Forudsige LncRNA's rolle i nyreældning baseret på RNA-sekventering Ⅱ

Korrelation af lncRNA Gm43360 og dets potentielle mål-mRNA'er

LncRNA Gm43360 blev udvalgt til undersøgelse, fordi det forbandt to lncRNA-mRNA coekspressionsnetværk. Ekspressionsniveauet for Adra1a var positivt korreleret (rho=0.8650, p=0.026) med det for Gm43360, Csnk1a1 (kaseinkinase 1A1) var negativt korreleret (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (fig. 5a). For yderligere at verificere korrelationen af ​​lncRNA Gm43360 og dets potentielle mål-mRNA'er Adra1a og Csnk1a1 blev et overekspressionsplasmid af lncRNA Gm43360 designet i denne undersøgelse. Ekspressionen af ​​Csnk1a1 faldt som forventet, og Adra1a-ekspression faldt også, men ikke signifikant. Dernæst slog vi lncRNA Gm43360 ned af siRNA for at påvise, om ekspressionen af ​​dets mål-mRNA'er var påvirket. Som forventet blev Csnk1a1 øget i lncRNA Gm43360 knockdown-celler i forhold til den siRNA-negative kontrolgruppe (fig. 5b). Ti påviste vi rollen af ​​lncRNA Gm43360 i cellecyklussen. Resultaterne af celletællingskit-8 (CCK-8) viste, at lncRNA Gm43360 fremmede cellelevedygtighed (fig. 5c). Resultaterne viste, at lncRNA Gm43360 øgede procentdelen af ​​S-faseceller og reducerede procentdelen af ​​G1-faseceller sammenlignet med den negative kontrol (fig. 5d). Te p53- og p21-proteiner var involveret i reguleringen af ​​cellecyklussen og var således tegn på celleældning. Ekspressionsniveauerne af p53 og p21 var signifikant faldet i overekspressionsgruppen i forhold til kontrolgruppen. Ekspressionsniveauerne af p53 og p21 blev signifikant forøget i siRNA-gruppen i forhold til siRNA-kontrolgruppen (fig. 5e). Overekspression af lncRNA Gm43360 reducerede antallet af SA- -gal-positive celler, og -gal-positive celler steg i gruppen af ​​transfekt Gm43360 (fig. 5f). Tilsammen indikerede disse resultater, at lncRNA Gm43360 hæmmede ældning af renale tubulære epitelceller vedhæmmer ekspressionen af ​​Csnk1a1.

KLIK HER FOR AT FÅ NATURLIGE ØKOLOGISKE CISTANCHE EKSTRAKT MED 25% ECHINACOSIDE OG 9% ACTEOSIDE TIL NYREFUNKTION

Diskussion

I denne undersøgelse evaluerede vi mRNA-ekspressionsdata fra unge og gamle musenyrer og udførte bio-informationsanalyser, der afslørede funktionerne af de afvigende udtrykte mRNA'er. Vi observerede 347 opregulerede mRNA'er og 355 nedregulerede mRNA'er samt 130 opregulerede lncRNA'er og 91 nedregulerede lncRNA'er igamle musenyrer sammenlignet med unge musenyrer. Derudover blev disse mRNA'er vist at være involveret i ældningsrelaterede veje, som f.eksoxidativ phosphorylering, AMPK-signalvejen, Wnt-signalvejen, Rap1-signalvejen og aldersrelateret sygdom, som demonstrerede funktionerne af differentielt udtrykte mRNA'er i patogenesen af ​​nyreældning.

Det lange ikke-kodende RNA NEAT1 er en beskyttende faktor i udviklingen af ​​nyrefibrose i renale tubulære epitelceller [21]. Tilfældigvis blev lncRNA NEAT1 i vores sekventeringsresultater udtrykt ved lavere niveauer i nyrerne hos gamle mus end hos unge mus, hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund. LincRNA-Gm4419 accelererer inflammation og fibrose ved NF-kB/NLRP3 inflammasom-medierede mekanismer i diabetisk nefropati [22]. I vores sekventeringsresultater fandt vi også, at ekspressionen af ​​Gm4419 var højere i nyrerne hos gamle mus end hos unge mus, men der var ingen signifikant forskel. LncRNA Gm43360 er placeret på kromosom 5 (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp). Ifølge UCSC Genome Browser er Gm43360 placeret i intronen af ​​det proteinkodende gen Atp2a2. Der har dog ikke været rapporter om involvering af lncRNA Gm43360 i sygdomme til dato. I denne undersøgelse fremmede knockdown af lncRNA Gm43360 renal tubulær epitelcelle-ældning. Derudover identificerede vi mange differentielt udtrykte lncRNA'er i sekventeringsresultaterne og undersøgte dem.

