Kvalitetsmarkører af Cistanches Herba baseret på antioxidantspektrum-effektforhold

Abstrakt: Formål: At etablere en forskningsmetode for kvalitetsmarkørerne (Q-markører) afCistanches Herba(CH) baseret påantioxidant spektrum-effekt forhold, hvilket giver grundlag for undersøgelsen af ​​dets farmakologiske stoffer og kvalitetskontrol. Metoder: Ultra-high-performance væskekromatografi (UPLC) blev brugt til at etablere fingeraftryksprofiler for 10 batches af CH. En celleoxidativ skadesmodel blev etableret ved brug af H2O2, og antioxidantkapaciteten af ​​CH blev bestemt baseret på den halvmaksimale hæmmende koncentration af reaktive oxygenarter, såvel som niveauerne afsuperoxidedismutaseogkatalasesomfarmakologiske indikatorer. Spektrum-effekt-forholdet blev konstrueret gennem principalkomponentanalyse, Pearson-korrelationsanalyse og partiel mindste kvadraters regressionsanalyse. Detaktive komponentervar udsat forfarmakologisk validering. 

Resultater:Fingeraftryksprofiler for CH blev etableret ved hjælp af UPLC, der identificerede 17 almindelige toppe. Baseret på spektrum-effekt korrelationsanalyse blev ni komponenter udvalgt. De farmakologiske valideringsresultater indikerede, at geniposidinsyre, 8-epilogansyre,echinacoside,akteosid, isoacteosid, ogtubulosid Audviste antioxidantaktivitet på en koncentrationsafhængig måde.

Konklusion: Denne undersøgelse undersøgte Q-markører for CH baseret på spektrum-effekt forholdet, og gav referenceoplysninger for dets farmakologiske stoffundament og kvalitetsstandardforbedring.

Nøgleord:Cistanches Herba; Q-markør;spektrum-effekt forhold; antioxidant

Cistanche deserticola er den tørrede kødfulde stængel med skællende blade af Cistanche deserticola YCMa eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, en plante, der tilhører Cistanche deserticola familien orbaceae. Den er varm af natur, sød og salt i smagen; det vender tilbage til nyrerne og tyktarmens meridianer; det har virkningerne af nærende nyre-yang, genopfyldning af essens og blod, fugtning af tarmene og afføringsmiddel, og er en vigtig medicin til tonificering af nyrerne og genopfyldning af essens [2-3]. Nyrerne lagrer essens, og essens og blod kommer fra samme kilde. Hvis essens og blod er mangelfuldt, vil det påvirke den menneskelige krops overordnede livsaktiviteter; den essensproducerende marv er lagret i knoglerne, og hjernen er marvhavet. Hvis nyreessensen er utilstrækkelig, vil knoglerne miste deres næring, og hjernen vil være mangelfuld, hvilket resulterer i knogledegenerative ændringer såsom løs tekstur, tandtab, hukommelsestab, demens og nedsat immunfunktion [4-6]. Cistanche deserticola indeholder phenylethanoidglycosider, iridoider, lignaner og andre strukturelle komponenter, herunder echinacosid, verbascoside, verbascoside, genipinsyre og 8-epistryansyre. , tubulin A osv. [7]. Den nuværende kvalitetskontrol af Cistanche deserticola i 2020-udgaven af ​​"Folkerepublikken Kinas farmakopé" fastlægger kun indholdet af echinacoside og verbascoside, som ikke fuldt ud kan afspejle multikomponent- og multi-target-handlingsegenskaberne ved traditionel kinesisk medicin. , hvilket ikke er befordrende for dets kvalitetskontrol og evaluering.

For at forbedre kvalitetskontrolniveauet for traditionel kinesisk medicin og optimere kvalitetsevalueringen af ​​traditionel kinesisk medicin, foreslog akademiker Liu Changxiao det nye koncept for kvalitetsmarkør (Q-markør) for traditionel kinesisk medicin [8]. Blandt dem er "effektivitet" kerneelementet i de "fem principper" for Q-markør [9] og er også kernen i kvalitetsevalueringen af ​​traditionel kinesisk medicin.

