Forkonditioneringsaktiveret AKT kontrollerer neuronal tolerance over for iskæmi gennem MDM2–p53 PathwayⅠ

Abstrakt

En af de vigtigste mekanismer for prækonditioneringsmedieret neurobeskyttelse er svækkelsen af ​​celleapoptose, hvilket inducerer hjernetolerance efter efterfølgende skadelig iskæmi. I denne sammenhæng spiller den antiapoptotiske PI3K/AKT-signalvej en nøglerolle i reguleringen af ​​celledifferentiering og overlevelse.

Klik for at cistanche tubulosa pulver tilneurobeskyttelse

Aktiv AKT er kendt for at øge ekspressionen af ​​murine double minute-2 (MDM2), en E3-ubiquitin-ligase, der destabiliserer p53 for at fremme overlevelsen af ​​kræftceller. I neuroner viste vi for nylig, at MDM2-p53-interaktionen forstærkes af farmakologisk prækonditionering, baseret på subtoksisk stimulering af NMDA-glutamatreceptoren, som forhindrer iskæmi-induceret neuronal apoptose.

Hvorvidt denne mekanisme bidrager til neuronal tolerance under iskæmisk prækonditionering (IPC) er imidlertid ukendt. Her viser vi, at IPC inducerede PI3K-medieret phosphorylering af AKT ved Ser473, som igen phosphorylerede MDM2 ved Ser166. Denne phosphorylering udløste nuklear stabilisering af MDM2, hvilket førte til p53-destabilisering, hvilket forhindrede neuronal apoptose efter en iskæmisk fornærmelse. Hæmning af PI3K/AKT-vejen med wortmannin eller ved AKT-silencing inducerede akkumulering af cytosolisk MDM2, hvilket ophævede IPC-induceret neurobeskyttelse.

Således forbedrer IPC aktiveringen af ​​PI3K/AKT-signalvejen og fremmer neuronal tolerance ved at kontrollere MDM2-p53-interaktionen. Vores resultater giver en ny mekanistisk vej involveret i IPC-induceret neurobeskyttelse via modulering af AKT-signalering, hvilket tyder på, at AKT er et potentielt terapeutisk mål mod iskæmisk skade. Nøgleord: AKT; MDM2; p53; PI3K; iskæmisk tolerance; forkonditionering

1. Introduktion

Hos mennesker er eksistensen af ​​forbigående iskæmisk angreb (TIA) blevet afsløret som en endogen prækonditioneret tilstand med fordelene ved funktionelle resultater hos patienter med slagtilfælde [1-3]. Endogen neurobeskyttelse induceret af en kort, subtoksisk iskæmisk stimulus, kendt som iskæmisk prækonditionering (IPC), betragtes som en strategi inden for det nye område af neurobeskyttelse mod iskæmisk skade [4-6].

Beviser viser, at IPC-promoveret neurobeskyttelse afhænger af transkription, translation og post-translationelle mekanismer, som ændrer funktionen af ​​nøgleproteiner efter iskæmi [6-11]. Imidlertid er mekanismen involveret i IPC-induceret iskæmisk tolerance (IT) ikke blevet fuldstændig afklaret i den menneskelige hjerne [12,13].

Udviklingen af ​​nye eksperimentelle tilgange til at forstå IPC-medieret neurobeskyttelse repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at dechifrere de endogene mekanismer, der ligger til grund for hjerne-IT [6], som har potentialet til at afsløre nye terapeutiske mål, der sigter mod at minimere hjerneskade hos patienter med slagtilfælde. I de sidste to årtier har apoptotisk neuronal celledød positioneret sig som en væsentlig mekanisme involveret i cerebral iskæmisk skade [14-16]. I denne forstand er proteinkinase B eller AKT, en serin/threoninkinase, der kræver en funktionel phosphoinositidkinase (PI3K) for at blive aktiveret, blevet betragtet som et væsentligt mål for neurobeskyttende terapier efter iskæmi [17,18].