LncRNA'er blev klassificeret i cis-regulering eller trans-regulering baseret på lncRNA-reguleringsmekanismer. Cis-virkende lncRNA'er kunne påvirke ekspressionen af ​​nabogener ved at afhænge af cis-virkende elementer, såsom promotorer, enhancere og regulatoriske sekvenser, som er afstande mellem lncRNA'er og mRNA'er på mindre end 100 kb. Transvirkende lncRNA'er henviser til lncRNA'er, der forlader transfektionsstedet og opererer på fjerne steder (dvs. afstanden mellem lncRNA'er og mRNA'er er mere end 100 kb) [23]. lncRNA MAAT øger ekspressionen af ​​nabogenet Mbnl1 gennem et cis-regulatorisk modul [24]. lncRNA Pnky spiller en rolle som en transvirkende regulator i kortikal udvikling [25]. I denne undersøgelse var der et transregulatorisk forhold mellem lncRNA Gm43360 og Csnk1a1. Csnk1a1 er et tumorsuppressorgen [26], der koder for et protein, der deltager i cellecyklussen og celledelingsprocessen [27]. Csnk1a1 nedregulering inducerersenescens-associeret inflammatoriskrespons med vækststop i kolorektale tumorer [26]. Csnk1a1 blev nedreguleret, da Gm43360 blev opreguleret; således er det sandsynligt, at lncRNA Gm43360 deltager inyrernes aldringvedregulering af Csnk1a1-ekspression.

Konklusioner

Vores undersøgelse af lncRNA-mRNA coekspressionsnetværket inyrernes aldringafslørede et lncRNA, lncRNA Gm43360, kan spille en beskyttende rolle i nyrernes aldring og udvidede vores forståelse af mekanismerne involveret inyrernes aldring

Materialer og metoder

Prøver Unge (3-måned gamle) og gamle ({2}}måned gamle) C57BL/6J hanmus blev købt fra Experimental Animal Center ved Xiamen University og blev opdrættet i et standardmiljø. Alle mus havde fri adgang til mad og vand. Musene blev akklimatiseret til det nye anlæg i en måned, før de blev aflivet. Musene blev bedøvet med urethan ved intraperitoneal injektion i en dosis på 750 mg/kg før prøvetagning. Unge og gamle mus blev aflivet samme dag.Resterende musenyrevæv blev anvendt til sekventering i hvert assay. RNA-seq og histopatologi blev udført påseparate nyrerfra samme mus. Nyrevæv blev opsamlet fra mus. Den ene nyre blev straks nedsænket i 10 % neutral bufret formalin til efterfølgende snitindlejring, og den anden nyre blev opdelt i flere væv og straks anbragt i flydende nitrogen og derefter opbevaret ved -80 grad. Undersøgelsen blev støttet af den etiske komité for det første tilknyttede hospital ved Xi'an Jiaotong University (Shaanxi, Kina) (nr. 2018-G-164). Alle metoder blev udført efter de dyreetiske retningslinjer og regler. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne.

Nyre histopatologi

Nyrevævsprøver fra unge og gamle mus blev fikseret i 10% paraformaldehydopløsning natten over. Ti af sektionerne blev dehydreret, paraffin-indlejret og sektioneret i 4- µm tykkelse. PAS og Massons trikromatiske farvning blev udført under anvendelse af standardprotokoller. Billeder blev optaget af kameraet, og det farvningspositive område blev målt. Arealet for histopatologikamerabillederne blev beregnet med Image-Pro Plus 6.0.

SA‑‑gal farvning

SA{0}}gal-aktiviteten blev analyseret ved hjælp af et SA- -gal-farvningskit (Cell Signaling Technology #9860) i henhold til producentens protokol. Arealet med positiv farvning blev målt, og SA- -gal-positive celler blev beregnet ved hjælp af Image-Pro Plus 6.0.

