Ti-U omvendt mikroskopsystem med en Lumencor Mira 4-kanal LED-lyskilde. 1280 1024-pixelbilleder blev optaget med et Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD-kamera og NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Med undtagelse af hvor andet er angivet, blev alle fasekontrastbilleder optaget ved hjælp af lysintensitet og eksponeringstidsindstillinger, der producerede en gennemsnitlig baggrundsintensitet på 165 i 8-bit billeder.

For at reducere baggrundsskygge eller andre uoverensstemmelser blev et billede af en tom brønd taget før hver mikroskopi-session og brugt til baggrundskorrektion under LUHMES-cellebilleddannelse. Objektglas indeholdende sympatiske neuroner dyrket ved Eastern Kentucky University eller University of Virginia blev afbildet ved hjælp af henholdsvis et Zeiss LSM 800 mikroskopsystem eller et Zeiss LSM 980 mikroskopsystem. Billeder blev taget med 20 forstørrelse og 1024 1024 opløsning ved hjælp af Zen-software (Carl Zeiss Microscopy).

improving brain function

Cellelevedygtighedsanalyse

Differentierede LUHMES-cellekulturer blev etableret på Lab Tek II otte-brønds kammerglas, der blev coatet som angivet med forskellige substrater. En 50 % medieændring blev udført hver 48. time, og cellerne blev fikseret med 4 % PFA i PBS på den sjette dag for differentiering. Objektglas indeholdende fikserede celler blev udsat for farvning med DAPI, og billeder af nuklear farvning blev optaget med et Nikon Eclipse II Ti-U omvendt mikroskopsystem og Nikon DS-Fi1 5 MP CCD-kamera.

Celler blev vurderet som sunde eller usunde af en blindet efterforsker baseret på udseendet af kernerne. Celler med nedsat kerneareal eller nuklear fragmentering blev bedømt som usunde. Antallet af raske celler pr. billede blev scoret for mindst fem synsfelter pr. tilstand i hvert eksperiment.

DI målinger

Traditionelle DI-målinger blev udført ved hjælp af en Fiji Is Just ImageJ (FIJI)-pakke indeholdende ImageJ 1.52p via en metode, der involverer bredt citerede parametre til DI-analyse (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin og Cho, 2020). Otte-bit billeder af differentierede LUHMES-celler med godt adskilte axonkanaler blev udsat for binarisering ved hjælp af standard binariseringsalgoritmen, med binære muligheder konfigureret til at producere et billede med sorte celler i forgrunden og en hvid baggrund.

Frihåndstegneværktøjet blev brugt til manuelt at spore alle billedområder med cellekroppe, og alle sorte pixels blev konverteret til hvide i de sporede områder. Målværktøjet i ImageJ blev anvendt til at måle det totale sorte område af de binariserede billeder udelukkende med neuritter. Analysér partikelværktøjet blev derefter anvendt ved hjælp af en størrelsesindstilling på 20–10,000 pixels og en cirkularitetsindstilling på 0,2-1,0 til at detektere neuritfragmenter. Det summerede areal af alle neuritfragmenter blev derefter divideret med det totale sorte område for at beregne DI af billedet.

Til eksperimenter relateret til optimering af størrelsesparametre til identifikation af neuritfragmenter blev cirkularitetskriterier på {{0}}.2–1.00 brugt til alle partikelmålinger. Partikelfjerner-pluginnet (version 20{{10}}4/02/09), udviklet af Wayne Rasband, blev hentet fra https:// imagej.nih.gov/. Hvor det er angivet, blev anvendelsen af Partikelfjerner-plugin'et ved hjælp af størrelsesparametre på 0-9 pixels og cirkularitetsparametre på 0,0-1,0 udført for at fjerne små, ikke-neuritobjekter fra binariserede billeder opnået fra fasekontrastmikrografer.

Tilsvarende blev størrelsesparametre på {{0}}–4 pixels og cirkularitetsparametre på 0–1,0 brugt til at fjerne små objekter fra binariserede billeder opnået fra fluorescensmikrofotografier, der repræsenterer bIII-tubulin-immunfarvning. Medmindre andet er angivet, blev alle fasekontrastbilleder før DI-analyse udsat for kontrastforstærkning ved at bruge ImageJ til at anvende en opslagstabel (LUT) med et minimum på 90 og maksimum på 205.