For nylig demonstrerede vi, at inhiberingen af ​​PI3K/AKT-signalvejen øger neuronal modtagelighed for excitotoksicitet [19]. AKT er involveret i et komplekst anti-apoptotisk signalnetværk [20], hvis komponenter kan være til stede på forskellige subcellulære steder afhængigt af vævstype [21,22]. I hjertet har AKT været involveret i prækonditioneringsfremmende kardiobeskyttelse [23].

Beviser viser også, at phosphoryleret AKT fremmer neuronal overlevelse ved begyndelsen af ​​cerebral iskæmi [24]. Selvom AKT-aktivering kan bidrage til induktion af IT i hjernen [25], forbliver den nøjagtige mekanisme, der involverer dens IPC-medierede aktivering, uhåndgribelig. I tumorceller fører aktivering af PI3K/AKT-signalvejen til MDM2-phosphorylering ved Ser166/186, hvilket fremmer nuklear translokation af MDM2 [26,27] og øger dets ubiquitineringsaktivitet [28].

I kernen binder MDM2 til p53 og fremmer dets ubiquitinering og efterfølgende proteasomal nedbrydning, hvilket hæmmer p53-funktionen [29]. Under stressforhold kunne p53 også udløse MDM2-overekspression, som omvendt undertrykker p53-aktivering i en negativ feedback-loop [30]. Hæmningen af ​​PI3K forhindrer AKT-aktivering [31] og MDM2-phosphorylering i det prækonditionerede hjerte [32].

I denne sammenhæng har vi tidligere fundet, at in vivo-hjerneprækonditionering reducerede infarktvolumen efter forbigående mellem-cerebral arterieokklusion (tMCAO) ved at øge MDM2-proteinniveauekspression. Som følge heraf svækkede MDM2-p53-komplekset iskæmi-induceret aktivering af p53/PUMA/caspase -3 signalvejen i primære kortikale neuroner [33].

Her graver vi ind i rollen for PI3K/AKT-signalvejen i IPC-medieret neuronal tolerance mod en efterfølgende iskæmisk skade, såvel som den underliggende mekanisme, og vi fokuserer hovedsageligt på den potentielle sammenhæng mellem AKT-aktivering og MDM2-p53-komplekset .

2. Resultater

2.1. IPC-Promoted Neuroprotection

Er medieret af fosforylering af AKT ved Ser473, fosforylering af MDM2 ved Ser166 og p53-destabilisering. Vi har tidligere beskrevet virkningen af ​​MDM2-p53-interaktion på neuronal modtagelighed for iskæmi [34] og IT [33]. Her undersøgte vi den potentielle rolle af AKT på IPC-medieret neurobeskyttelse som en kandidat til at blive involveret i MDM2-p53-vejen.

For det første bekræftede vi, at iskæmi fremmede AKT-aktivering i neuroner, som det fremgår af AKT-phosphorylering ved Ser473. Som vist i figur 1A inducerede kort (20 min) OGD signifikant p(Ser473)AKT- og MDM2-ekspression, mens AKT-proteinniveauer forblev uændrede (figur S1A). Imidlertid blev AKT-phosphorylering ikke observeret, når neuroner blev udsat for forlænget OGD (90 min). Desuden var MDM2-proteinniveauer lavere, hvilket er i overensstemmelse med den højere ekspression af p53-protein som vist i figur 1A.

Den tidsafhængige opregulering af Mdm2-ekspression efter OGD (Figur 1B) bekræfter, at subakut iskæmi kan være vigtig for at inducere mekanismer, der forhindrer p53-stabilisering efter OGD, som tidligere beskrevet [33]. Vi brugte kort OGD (20 min) efterfulgt af 2 timers reoxygenering som en model af IPC (figur S1B) [33]; således analyserede vi neuronale ekstrakter indsamlet ved 4 timers reoxygenering efter OGD (OGD/R) eller efter OGD forudgået af IPC-protokollen (IPC plus OGD/R). Parallelt hermed blev neuroner inkuberet i normoxia (Nx) eller prækonditionering (IPC) indstillinger (figur S1B).