Konstruktion og sekventering af RNA-ekstraktionsbibliotek

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 blev brugt til at konstruere et sekventeringsbibliotek. Efter ekstraktion af totalt RNA blev mRNA oprenset fra totalt RNA (5 ug) under anvendelse af Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) med to oprensningsrunder. Efter oprensning blev mRNA'et opdelt i korte fragmenter under anvendelse af divalente kationer ved høje temperaturer (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, kat. e6150, USA) under 94 grader 5-7 min). Derefter blev de spaltede RNA-fragmenter revers-transskriberet for at opnå cDNA'et ved SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, kat. 1.896.649, USA), som derefter blev brugt til at syntetisere U-mærkede andenstrengede DNA'er med E. coli DNA-polymerase I ( NEB, kat.m0209, USA), RNase H (NEB, kat.m0297, USA) og dUTP-opløsning (Termo Fisher, kat.R0133, USA). En A-base blev derefter tilsat til de stumpe ender af hver streng, hvilket gjorde dem klar til ligering til de indekserede adaptere. Hver adapter indeholdt et T-base-overhæng til ligering af adapteren til det A-halede fragmenterede DNA. Dual-index adaptere blev ligeret til fragmenterne, og størrelsesudvælgelse blev udført med AMPureXP perler. Efter den varmelabile UDG enzym (NEB, kat.m0280, USA) behandling af de U-mærkede andenstrengede DNA'er blev de ligerede produkter amplificeret med PCR ved følgende betingelser: initial denaturering ved 95 grader i 3 minutter; 8 cyklusser af denaturering ved 98 grader i 15 s, annealing ved 60 grader i 15 s og forlængelse ved 72 grader i 30 s; og derefter afsluttende forlængelse ved 72 grader i 5 min. Den gennemsnitlige insertlængde for de endelige cDNA-biblioteker var 300±50 bp. Til sidst udførte vi 2×150 bp parret ende-sekventering (PE150) på en Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Kina) i henhold til producentens protokol [28].

Bioinformatik analyse Sekvens og filtrering af Clean Reads

Et cDNA-bibliotek konstrueret ved hjælp af teknologi fra det poolede RNA franyreprøveraf mus blev sekventeret og kørt med Illumina NovaseqTM 6000 sekvensplatformen. Ved at bruge Illumina-parret RNA-seq-tilgangen sekventerede vi transkriptomet, hvilket genererede i alt millioner 2×150 bp parrede ende-læsninger. Aflæsninger opnået fra sekventeringsmaskinerne omfatter rålæsninger, der indeholder adaptere eller baser af lav kvalitet, som vil påvirke den følgende samling og analyse. For at få rene læsninger af høj kvalitet blev læsninger således filtreret yderligere af Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Parametrene var som følger:

1) fjernelse af aflæsninger, der indeholder adaptere;

2) fjernelse af læsninger indeholdende polyA og poly;

3) fjernelse af aflæsninger indeholdende mere end 5% af ukendte nukleotider (N);

4) fjernelse af aflæsninger af lav kvalitet, der indeholder mere end 20 % af lavkvalitets (Q-værdi mindre end eller lig med 20) baser.

Ti sekvenskvalitet blev verificeret ved hjælp af FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). inklusive Q20, Q30 og GC indholdet af de rene data. Derefter blev der produceret i alt G bp rensede, parrede ende-aflæsninger. De rå sekvensdata er blevet indsendt til NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) datasæt med adgangsnummer GSE154223.

Referencegenomet/annotationen var Mus_musculus.GRCm38. Kilden og versionen af ​​genannotationen, der blev brugt til analyser, var Ensembl_v88.

Afskrifter samling

For det første blev Cutadapt [29] brugt til at fjerne de aflæsninger, der indeholdt adapterkontamination, baser af lav kvalitet og ubestemte baser. Ti sekvenskvalitet blev meget fodret ved hjælp af FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Vi brugte Bowtie2 [31] og Hisat2 [32] til at kortlægge læsninger til musens genom. De kortlagte læsninger af hver prøve blev samlet ved hjælp af StringTie [33]. Ti, alle afskrifter franyreprøverblev slået sammen for at rekonstruere et omfattende transkriptom ved hjælp af Perl-scripts. Efter det endelige transkriptom blev genereret, blev StringTie [33] og edgeR [34] brugt til at estimere ekspressionsniveauerne for alle transkripter.