Måling af kunstig fragmentering

Kulturer indeholdende sunde LUHMES-celler blev fikseret med 4% PFA på deres sjette dag for differentiering og immunmærket for bIII-tubulin. Ved hjælp af et 20 objektiv blev 1280 1024-pixel fasekontrastmikrofotografier og fluorescensmikrofotografier, som hver afbilder identiske synsfelter, fanget fra tilfældigt udvalgte områder. I alt ti sæt billeder blev taget fra ni separate kulturer.

ImageJ blev brugt til at generere binariserede kopier af de originale fasekontrast- og fluorescensmikrofotografier, samt kopier af fasekontrastmikrofotografier, der blev binariseret efter kontrastforøgelse via påføring af en LUT med minimum 90 og maksimum 205. For hvert sæt af billeder identificerede en blindet efterforsker et lille 150 150-pixelområde af det originale fasekontrastmikrograf, der udelukkende viser sunde og intakte neuritter.

Regionsstørrelsen og koordinaterne blev derefter gemt i området af interesse (ROI) manager for ImageJ og brugt til at udføre DI-målinger i analoge områder af binariserede billeder fra det samme billedsæt. DI-målingerne blev udført ved hjælp af den traditionelle metode med fragmentstørrelsesparametre på 20 -10,000 pixels. Da alle målte regioner udelukkende indeholdt intakte neuroner, blev alle påviste fragmenter betragtet som kunstige fragmenter.

ANDI makro

ANDI-makroen blev skrevet ved hjælp af ImageJ-makrosproget. Makroen indeholder en række operationer, der gør det muligt for brugeren at vælge stier til tre mapper, en mappe, der indeholder billeder af neuroner, der er immunmærket for en neuronal markør, såsom bIII-tubulin, en anden mappe, der indeholder tilsvarende billeder, der viser nuklear farvning, og en tredje mappe beregnet til at gemme resultatfiler. Fragmentområderne og totale neuritområder af billederne i de valgte mapper beregnes derefter via en række ImageJ-operationer. Kort sagt åbnes et billede, der viser nuklear mærkning, udsættes for kontrastforstærkning og binariseres. Partikelfjerner-plugin'et bruges til at fjerne små, ikke-nukleare artefakter fra det binariserede billede, og det binariserede billede udsættes for en række udvidelser og erosioner.

Et tilsvarende billede af celler immunmærket for bIII-tubulin (eller anden neuronal markør) åbnes og udsættes for kontrastforøgelse. Det binariserede billede, der afbilder forstørrede cellekerner, trækkes derefter fra billedet med celler, der er immunmærket for bIII-tubulin, og genererer således et billede, der udelukkende indeholder neuritter. Neuritbilledet binariseres derefter og udsættes for fjernelse af partikler mellem 0 og 4 pixels. Neuritfragmentområdet beregnes ved at anvende Analyser Particle-algoritmen til at måle partikler med en cirkulæritet mellem 0.2 og 1.0 og størrelse mellem 5 og 10,0000 pixels. Det samlede neuritområde beregnes ved at anvende måleværktøjet til at beregne det samlede sorte område. Et billede, der viser det binariserede neuritområde med fremhævede fragmenter, gemmes i en mappe, der er udpeget af brugeren, sammen med .csv-filer, der rapporterer det fragmenterede neuritområde og det samlede neuritområde.

Ud over de førnævnte operationer er flere yderligere operationer inkluderet i makroen for at understøtte brugervenlighed og begrænse brugerfejl. Disse omfatter funktioner, der fjerner skalainformation fra billeder og sikrer, at målinger opnås i pixelenheder; konfigurere ImageJ-farveindstillinger og binære muligheder for passende billedsubtraktion og binarisering; verificere, at de valgte mapper til billeder af b III-tubulin-farvning og DAPI-farvning indeholder lige mange billeder; luk tidligere brugte billeder for at forbedre behandlingstiden; klare resultater fra tidligere analyser før udførelse af nye analyser; og forhindre fejl i forbindelse med oprettelse af .ini-filer af Windows 10.

For eksperimenter, der involverer analyser af sympatiske neuroner, blev ANDI-makroen revideret til at omfatte en operation, der præsenterer en dialogboks, der gør det muligt for brugeren at kontrollere antallet af gange, som binariserede billeder af kerner vil blive udvidet. Den version af ANDI, der indeholder denne revision, blev kaldt ANDI v1.1. Ændring af værdien i dialogboksen til et højere tal øger soma-fjernelsesstørrelsen, mens ændring af værdien til et lavere tal reducerer soma-fjernelsesstørrelsen. Standardværdien er 12, som er antallet af udvidelser, der bruges til alle eksperimenter, der involverer LUHMES-celler. En værdi på 16 blev brugt til at fjerne større cellekropsregioner under analyser af sympatiske neuroner.

ANDI-makroen er open source og frit tilgængelig til brug eller modifikation via følgende URL: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Den nøjagtige drift af ANDI er blevet bekræftet ved hjælp af flere personlige computere med Windows 10-operativsystemet. Et billedsæt med LUHMES-cellekulturer, der udviser forskellige grader af neuritdegeneration, er også tilgængeligt på den førnævnte webadresse og kan bruges til at undersøge den nøjagtige udførelse af makroen af andre typer computere. Webadressen giver også adgang til en protokol, der beskriver, hvordan man bruger makroen.

Tidsestimater

For at evaluere den tid, der kræves til manuelt at udføre DI-målinger, skal der tages fasekontrastmikrografer af LUHMES-celler, der blev behandlet med vehikelopløsning, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA eller 7,5 mM 6-OHDA blev udsat for DI-scoring ved hjælp af tidligere etablerede metoder (Kraemer et al., 2014). Hvert billede blev udsat for kontrastforstærkning og binarisering. Frihåndsværktøjet fra ImageJ blev derefter brugt til digitalt at fjerne alle afbildede cellekroppe fra de binariserede billeder. Analysepartikelværktøjet blev brugt til at måle fragmenter med en cirkulæritet mellem 0.2 og 1.0 og en størrelse mellem 20 og 10,000 pixels, og måleværktøjet blev brugt til at bestemme det samlede neuritareal.

Værdier om fragmenteret neuritareal og totalt neuritareal blev overført til et regneark i Microsoft Excel, og en matematisk operation i Excel blev brugt til at beregne DI-scorerne. Efter at et billede blev åbnet med ImageJ, blev den tid, der krævedes til manuelt at udføre hver af disse procedurer, målt. Gennemsnitlige analysetider blev beregnet ud fra 36 samlede billeder. Billederne blev opnået fra ni uafhængige cellekulturpræparater, og analyser blev udført under anvendelse af et billede pr. behandlingsbetingelse fra hvert cellekulturpræparat. For at bestemme hastigheden af DI-målinger udført ved hjælp af ANDI-makroen, blev de samme billedsæt brugt til at bestemme den tid, der kræves for at åbne makroen i ImageJ, køre makrooperationerne, overføre dataene til et Excel-regneark og beregne DI.

Statistikker

Kvantitative sammenligninger præsenteres som kasse- og knurhår-plot, hvor den midterste linje repræsenterer medianen, kasser strækker sig til 25. og 75. percentil, og knurhår viser 5. og 95. percentil. Middel blev statistisk sammenlignet i GraphPad Prism 9.1.2 ved gentagne målinger ANOVA med post hoc sammenligninger ved brug af en Sidák korrektion. Normalitet for kvantitative data blev testet ved hjælp af Shapiro–Wilk-testen i IBM SPSS 26.

Når antagelsen om normalitet blev overtrådt (fig. 1C, 3D), blev gruppesammenligninger udført via den ikke-parametriske Friedman-test med Dunns test udført til post hoc-sammenligninger. Korrelationsanalyser er afbildet som scatterplot og inkluderer linjer, der passer bedst. Sådanne forhold blev analyseret ved hjælp af Pearson produkt-øjeblikskorrelationer eller Spearmans r, når antagelsen om normalitet blev overtrådt. Normaliteten af residualer til korrelationsanalyse blev vurderet gennem visuel inspektion af tilsvarende QQ-plot.

Pearson produkt-moment korrelationskoefficienter blev sammenlignet med hinanden ved hjælp af Steigers asymptotiske z-test (Steiger, 1980; Lee og Preacher, 2013). Ingen outliers blev udelukket. Statistisk signifikans blev accepteret ved p, 0,05. P-værdier afrundes til fire decimaler og rapporteres i hele hovedteksten. Effektstørrelser og 95 % konfidensintervaller er også rapporteret til parametriske analyser, med effektstørrelser beskrevet i hovedteksten og konfidensintervaller opført i tabel 1.

supplements to boost memory