Som vist i figur 1C og figur S1C inducerede IPC den tidlige aktivering af AKT, som afsløret ved phosphorylering ved Ser473 [35], efterfulgt af MDM2-proteinstabilisering og phosphorylering ved Ser166. IPC forhindrede også p53-stabilisering induceret af OGD/R (figur 1C). Interessant nok afslørede immunfluorescensbilleder vist i figur 1D, at IPC fremmede AKT-phosphorylering ved Ser473 i neuroner, som overvejende akkumulerede i kernen, og nedsatte p53-stabilisering efter OGD/R (IPC plus OGD/R) sammenlignet med ikke-forudkonditionerede neuroner (OGD). /R).

Som følge heraf forhindrede IPC neuronal apoptose og caspase-3-aktivering forårsaget af OGD/R, som målt ved henholdsvis flowcytometri (figur S1D) og fluorimetri-assays (figur S1E). For at bekræfte rollen af ​​p53 i IPC-medieret neurobeskyttelse brugte vi neuroner, der udtrykker (vildtype; wt) eller ej (knockout; ko) p53-protein. Vores resultater viser, at neuroner, der mangler p53 (figur S1F) var mere modstandsdygtige over for OGD-induceret apoptose end p53 wt neuroner.

Desuden svarede apoptoseniveauer i p53KO-neuroner til dem, der blev observeret i prækonditionerede (IPC plus OGD/R) wt-neuroner (figur S1G), hvilket bekræfter nøglerollen for p53-destabilisering i IPC-medieret neurobeskyttelse [33]. Vores resultater viser, at IPC inducerede neurobeskyttelse mod en iskæmisk fornærmelse gennem en mekanisme, der involverer phosphorylering af AKT ved Ser473, MDM2-stabilisering og phosphorylering ved Ser166 og p53-destabilisering.

2.2. IPC udløser MDM2-phosphorylering ved Ser166 via PI3K/AKT Pathway

PI3K/AKT-signalvejen er involveret i neuronal IT både in vitro [36] og in vivo [37]. Rollen af ​​IPC-medieret aktivering af PI3K/AKT-vejen i reguleringen af ​​MDM2-p53-komplekset forbliver dog uudforsket. For at afklare dette blev neuroner inkuberet med den irreversible og specifikke inhibitor af PI3K/AKT-vejen, wortmannin [19].

Som vist i figur 2A ophævede wortmannin IPC-forstærket (Ser473)AKT-phosphorylering og p53-destabilisering, som vist i figur 1D. Disse resultater tyder på en direkte sammenhæng mellem AKT-aktivering og inhibering af p53-medieret neuronal apoptose (figur S1D) og caspase-3-aktivering (figur S1E) induceret efter OGD/R. Hovedregulatoren for p53-stabilisering, MDM2, er et mål for AKT [26], som phosphorylerer MDM2 ved Ser166 og Ser186 [26]. PI3K-hæmning med wortmannin forhindrede phosphoryleringen af ​​både (Ser473)AKT og (Ser166)MDM2 induceret af IPC (figur 2B).

Den specifikke Akt-medierede phosphorylering af MDM2 ved Ser166 induceret af IPC blev bekræftet ved at bruge et lille interfererende RNA (siRNA) specifikt designet mod AKT1-protein (siAkt), stærkt udtrykt i corticale neuroner, og hvis aktivitet er afgørende for neuronal overlevelse efter iskæmi [ 38]. Som vist i figur 3 reducerede siAkt totale AKT- og p(Ser473)AKT-proteinniveauer på dag 3 efter transfektion, både i HEK-293T-celler (figur 3A) og i kortikale neuroner (figur 3B).

Desuden forhindrede AKT knockdown (siAkt) (Ser166) MDM2-phosphorylering (figur 3B). Disse resultater viser, at den IPC-aktiverede PI3K/AKT-signalvej fremmer MDM2-phosphorylering ved Ser166, som kan være ansvarlig for MDM2-stabilisering og deraf følgende p53-destabilisering efter iskæmisk skade.