LncRNA identifikation

Først og fremmest blev transkripter, der overlappede med kendte mRNA'er og transkripter kortere end 200 bp, kasseret. Derefter brugte vi CPC [35] og CNCI [36] til at forudsige transskriptioner med kodningspotentiale. Alle transskriptioner med CPC-score<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Analyse af differentielt udtrykte analysegener (DGE'er).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 blev betragtet som differentielt udtrykte gener.

Målgenforudsigelse og funktionel analyse af lncRNA'er

For at udforske funktionen af ​​lncRNA'ers funktion forudsagde vi cis-målgenerne for lncRNA'er. LncRNA'er kan spille en cis-rolle ved at virke på nabomålgener. I denne undersøgelse blev kodende gener i 100,000 opstrøms og nedstrøms udvalgt af Perl-script. Derefter viste vi en funktionel analyse af målgenerne for lncRNA'er ved at bruge scripts BLAST2GO [39]. Det fulde kommandolink til det offentlige domæne var Jie-Li/README.md på main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Genontologi (GO) kategorier og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyse

Den bioinformatiske analyse til RNA-sekventering blev udført ved hjælp af OmicStudio-værktøjer (http://www.omicsudio. cn/tool). Gene Ontology (GO) funktionel berigelsesanalyse og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [37-39] berigelsesanalyse blev brugt til at analysere de biologiske funktioner af de forudsagte målgener. GO-analyse afklarer de vigtigste biologiske processer gennem tre aspekter: cellesammensætning, molekylære funktioner og biologiske processer (http://www.geneontology.org/). Analysen sætter først alle differentielt udtrykte gener og baggrundsgener i GO-databasen. Hvert element kortlægges, antallet af gener i hvert element beregnes, og den hypergeometriske fordeling bruges til at udføre hypotesetestning for at opnå P-værdien af ​​berigelsesresultatet. Jo lavere P-værdien er, jo mere signifikant er berigelsesresultatet. KEGG er en databaseressource, der analyserer de differentielt udtrykte mRNA'er ved genetisk biologi for at udforske vigtige veje relateret til målgener (https://www.genome.jp/kegg/). Resultaterne er udtrykt ved p-værdier; jo lavere p-værdi, jo mere signifikant er berigelsesresultatet.

QRT-PCR

GAPDH blev anvendt som den endogene kontrol. Derefter blev de relative ekspressionsniveauer af ukendte gener beregnet. Alle primere blev designet og syntetiseret specifikt til dette eksperiment. Primere til GAPDH er blevet kommercialiseret. Specificiteten af ​​Adra1a og Csnk1a1 primere blev identificeret ved den enkelte top af smeltekurven.

Byg mRNA-lncRNA coekspressionsnetværk

Transregulering var baseret på forskning, og derefter blev transenergien beregnet. Jo mindre transenergien var, jo større er muligheden for binding. Derefter blev korrelationskoefficienten for mRNA-lncRNA også beregnet. mRNA-lncRNA-netværket blev konstrueret ved at vælge en Spearman-korrelationskoefficient, der oversteg 0.9. mRNA-lncRNA coekspressionsnetværket blev konstrueret ved hjælp af Cytoscape software (v3.7.1).

Cellekultur

Muse-nyreproksimale tubulære epitelceller (MRPT-EpiCs) blev dyrket i epitelcellemedium-dyr (EpiCM-a, kat. #4131) indeholdende 2% føtalt bovint serum (FBS, kat. #0010) og epitelcellevæksttilskud-dyr (EpiCGS-a, Kat. #4182) uden antibiotika i en befugtet inkubator ved 37 grader og 5 % CO2. Dyrkningsmediet blev skiftet hver 2-3 dag. Cellerne i den logaritmiske vækstfase blev sub-dyrket, når væksten nåede 90 %. Cellesuspensionen fordøjet af trypsin blev podet i 6-brøndsplader med 2*104 -5*104 celler i hver brønd. De celler, der blev brugt til transfektion, var alle mellem generation 2 og 5.

Plasmidkonstruktion og celletransfektion

lncRNA Gm43360-overekspressionsplasmidet blev konstrueret af GeneChem (Shanghai, Kina). Plasmidrygraden var GV658, og CMV-promotoren drev lncRNA-ekspression. Den klonede nukleotidsekvens er tilvejebragt i det supplerende materiale. Til lncRNA Gm43360 knockdown SKAL tre lncRNA ENS00000197656-målrette siRNA'er (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'CUCA-CCCUGUCA UGAAGUUTT-3'; og lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGTT-3') blev designet og syntetiseret hos GenePharma (Shanghai, Kina). I henhold til producentens protokol blev celler transficeret med 2500 ng plasmid eller 100 pmol siRNA med 6 µl Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA) pr. brønd. RNA- og proteinekspressionsniveauer blev påvist 48 timer efter transfektion, og hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Real-time kvantitativ PCR blev brugt til at validere effektiviteten af ​​lncRNA Gm43360 overekspression og knockdown.