I lyset af den nuværende forskningsstatus med dårlig korrelation mellem kvalitetsstandarder og lægemiddeleffektivitet, er det af stor betydning at udforske Q-markører for traditionelle kinesiske lægemidler og etablere mere videnskabelige og rimelige kvalitetsstandarder for at forbedre kvaliteten af ​​traditionelle kinesiske lægemidler. Spektrum-effekt forholdet forbinder fingeraftrykskromatografiske toppe af traditionel kinesisk medicin med specifikke farmakodynamiske data for at finde de effektive stoffer i traditionel kinesisk medicin, og derved afspejle den iboende kvalitet af traditionel kinesisk medicin [10]. Etableringen af ​​en matematisk model for spektral effektivitet kan tydeliggøre traditionel kinesisk medicins QMarker fra et "holistisk syn" perspektiv, hvilket giver mere reference til senere kvalitetskontrol af traditionel kinesisk medicin, formulering af kvalitetsstandarder og screening af aktive ingredienser. Denne undersøgelse bruger fingeraftryk kombineret med halv-hæmningshastigheden af ​​reaktive oxygenarter (ROS IC50), indholdet af superoxiddismutase (SOD) og katalase (CAT) til at studere spektrum-effekt forholdet af traditionel kinesisk medicin, og anvender principal komponentanalyse (PCA) ), Pearson korrelationsanalyse (PCC) og partiel mindste kvadraters regressionsanalyse (PLS) til omfattende analyse af Q-markøren for Cistanche deserticola for at danne grundlag for dens kvalitetskontrol.

1 materiale

1.1 Prøve

Cistanche deserticola blev høstet fra Yutian County, Xinjiang, og plantebasen Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) i Indre Mongoliet. Det blev identificeret af forsker Zhang Tiejun fra Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. som Cistanche tubulosa (Schenk) Wight og Cistanche deserticola.

YC Ma, detaljerede oplysninger er vist i tabel 1.

1.2 Test medicin

Echinaceaside (batchnummer: 111670-201907, renhed: 91,8%) og verbascoside (batchnummer: 111530-201914, renhed: 95,2%) blev begge købt fra China Institute of Food and Drug Control; isorescosid (batchnummer: 61303-13 -7), salidrosid (batchnummer: 10338-51-9), 8-epistrychnoic acid (batchnummer: 82509-41-9), genipininsyre (batchnummer: Z24A10X95926) , tuberose B (batchnummer: 112516-04-08), 2-acetyleugenolglycosid (batchnummer: 94492-24-7) blev købt fra Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., renhed større end eller lig med 98%; Cistanche glycosid A (batchnummer: MUST -20062806, renhed: 98,51%), floridin A (batchnummer: MUST19110102, renhed: 98,57%) blev købt fra Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; kromatografisk ren acetonitril og myresyre blev købt fra Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Renset vand (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); dimethylsulfoxid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company i USA); CellTiter 96® AQueous enkeltopløsning celleproliferation detektionskit (G3580, Promega Company i USA); CAT-detektion Kittet (S0051), SOD-aktivitetsdetektionskit (S0101M) og ROS-detektionskit (S0033S) blev købt fra Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumenter

Waters H-klasse-PDA ultrahøjtydende væskekromatograf (Waters Company, USA); Sartorius BT25S elektronisk vægt (Sartorius Company, Tyskland); H1650 højhastigheds desktop-centrifuge (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

mikropladelæser (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biologisk mikroskop (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 celler

Humane embryonale nyreceller HEK 293-celler blev brugt i dette eksperiment og blev købt fra cellebanken i det kinesiske videnskabsakademi.

2 metoder

2.1 Etablering af fingeraftrykskort

2.1.1 Forberedelse af testopløsning: Vej 2 g Cistanche deserticola medicinsk materiale, tilsæt 10 gange mængden af ​​vand, opvarm og tilbagesvaling 3 gange, 1 time hver gang, centrifuger ved 1.0 ×105r·min-1 i 15 minutter (centrifugalradius er 300 mm), Kombiner supernatanterne og koncentrer for at lave en stamopløsning med en massekoncentration på 100 mg·mL-1, fortynd den 10 gange, og filtrer det gennem en 0,22 µm mikroporøs filtermembran for at opnå det.