2.3. IPC-aktiveret AKT udløser nuklear MDM2-proteinstabilisering efter iskæmi

Aktiveringen af ​​AKT har været involveret i nuklear translokation af MDM2 i tumorceller [26]. I betragtning af relevansen af ​​nuklear MDM2-stabilisering for neuronal overlevelse efter iskæmi [34] og mere specifikt dens neurobeskyttende rolle i IPC [33], besluttede vi yderligere at undersøge relevansen af ​​PI3K/AKT-signalvejen i reguleringen af ​​subcellulær lokalisering af MDM2 protein.

Således blev neuroner eller HEK-293T-celler transficeret med humant MDM2-mærket protein (MDM2-GFP). Repræsentative blots af transficerede HEK-293T-celler og billeder fra neuroner, der ektopisk udtrykker humant MDM2-protein efter fire forskellige eksperimentelle betingelser (Nx, IPC, OGD/R og IPC plus OGD/R) er vist i figur 4A og figur S1H , henholdsvis.

Ektopisk ekspression af MDM2- GFP bekræftede, at IPC fremmer MDM2-kerneakkumulering sammenlignet med ikke-forudkonditionerede iskæmiske (OGD/R) eller normoksiske (Nx) neuroner (figur 4A, B), som afsløret ved kvantificeringen af ​​nuklear/cytosolisk fluorescensforhold (Figur S2B) og nuklear fluorescensintensitet af MDM 2-GFP (Figur S2C).

2.4. IPC fremmer p(Ser473)AKT- og MDM2-interaktion, som forbedrer MDM2-stabilisering i kernen og reducerer induceret neuronal apoptose ved iskæmi

Efter demonstrationen af ​​rollen som IPC-forstærket aktivering af PI3K/AKT-vejen i den nukleare stabilisering af MDM2, undersøgte vi yderligere, om p(Ser473)AKT og MDM2 interagerede i kernen (figur 6A). MDM2-immunudfældning fra nukleare proteinekstrakter, efterfulgt af immunblotting mod MDM2 og p(Ser473)AKT, afslørede, at IPC fremmede interaktionen mellem p(Ser473)AKT og MDM2 efter OGD/R, hvilket forhindrede OGD/R-induceret nuklear p53-stabilisering, som vist i nucleus input (figur 6A).

Til sidst undersøgte vi den skadelige effekt af PI3K/AKT-vejafbrydelse på neuronal apoptose (figur 6B). AKT-hæmning modvirkede den beskyttende effekt af IPC før OGD, hvilket bekræfter den neurobeskyttende rolle af AKT-MDM2 i forbindelse med IT. Vores resultater viser således, at IPC inducerer phosphorylering og aktivering af AKT, som fremmer MDM2-phosphorylering ved Ser166 og nuklear translokation, hvor det interagerer med p(Ser473)AKT. Denne mekanisme kan bidrage til forbedret nuklear stabilisering af MDM2, som spiller en væsentlig rolle i IPC-induceret iskæmisk tolerance.

Hvordan beskytter Cistanche neuroner?

Der er nogle beviser, der tyder på, at Cistanche kan beskytte neuroner ved at reducere apoptose (programmeret celledød) og fremme neuronal overlevelse. Apoptose er en naturlig proces, der opstår i kroppen for at fjerne beskadigede eller uønskede celler, men det kan være skadeligt, når det forekommer overdrevent eller uhensigtsmæssigt. Cistanche har vist sig at hæmme apoptose i laboratorieundersøgelser, og denne effekt kan hjælpe med at beskytte neuroner mod skade.

Derudover indeholder Cistanche en række bioaktive forbindelser, som har vist sig at have neurobeskyttende virkning. For eksempel indeholder det echinacosid, som har vist sig at beskytte neuroner mod oxidativt stress og inflammation. Det indeholder også acteosid, som har vist sig at have anti-inflammatoriske og antioxidante egenskaber.

Fortsættes...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 og Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institute of Functional Biology and Genomics, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spanien; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Institut for Biomedicinsk Forskning i Salamanca, Salamanca Universitetshospital, Salamanca Universitet, CSIC, 37007 Salamanca, Spanien

3 Institut for Biokemi og Molekylær Biologi, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spanien 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spanien: * mdesteban@usal.es ; Tlf.: plus 34-923-29-4908