Western blot analyse

Dyrkede celler blev vasket med iskold PBS, 120 µl RIPA-buffer (Heart, Kina) blev tilsat, og proteaseinhibitor og PMSF (Heart, Kina) blev tilsat i 30 minutter på is. Efter opsamling af celler i forskellige mikrocentrifugerør blev proteinkoncentrationen kvantificeret. Påfyldningsbuffer blev tilsat til hver prøve og derefter kogt i 7 min. Tredive mikrogram af prøven blev adskilt med 12% SDS-PAGE (Beyotime, Kina) og elektrooverført til PVDF-membraner (Thermo Fisher, USA). Derefter blev membranerne blokeret med 5 % mælk. Membranerne blev inkuberet med specifikke primære antistoffer: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) og anti-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) natten over ved 4 grader . Efter vask med TBST blev membraner inkuberet med et sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Proteinbånd blev observeret under anvendelse af et kemiluminescenssæt (Millipore, USA). Ekspressionen af ​​GAPDH blev brugt til at normalisere proteinniveauer.

Celleproliferationsassay

Kapaciteten af ​​celleproliferation blev bestemt ved celletællingskit-8 (CCK-8) assay. 48 timer efter transfektion blev 90 µl nyt medium og 10 µl CCK-8-opløsning tilsat til hver brønd (Beyotime, C0042). Cellerne blev inkuberet i 1-4 timer ved 37 grader i 5% CO2 og målt ved 450 nm af en universel mikropladelæser (Bio-Tek, USA).

Flowcytometrisk analyse

Celler blev udpladet i 6-brøndsplader dagen før transfektion. 48 timer efter transfektion blev cellerne trypsinbehandlet og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min. Derefter blev cellerne fikseret i 70% ethanol ved 4 grader i mindst 4 timer. Efter centrifugering blev RNase A og propidiumiodid (PI)-farvningsopløsning tilsat til cellerne, og cellerne blev derefter inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Te-farvede celler blev analyseret under anvendelse af en ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

Statistisk analyse

Måledataene ved normalfordelingen præsenteres som middel ± SD. Forskellen mellem de to forskellige grupper blev bestemt ved hjælp af to-halede uparrede Students t-test, og en p-værdi < 0.05 blev anset for at være statistisk signifikant. Alle beregninger blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

Referencer

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Cellulær alderdom i nyren. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.

2. Agerhøne L, Deelen J, Slagboom PE. At stå over for de globale udfordringer med aldring. Natur. 2018;561(7721):45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 fremmer åreforkalkning ved at regulere MAPK og NF-kB signalveje. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Langt ikke-kodende RNA HOTAIR driver EZH2-afhængig myofibroblastaktivering i systemisk sklerose gennem miRNA 34a-afhængig aktivering af NOTCH. Ann Reumatic Dis. 2020;79(4):507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. LncRNA-p21 ændrer den antiandrogen enzalutamid-inducerede prostatacancer neuroendokrin differentiering via modulering af EZH2/STAT3-signaleringen. Nat Commun. 2019;10(1):2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. Et nyt lncRNA MCM3AP-AS1 fremmer væksten af ​​hepatocellulært karcinom ved at målrette mod miR-194-5p/FOXA1-aksen. Mol Cancer. 2019;18(1):28.

7. Wu YY, Kuo HC. Funktionelle roller og netværk af ikke-kodende RNA'er i patogenesen af ​​neurodegenerative sygdomme. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.

8. Li Z, Wang Z. Aldrende nyre og aldringsrelateret sygdom. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169-87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Regel AD. Alder, nyrefunktion og risikofaktorer er forskelligt forbundet med nyrernes kortikale og medullære volumener. Nyre Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR målretter mod miR-126-5p for at fremme progressionen af ​​Parkinsons sygdom gennem RAB3IP. Biol Chem. 2019;400(9):1217–28.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Shop for flere specifikationer detaljer:

https://www.xjcistanche.com/CISTANCHE-BUTIK