2.1.2 Fremstilling af blandet referenceopløsning

Tag 8-epistrrychnic acid, salidrosid, echinaceaside, cistanche glycosid A, genipinic acid, verbascosid, anthocyanosid A, isorbascosid og 2'-acetyl eugenol. Glycosid og angiosid B referencestoffer blev målt i passende mængder og vejet nøjagtigt. Tilsæt 50 % methanolopløsning for at opløse og tilbered en blandet referencestofopløsning med en massekoncentration på 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografiske forhold

ACQUITY UPLC®BEH C18 kolonne (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobil fase er acetonitril (A) ~ 0,1% myresyreopløsning (B), gradientelueringsprogram (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6~10 min, 8%~15%A 10~13 min., 15%~19%A, 13~20 min., 19%~25%A); detektionsbølgelængden er 237 nm; flowhastighed er 0,4 ml·min –1; kolonnetemperatur er 40 grader; injektionsvolumen er 3 µL.

2.1.4 Valg af referencespids

I ultra-performance væskekromatografi (UPLC) kromatogrammet af Cistanche deserticola blev toppen med det største toparealforhold, moderat retentionstid og god adskillelse valgt som referencetoppen for fingeraftryksspektret. 2.1.5 Metodologisk undersøgelse Præcisionstest: Tag T1-prøven og klargør testopløsningen efter metoden under 2.1.1. Injicer prøven 6 gange kontinuerligt og optag fingeraftrykket. Resultaterne viser, at det relative topareal RSD for hver top er 0.10%~4.61%. , RSD for den relative retentionstid er 0,08%~1,32%, hvilket indikerer, at instrumentet har god præcision.

Repeterbarhedstest: Tag T1-prøven og klargør 6 prøver af testopløsningen parallelt i overensstemmelse med metoden under 2.1.1, og injicer prøven kontinuerligt. Resultaterne viser, at det relative topareal RSD for hver kromatografisk top er 1,35%~4,80%, og den relative retentionstid RSD er 0,10%~1,80%, hvilket opfylder kravene til fingeraftrykket og viser, at repeterbarheden af instrumentet er godt.

Stabilitetstest: Tag T1-prøven og klargør testopløsningen i overensstemmelse med metoden under 2.1.1, injicer prøver til test efter 0, 2, 4, 8 og 12 timer, og optag fingeraftrykket. Den beregnede RSD for det relative topareal af hver kromatografisk top er 0,53%~4,82%, og RSD for den relative retentionstid er 0,09%~2,17%, hvilket opfylder kravene af fingeraftrykket og angiver, at testproduktet er stabilt inden for 12 timer.

2.2 Forskning i antioxidantvirkningen af ​​Cistanche deserticola

2.2.1 Tilberedning af Cistanche deserticola moderlud:Tag moderluden under punkt 2.1.1, filtrer og steriliser, og fortynd den med dyrkningsmedium til den nødvendige koncentration før brug.

2.2.2 Virkninger af Cistanche deserticola og positiv kontrol VE på levedygtigheden af ​​HEK 293 celler

Opsæt den normale gruppe (cellesuspension), Cistanche deserticola-administrationsgruppe (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE-gruppe (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), hver Sæt 6 duplikatbrønde ved hver koncentration og kultur i 24 timer. Tilsæt 20 µL CellTiter 96® AQueous enkeltopløsningsreagens til hver brønd for at påvise cellelevedygtighed. Fortsæt dyrkningen i 2 timer. Brug en mikropladelæser til at detektere absorbansværdien (OD) for hver brønd ved 490 nm. Beregn celleoverlevelsesraten i henhold til formel (1). Overlevelsesrate (%)=(OD-eksperimentel gruppe/OD-blank gruppe) × 100 % (1)

2.2.3 Virkning af Cistanche deserticola på ROS induceret af H2O2 i HEK 293-celler

Cellerne blev opdelt i normal gruppe (cellesuspension) og Cistanche deserticola-administrationsgruppe (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL-1 Cistanche deserticola og 60 µm·L-1 H2O2) og dyrket i 24 timer. Følg trinene i ROS-detektionssættet til efterfølgende operationer, observer direkte cellefarvningen gennem et mikroskop, og brug en mikropladelæser til at detektere fluorescensintensiteten for hver gruppe. Parameterindstillinger brugte en excitationsbølgelængde på 488 nm og en emissionsbølgelængde på 525 nm. Forsøget blev gentaget tre gange.

2.2.4 Virkning af Cistanche deserticola på H2O2-induceret SOD af HEK 293-celler

Inddel celler i normal gruppe (cellesuspension) og modelgruppe

(60 µm·L–1 H2O2), VE-gruppe (60 µm·L–1 VE og 60 µm·L–1 H2O2), Cistanche deserticola-administrationsgruppe (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola og 60 µm·L–1 H2O2), opsaml cellerne efter 24 timers dyrkning, tilsæt SOD-prøvepræparationsopløsning for at lysere cellerne, centrifuger ved 4 grader, 12000 r·min-1 i 5 minutter (centrifugalradius er 300 mm), tag supernatanten som prøven, der skal testes, følg SOD-detektionskittet. Følg nedenstående trin. Forsøget blev gentaget tre gange.

2.2.5 Virkning af Cistanche deserticola på H2O2-induceret CAT i HEK 293-celler

Følg metoden under 2.2.4 og gruppeadministration, tilsæt lyseringsopløsning, centrifuger ved 4 grader, 12000 r·min-1 i 10 minutter (centrifugeradius er 300 mm), tag supernatanten, og følg trinene i CAT detektionssæt. Opfølgende operationer. Forsøget blev gentaget tre gange.

2.2.6 Statistisk analyse

SPSS 26.0-software blev brugt til statistisk analyse. Hver gruppe af data var repræsenteret ved (±±(). Envejs-variansanalyse blev udført på de data, der stemte overens med normalfordelingen. Hvis varianserne var ens, blev metoden med den mindste mindst signifikante forskel anvendt. Hvis varianserne var ujævne, blev Dunnetts T3-metode brugt til graftegning, og P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Spektrum-effekt korrelationsanalyse af Cistanche deserticola antioxidant

2.3.1 PCA Toparealerne af de almindelige toppe af 10 partier af Cistanche deserticola, der har etableret fingeraftryk, blev standardiseret efter Z-værdi og lavet til en 10 × 17 ordredatamatrix, som blev importeret til SPSS 26.0-software til PCA.

2.3.2 PCC Brug SPSS 26.0 til at udføre bivariat analyse for at studere det spektrale effektivitetsforhold mellem Cistanche deserticola-fingeraftryk og antioxidanter.

Signifikanstestning bruger en tosidet test (T) med P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Importer de eksperimentelle resultater af Cistanche deserticolas standardiserede topareal og antioxidant til SIMCA-P 14.1-softwaren, indstil toparealet som X-variabelen, og indstil det farmakodynamiske indeks som Y-variabelen for at udføre PLS.

2.4 Verifikation af Cistanche deserticola Q-markør antioxidantaktivitet

2.4.1 Fremstilling af aktiv bestanddel moderlud

Vej nøjagtigt passende mængder af genipinsyre, 8-epistrichinsyre, echinaceaside, verbascoside, isorebascosid og anthocyanosid A, og tilsæt DMSO for at opløse dem i 10 mmol·L–1 til kontrol. produktløsning.

2.4.2 Virkning af aktive ingredienser på HEK 293 cytotoksicitet

Efter at HEK 293-celler var inkuberet i 24 timer, 100 µL af opløsninger af den aktive bestanddel under punkt 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1) forskellige koncentrationer blev tilsat til hver brønd, og stimulering blev fortsat. CellTiter 96® AQueous enkeltopløsningsreagens blev tilsat til cellerne 24 timer senere for at påvise cellelevedygtighed.

2.4.3 Antioxidantvirkningen af ​​aktive ingredienser på H2O2-inducerede HEK 293-celler

Celler blev grupperet som følger: normal gruppe, modelgruppe, VE-gruppe blev grupperet som i 2.2.4, forsøgsgruppe (0.781, 1.563, 3.125 µm·L-1 aktiv ingrediens og 60 µm·L-1 H2O2), dyrket i 24 timer. Bestem intracellulære ROS-niveauer, SOD- og CAT-enzymindhold i henhold til metoderne under henholdsvis 2.2.3, 2.2.4 og 2.2.5.

Support Service Of Wecistanche

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tlf.:+86 15292862950

Shop for flere specifikationer detaljer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop