Potentiel terapeutisk fordel ved lavdosiscistanche ved kronisk træthedssyndrom

Kronisk træthedssyndrom(ME/CFS) er et invaliderende multisystemkronisk tilstand af ukendt ætiologiklassifified som en immun dysfunktionsyndrom og neurologisk lidelse. Opdagelsen af ​​den vidt udtrykte ForbigåendeReceptorpotentiale Melastatin 3 (TRPM3) som en nociceptorkanal væsentligt målrettetaf visse opioidreceptorer og dets implikation i calcium (Ca2 plus)-afhængig Natural Killer(NK) celle immunfunktioner har rejst muligheden for, at TRPM3 kan værefarmakologisk målrettet til behandling af karakteristiske symptomer på ME/CFS. Naltrexonhydrochlorid (NTX) virker som en antagonist til mu (m)-opioidreceptor således negerendedets hæmmende funktion på TRPM3. Baseret på fordelenerapporteret af patienter på deressymptomer, lav dosis NTX (LDN, 3.0–5.0 mg/dag) behandling ser ud til at give nogle potentielle fordeletyder på, at dets virkning kan være målrettet mod patomekanismen af ​​ME/CFS. Da der ikke findes litteratur, der bekræftereffektivitetenaf LDN til ME/CFS-patienterin vitro, denne undersøgelse undersøger den potentielle terapeutiske effekt af LDN hos ME/CFS-patienter. TRPM3ionkanalaktivitet blev målt efter modulering med Pregnenolonsulfat (PregS) og ingen iNK-celler på 9 ME/CFS-patienter, der tog LDN og 9 alders- og kønsmatchedesunde kontroller ved hjælp af helcelle patch-clamp-teknikken. Vi rapporterer, at ME/CFS-patientertager LDN har gendannet TRPM3-som ionstrømme i NK-celler. Små ionstrømme med entypisk TRPM3-som udadrettet berigtigelseblev målt efter påføring af PregS, enTRPM3-agonist i NK-celler fra patienter, der tager LDN. Derudover PregS-fremkaldt ioniskstrømme gennem TRPM3 var signifikantmoduleret af ingen i, en TRPM3-antagonist,i NK-celler fra ME/CFS-patienter, der tager LDN. Disse data understøtter hypotesen om, atLDN kan have potentiale som behandling af ME/CFS ved at karakterisere det underliggende regulatoriske mekanismer for LDN-behandling, der involverer TRPM3 og opioidreceptorer i NKceller. Endelig kan denne undersøgelse tjene til genbrug af markedsførte lægemidler samt støttegodkendelse af prospektive randomiserede kliniske undersøgelser af rollen og dosis af NTX ibehandling af ME/CFS-patienter.

Nøgleord:lav dosis cistanche, forbigående receptorpotentiale melastatin 3, calcium, opioidreceptor, myalgiskencephalomyelitis/kronisk træthedssyndrom, naturlige dræberceller, helcelle patch-clamp elektrofysiologi

INTRODUKTION

Myalgisk Encephalomyelitis/Kronisk træthedssyndrom(MIG/CFS) er en alvorlig multisystemisk tilstand karakteriseret vedvedvarende invaliderende træthed ledsaget af en række afinvaliderende symptomer, herunder utilpashed efter anstrengelse, søvndysfunktion, udbredt smerte, såvel som neurokognitive,autonome, kardiovaskulære, neuroendokrine og immunemanifestationer (1, 2). Der er varierende sværhedsgrad af ME/CFS(mild til meget alvorlig) (3), hvor væsentligtog konsekventimmun dysfunktion og abnormiteter i Natural Killer (NK)cellefunktioner er blevet rapporteret baseret på sværhedsgrad (4). Udenen klinisk etableret diagnostisk test, diagnosen er kompleks ogupræcis. Diagnose er i øjeblikket afhængig af forskellige symptombaseredecase definitioner, kendt som de canadiske konsensuskriterier(CCC, 2003) og International Case Criteria (2011), sombehandle de kliniske karakteristika ved ME/CFS (2, 5, 6). Detætiologi og specifikpatofysiologi af tilstanden, sompåvirker 17 til 24 millioner mennesker verden over (7), forbliver ukendt.ME/CFS udvikler sig potentielt på grund af svækkelse iTransient Receptor Potential (TRP) ikke-selektiv kationkanaler forårsaget af enten genetiske eller erhvervede faktorer (8–13). Tidligere undersøgelser antydede vigtigheden af ​​TRP Melastatin 3(TRPM3), et bredt udtrykt calcium (Ca2 plus)-permeabelikke-selektiv kationkanal, i patofysiologien af ​​ME/CFS(8–10). For nylig uafhængige elektrofysiologiske undersøgelserdemonstrerede et tab af funktion af TRPM3 ionkanal efterstimulering med to potente TRPM3-agonister, pregnenolonsulfat (PregS) og nifedipin, og hæmning med en selektivog potent blokker, deoxybezoin-ononetin, i NK-celler fratre forskellige kohorter af ME/CFS-patienter (11–13). TRPM3 er tidligere blevet identificeretsom kemo- ogtermosensitiv nociceptorkanal i det somatosensoriskesystem og er impliceret i påvisning af skadelig varme og inflammatoriskvarmehyperalgesi samt ved smerteoverførsel(14). Nyere litteratur tyder på, at signalvejeforbundet med aktivering af visse G-protein kobletreceptorer (GPCR'er), kaldet opioidreceptorer, kan hæmme TRPM3ionkanalaktivitet ved direkte binding af Gbgunderenhed aftrimere G-proteiner til ionkanalen (15–18). Fysiologisk,opioidreceptorer aktiveres af endogene opioidpeptider tilmodulerer smertemekanismer og inflammatoriskveje (19). Opioidmedicin eller opiater giver både smertestillende oguønskede bivirkninger ved at knytte sig til de samme GPCR'er (19). Beviser indikerer, at opioidreceptorer ikke kun udtrykkesaf centralnervesystemet (CNS), men er vidt udbredtpå væv og organsystemer uden for CNS, som f.eksimmunceller (20). Aktivering af leukocytopioidreceptorerfører til udskillelse af endogene opioidpeptider, somefterfølgende aktivere neuronale opioidreceptorer og lindresmerte (21). Opioider blev også vist at have immunsuppressiveeffekter på det medfødte og adaptive immunsystem (22). MIG/CFS patologi kan betragtes som en ionkanal lidelse ellerkanalopati (8–13) samt en immun dysfunktionsyndrom og neurologisk lidelse (23, 24). Derfor er det livsvigtigtat undersøge de reguleringsmekanismer, der ligger til grund forTRPM3-opioidreceptorinteraktion i NK-celler fra ME/CFSpatienter for bedre at forstå patogenesen.Opdagelsen af ​​TRPM3 som en nociceptorkanalvæsentligt målrettet af visse opioidreceptorer, såvel som detsimplikation i Ca2 plus-afhængige NK-cellers immunfunktionertyder på, at TRPM3-ionkanal kan være farmakologiskmålrettet til behandling af ME/CFS. Naltrexonhydrochlorid (NTX) er enspecifikt langvarig opioidantagonistrettet mod mu-opioidreceptor (MOR) og i mindre grad delta-opioidetreceptorer (dELLER) (25, 26). Bindingen af ​​NTX påmOR'er afviserden hæmmende funktion af disse opioidreceptorer på TRPM3 (15, 17, 18, 26). Det har vi tidligere rapporteretin vitrobehandlingaf NK-celler fra ME/CFS-patienter med NTX i 24 timer, genoprettesTRPM3 ionkanal aktiviteten (13). Restaurering af TRPM3-ionkanalaktiviteten genetablerede igen den passende Ca2 plussignalering ogi sig selvNK celler' aktiverings- og effektorfunktioner(13). NTX er almindeligt anvendt til behandling af opioid ogalkoholafhængighed i en dosis på 50-100 mg/dag (25). På højedosis, menes NTX at blokere de euforiske følelser af beta-endorfinersom er involveret i naturlige belønningskredsløb ogkan derfor opretholde afhængighed (27). En lav dosis (3.0–5.0 mg/dag,lavdosis NTX, LDN) ser ud til at have en modsat effekt,forstærker endorfineffekten for at reducere smerte og boostefornøjelse (28). Dette menes athar relevans ved sygdomsåsom ME/CFS, hvor det er utilstrækkeligtsekretion af endogeneopioide peptider påvirker immunrespons eller smertekontrol (29, 30), eller frigivelse af pro-inflammatoriskcytokiner (25, 31). En nyligundersøgelse rapporterede, at LDN er sikkert og effektivt til at lindre ME/CFSsymptomer ved retrospektiv undersøgelse af den kliniske patientoptegnelser over 218 ME/CFS-patienter administreret LDN (27). Selvomnye beviser tyder på, at LDN kan forbedre den daglige funktion oglivskvalitet hos ME/CFS-patienter, yderligerein vitroundersøgelse ernødvendig for at forstå de underliggende reguleringsmekanismerinvolverer TRPM3 og opioidreceptorer i NK-celler for at hjælpeforstå patomekanismen ved ME/CFS og identificereterapeutiske mål.Denne nuværende undersøgelse undersøgte den potentielle terapeutiske effektaf LDN hos ME/CFS-patienter ved at genoprette TRPM3-ionkanalfunktion i NK-celler ved hjælp af helcelle patch-clamp teknikker.Vores resultater indikerer, at ME/CFS-patienter, der tager LDN, hargendannet TRPM3-lignende ionstrømme i NK-celler. Restaurering afTRPM3-funktion er påkrævet for at fremme Ca2 plussignalombygningi NK-celler ogi sig selvNK celle aktivering og effektor funktioner.Dette er den førsteundersøgelse for at rapportere effektenaf LDN for ME/CFSpatienterin vitro, derfor bekræfterdets potentiale til brug som enbehandling af sygdommen.

Klik her for at vide mere om cistanche anti-træthedsfunktion

MATERIALER OG METODERRekruttering af deltagere

Ni ME/CFS-patienter og ni raske alders- og kønsvarendekontroller (HC) blev rekrutteret ved hjælp af National Center forNeuroimmunology and Emerging Diseases (NCNED) patientdatabase mellem september 2019 og februar 2021.Deltagerne var mellem 18 og 60 år. Alle ME/CFSpatienter havde tidligere modtaget en bekræftetmedicinsk diagnoseog blev screenet ved hjælp af et omfattende online spørgeskemasvarende til Centers for Disease Control ogForebyggelse (CDC), CCC og ICC sagsdefinitioner. Alle ni ME/CFS-patienter blev defineretaf CCC. Alle ni ME/CFS-patienterblev rekrutteret af NCNED, da de tidligere havde startet LDNbehandling (3.0–5.0 mg/dag) i mindst 4 uger som en del af deresledelsesplan efter ordination af deres praktiserende læge.HC rapporterede ingen forekomst af træthed og var ved godt helbreduden tegn på sygdom. Deltagerne blev udelukket fra detteundersøgelse, hvis de var gravide eller ammende, eller rapporterede entidligere rygning, alkoholmisbrug eller kronisk sygdom(f.eks. autoimmune sygdomme, hjerte-kar-sygdomme,diabetes, metabolisk syndrom, skjoldbruskkirtelsygdom, maligniteter,søvnløshed, kronisk træthed og primære psykologiske lidelser)eller var overvægtige (BMIStørre end eller lig med30). Ingen deltagere rapporterede brug af opioidereller andre smertestillende midler i de foregående 3 måneder samtfarmakologiske midler, der direkte eller indirekte påvirker TRPM3 eller Ca2 plussignalering. Deltagerne blev forsynet medmulighed for at stoppe enhver konfliktmedicin til minimum 14dage før bloddonation med godkendelse fra deres læge.Alle deltagere udfyldte et online spørgeskemasociodemografisk baggrund, sygehistorie, medicin ogsymptomhistorie for ME/CFS-patienter (tabel 1). 36-elementetkortformssundhedsundersøgelse (SF-36) og Verdenssundhedsorganisationen(WHO) Disability Assessment Schedule (DAS) blev brugt tilbestemme niveauet af handicap og livskvalitet (Tabel 2) (32, 33). Til sidst blev ME/CFS-patienter bedt om selv at rapportere sværhedsgraden afsymptomer før og efter indtagelse af LDN (Tabel 3). Detteundersøgelsen blev godkendt af GriffithUniversitetsmenneskeForskningsetisk Komité (GU2019/1005) og Gold CoastUniversitetshospitalet Human Research Ethics Committee(HREC/2019/QGC/56469).

Perifer blod mononukleær celleIsolering og Natural Killer Cell Isolation

I alt blev der opsamlet 85 ml fuldblodethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) rørviavenepunkturaf en kvalificeretphlebotomist fra hver deltager mellem kl. 8:30og 10:30 på indsamlingssteder, herunder GriffithUniversitet,Royal Brisbane og kvinder's Hospital, Robina Hospital, SunshineCoast University Hospital, Calvary John James Hospital,

Royal Melbourne Hospital, Australien. Rutinemæssig fuldblodanalyseblev udført inden for fire timer efter indsamling af røde blodlegemerantal, antal hvide blodlegemer og granulocytcelletal for hverdeltager på Gold Cost University Hospital eller Royal MelbourneHospital, Australien.Prøver blev leveret til laboratoriet og afidentificeretved hjælp af enunik kode af en uafhængig blodopsamler. Perifert blodmononukleære celler (PBMC'er) blev isoleret fra 80 ml helblod ved centrifugering over et densitetsgradientmedium (FicollPaque Premium; GE Healthcare, Uppsala, Sverige) som tidligerebeskrevet (34, 35). PBMC'er blev farvet med trypanblåt(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for at bestemme celletal ogcellelevedygtighed. PBMC'er blev justeret til enfifinal koncentration af5x107 celler/ml til NK-celleisolering.NK-celler blev isoleret ved immunomagnetisk selektion under anvendelse af enEasySep Negative Human NK Cell Isolation Kit (stamcelleTechnologies, Vancouver, BC, Canada). NK Celleoprensning blev bestemt vhaflflow cytometri. NK-celler blev inkubereti 20 minutter ved stuetemperatur i nærvær af CD56FITC ({{0}}.25µg/5µl) og CD3 PE Cy7 (0.25µg/20µl) monoklonalantistoffer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) som tidligerebeskrevet (10). 7-amino-actinomycin (7-AAD) (2,5 µl/test) (BDBioscience, San Jose, CA, USA) blev brugt til at bestemme cellelevedygtighed. Celler blev vasket og resuspenderet i 200ml affarvebuffer (BD Bioscience, New Jersey, USA) og erhvervetkl. 10,000 begivenheder ved hjælp af LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Diego, Californien, USA). Ved at bruge frem- og sidespredninglymfocytpopulationen blev lukket, mens prøven blev anskaffet.NK-cellepopulationen blev derefter identificeretsom CD3− CD56plusceller.

Helcelleelektrofysiologiregistrering

Elektrofysiologiske optagelser blev udført med borosilikatglaskapillarelektroder med en udvendig diameter på 1,5 mm og enindvendig diameter på 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,USA). Pipettemodstand ved fyldningmed pipetteopløsning var 8-12 MW. Pipetterne blev monteret på et CV203BU head-stage(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) forbundet til en 3-mådegrov manipulator og en mikromanipulator (Narishige, Tokyo,Japan). Elektriske signaler blev forstærketog optaget ved hjælp af enAxopatch 200B forstærkerog PClamp 10.7 software (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA). Data blev filtreretved 5 kHz ogsamplet digitalt ved 10 kHzviaen Digidata 1440A analog tildigital konverter (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Detspændingsrampeprotokol var et skridt fra et holdepotentiale på plus 10mV til−90 mV, efterfulgt af en 0,1 s rampe til plus 110 mV, førvender tilbage til plus 10 mV (gentages hvert 10. sekund). Væskeforbindelsenpotentiale mellem pipetten og badeløsningerne (−10 mV) varrettet. En lækstrømskomponent blev ikke trukket frade registrerede strømme. Elektroden var fyldtmed det intracellulærepipetteopløsning indeholdende 30 mM CsCl, 2 mM MgCl2110 mML-asparaginsyre, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM ATP,0,1 mM GTP, justeret pH til 7,2 med CsOH og osmolalitet på

290 mOsm/L med D-mannitol. Pipetteopløsningen blev filtreret ved hjælp af en 0.22mm membranfilter(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,USA), opdelt i alikvoter og opbevaret kl−20 grader. Badeløsningindeholdt: 130 mM NaCl, 10 mM CsCl, 1 mM MgCl21,5 mMCaCl22H2O, 10 mM HEPES, justeret pH til 7,4 med NaOH ogosmolalitet 300 mOsm/L med D-glukose. Alle reagenser varkøbt fra Sigma-Aldrich, bortset fra ATP og GTP detblev købt hos Sapphire Bioscience. TRPM3 ioniskstrømme på NK-celler blev stimuleret ved at tilføje 100mM PregS(Tocris Bioscience, Bristol, UK) til badeløsningen, hvorimodPregS-inducerede TRPM3-strømme blev blokeret ved at tilføje 10mM ononetin (Tocris Bioscience, Bristol, UK). For hver deltager,Der blev lavet 10 forskellige optagelser. Derfor refererer N til antallet afdeltagere i hver gruppe (ME/CFS-patienter eller HC) og n, tilantal aflæsninger eller prøvestørrelse. Alle målinger varudføres ved stuetemperatur. Forfatterne fjernedemulighed for involvering af kloridstrøm i TRPM3vurdering ved brug af L-asparaginsyre i den intracellulære pipetteløsning. Celler, der har ustabile strømme, blev også udelukketfra analysen.Statistisk analyseLymfocytpopulationer blev identificeretaf kammeratcytometri vhafrem og side spreder prikplot. Renheden af ​​CD3- CD56pluslymfocytter blev bestemt. Cytometridata blev eksporteret fraFacsDiva v8.1 og analyseret ved hjælp af SPSS v24 (IBM Corp, Version24, Armonk, NY, USA) og GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., Version 7, La Jolla, CA, USA). Elektrofysiologiskdata blev analyseret under anvendelse af pCLAMP 10.7 software (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA). Oprindelse 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, USA) og GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., Version 7, La Jolla, CA, USA) varbruges til statistisk analyse og datapræsentation. Visuelt ogberegnede metoder blev brugt til at bestemme normaliteten afuafhængige data.

Specifikt histogramplot ogShapiro-Wilk normalitetstest, skævhed og kurtosis blev brugtat bestemme fordelingen af ​​data og normalitet. Afhængigpå normalitet blev der udført en statistisk sammenligning vhauafhængig ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test, elleruafhængig parametrisk t-test. Fishers eksakte test var vant tilbestemme NK-cellernes følsomhed over for ononetin. Betydningvar angivet tilpå s<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">ellers angivet.RESULTATERDeltagerkarakteristika ogBlodparametreAtten alders- og kønsmatchede deltagere blev inkluderet fordenne undersøgelse. Demografiske data for patienter ersammenfattet itabel 1. Der var ingen væsentligforskel ialder eller køn mellem ME/CFS-patienter og HC. SF-36 ogWHODAS-undersøgelser blev brugt til at bestemme deltagernes helbredrelateret livskvalitet (Tabel 2) (36, 37). 

Som forventet var der en betydeligforskel i SF-36 og WHODAS-score mellemME/CFS-patienter og HC. Desuden fuld blodtællingparametre blev målt for hver rask deltager ogME/CFS patienter (Tabel 2). Mens vi rapporterede en betydelig forskel for eosinofiler mellem raske deltagere og ME/CFS-patienter, alle resultater var inden for de specificeredereferenceintervaller som leveret af Gold Coast University HospitalPatologienhed, NATA-akkrediteret laboratorium. Ingen væsentlig forskelle blev rapporteret i andre parametre. Endelig ME/CFSpatienter rapporterede forbedring i nedsat tankegang,koncentration og kognitiv overbelastning samt andet immunforsvarforstyrrelsessymptomer (ondt i halsen, forstørret eller øm lymfenoder, og modtagelighed for forkølelse/influenza) efter behandling medLDN (Tabel 3), som beskrevet før (27, 38). 

Natural Killer Cell Renhed

NK cellerenhed (CD3- /CD56plus) var 92,42 procent ± 1,849 for HC og82,20 procent ± 9,409 for ME/CFS-patienter, der tager LDN som bestemtvedflflow cytometri (Figur 1A). Der var ingen væsentlig forskel i NK-cellerenhed hos ME/CFS-patienter, der tager LDNsammenlignet med HC (Figur 1B).

TRPM3 ionkanalaktivitet efterPregnenolon-stimulering i NK-cellerFra ME/CFS-patienter, der tager LDNSammenlignet med NK-celler fra HC

TRPM3-ionkanalaktivitet blev registreret i isoleret humant NKceller fra ME/CFS-patienter, der tager LDN (3.0–5.0 mg/dag) ogsammenlignet med isolerede humane NK-celler fra alders- og kønsmatchedeHC, ved hjælp af helcelle patch-clamp-teknikken.Endogen TRPM3 ionkanal funktion var hurtigt ogreversibelt aktiveret ved anvendelse af 100mM PregS, enneuronalt steroid. Stimulering med PregS-aktiveret målingaf en lille udadrettet strøm under spændingsklemmebetingelser og observation af en typisk form for TRPM3-strømspændingenforhold (I–V) (Figur 2). Vi, derformålte en lille ionstrøm med en typisk TRPM3-lignendeudadrettet berigtigelsei NK-celler isoleret fra HC eftertilføjelse af PregS (Figur 2A, B). Interessant nok, PregSanvendelse i NK-celler fra ME/CFS-patienter, der tager LDNefterlignede den PregS-inducerede stigning i NK-celler fra HC(Figur 2C, D). Således inducerede PregS-stimulering en stigningaf de udadtil rettedestrømamplituder i NK-celler fraME/CFS-patienter, der tager LDN til samme niveau som NK-celler fraHC (Figur 2E). Desuden præsenterer de PregS-fremkaldte strømme entypiskI–V af TRPM3 (Figur 2D). Dataene tyder på, at ME/CFS-patienter, der tager LDN, har ikke længere en svækkelseTRPM3-kanalaktivitet som tidligere rapporteret (11–13), ogderfor kan LDN have en potentiel terapeutisk fordeltilpatologien.

Modulation af PregS- Fremkaldte StrømmeMed Ononetin i NK-celler fra ME/CFSPatienter, der tager LDN sammenlignet med NKCeller fra HC

PregS-induceret Ca2 plus-tilgangog ionstrømme gennem TRPM3ionkanaler kan effektivt hæmmes af en naturlig forbindelse,deoxybezoin ononetin (39). Derfor for at bekræfteden TRPM3aktivitet er involveret i PregS-fremkaldte ionstrømme i NK-celler, vinæste brugt 10mM ononetin til at modulere TRPM3 ionkanalaktivitet (Figur 3). Som tidligere vist (11–13), den ioniskestrømninger fremkaldt af anvendelsen af ​​PregS var effektivthæmmes af den samtidige påføring af ingen i isoleredeNK-celler fra HC (figur 3A–C). DesudenI–V afononetin-følsomme strømme blev udadrettetog typisktil TRPM3 (Figur 3B). Interessant nok fremkaldte de ioniske strømmeved PregS-applikation blev også effektivt hæmmet afsamtidig påføring af 10mMononetin i isoleret NKceller fra ME/CFS-patienter, der tager LDN (Figurer 3D–G). Faktisk har TRPM3-afhængig ionstrøm været tidligererapporteret at være resistent over for ononetin i isolerede NK-celler fraME/CFS patienter (11–13). Dog NK-celler fra ME/CFSpatienter, der tager LDN, er følsomme over for ononetin i samme områdesom NK-celler fra HC (Figur 3G). DesudenI–V af ononetinfølsomme strømme blev udadrettetog typisk for TRPM3

(Figur 3E). Langt om længe,Figur 3Hrapporterer TRPM3 aktuelamplituder efter PregS-stimulering og ononetin-modulationinden for HC og ME/CFS tager LDN-grupper og kunposter, der er følsomme over for ononetin, er inkluderet. En væsentlig fald i TRPM3 strømamplitude blev rapporteret eftermodulering med ononetin hos begge ME/CFS-patienter, der tagerLDN (p=0.0336) og HC (p=0.0205) grupper. Denne graf bekræfterTRPM3 ionkanal fungerer på samme måde i ME/CFSpatienter, der tager LDN i sammenligning med HC som den samme strømamplitudeområder er rapporteret (Figur 3H). Tilsammen disseresultater bekræfterat ME/CFS-patienter, der tager LDN, ikke har ensvækket TRPM3-ionkanalaktivitet, hvilket rapporteres at værekarakteristisk for sygdommen (11–13). Afslutningsvis behandlingmed LDN gør det muligt at gendanne TRPM3 ionkanalfunktion i ME/CFS-patienter og har derfor en potentiel terapeutisk effekt.

DISKUSSION

I denne undersøgelse brugte vi helcelle patch-clampteknik til at måle den endogene TRPM3 ionkanalfunktion i NK-celler fra ME/CFS-patienter, der tager LDN. Virapport til den førstetid, som ME/CFS-patienter, der tager LDN, hargendannet TRPM3-lignende ionstrømme i NK-celler. Faktiskanvendelse af PregS muliggjorde måling af små ioniskestrømme med en typisk TRPM3-som udadrettet opretningi NKceller fra patienter, der tager LDN. Derudover PregS-fremkaldt ioniskstrømme gennem TRPM3 var signifikantmoduleret afononetin i NK-celler fra ME/CFS-patienter, der tager LDN somtilsvarende beskrevet i HC. Disse resultater afspejlervores tidligere fundrapportering af en gendannelse af TRPM3 ionkanalfunktioni NK-celler fra ME/CFS-patienter efterin vitrobehandling medNTX (13). Disse resultater er også i overensstemmelse med vores tidligereundersøgelser, der tyder på ME/CFS, kan betragtes som enkanalopati induceret af TRPM3-tab af funktion ogkarakteriseret ved et fald i de PregS-inducerede ionstrømmesamt resistens mod ononetin i NK-celler fra ME/CFSpatienter (8–13). TRPM3-tab af funktion kan være ansvarligfor nedsatte Ca2 plussignalering og Ca2 plus-medierede cellefunktioner,herunder NK-celle immunfunktioner (11–13). Vores nuværende nye undersøgelse er den første in vitroundersøgelse bekræfter effektivitetenog terapeutisk fordelaf LDN til ME/CFS-patienterved at karakterisere de underliggende reguleringsmekanismer af LDNbehandling, der involverer TRPM3 og opioidreceptorinteraktioneni NK-celler. LDN er tidligere blevet rapporteret at være gavnligforbehandling af en række sygdomme, såsom dissemineret sklerose,Crohn's sygdom, fibromyalgi, kræft, inflammatorisktarmsygdom og ME/CFS (40–44). Mere specifikt, iforeløbig undersøgelse udført af Polo et al. på sikkerhed ogeffektiviteten af ​​LDN-behandling, 73,9 procent af ME/CFS-patienterrapporterede et positivt behandlingsrespons (27). De fleste patienteroplevet forbedret årvågenhed/årvågenhed og forbedret fysiskog kognitiv præstation. Nogle patienter rapporterede også mindre smerterog feber, hvilket viser, at LDN kan vise et vist potentiale tillindre et bredt spektrum af ME/CFS symptomer (27). TilsvarendeBolton og al. beskrevet tre case-rapporter udarbejdet af ME/CFSpatienter, der tog LDN og rapporterede rækken af ​​svar,fra livsændrende til kun at reducere nogle symptomer (38).

Baseret på fordelenerapporteret af patienter om deres symptomer,LDN-behandling kan bruges som en potentiel behandling og evtmålrette mod patomekanismen af ​​ME/CFS.Patogenesen af ​​ME/CFS er ukendt, men unormal ionkanaler og mere specifiktnedsat TRPM3 funktion harfor nylig optrådt som et karakteristisk træk ved sygdommen (8–13). Vi har tidligere rapporteret TRPM3 tab af funktion eftermodulering med potente TRPM3-agonister og antagonister i NKceller fra tre forskellige kohorter af ME/CFS-patienter (11–13). TRPM3 er blevet beskrevet som en central skuespiller i Ca2 plus- afhængige signalveje, både i excitable og ikke-exciterbareceller, hvor Ca2 plussignaler driver de forskellige cellulæreprocesser (45). Papanikolaou et al., identificeretTRPM3 som envigtig bestanddel af'Ca2 plusværktøjskasse' der understøtter butiksdrevetCa2 plusindgang og bæredygtigheden af ​​Ca2 plussignalerer indCNS hvidstof glia (46). På samme måde blev TRPM3 vist at føretil en stigning på ca2 plus tilstrømningi bugspytkirtlens betaceller, hvilket resulterer iefterfølgende insulinfrigivelse (47). Hver celletype præsenterer en uniksignalerende fænotype, der er i stand til at levere stramt reguleretspatiotemporal Ca2 plussignaler til at modulere dens særlige funktion(48). Som følge heraf kan enhver subtil dysregulering af Ca2 plussignaler evthar stor indflydelse på cellefunktioner og resulterer i sygdomme (48, 49). NK-celler kræver også Ca2 plusfor effektivstimulering ogfunktioner, herunder NK-celle cytotoksicitet (50–53). KompromitteretNK celle cytotoksisk funktion er en veldokumenteret og konsistenttræk ved ME/CFS (54). Derfor kan TRPM3 tab af funktion muligvisbidrage til ME/CFS-symptomatologi ved at påvirkeCa2 plussignalering og Ca2 plus-medierede cellefunktioner, herunder NKcelle immunfunktioner.En velkarakteriseret funktion af TRPM3 i litteraturen er densrolle i påvisningen af ​​skadelig varme (akut smerte) samt inflammatoriskhyperalgesi (akutte og kroniske smerter) (14). Endogene opioider syntetiseresin vivoat modulerefysiologiske analgetiske reaktioner ved inflammatoriskogneuropatiske smerter. Endogene og eksogene opioider binder sig tilOR'erne, der findes i periferien, ved præsynaptisk og postsynaptisksteder i rygmarvens dorsale horn og i hjernestammen,thalamus og cortex, i det, der udgør den stigende smertetransmissionssystem (55). Nylige undersøgelser har rapporteret detopioidreceptorer udtrykkes også af immunceller til at udføreimmuncellemedieret opioidanalgesi ved at producere endogenopioide peptider, som involverer Gai/o–Gbg–phospholipase C(PLC)–inositol 1,4,5-trisphosphatreceptor (IP3R)– intracellulærtCa2 plusvej. De frigivne opioidpeptider aktiveres efterfølgendeperifere neuronale opioidreceptorer og lindre smerte (21). Opioider blev også vist at direkte modulere funktionerne aflymfocytter og andre celler involveret i værtsforsvar ogimmunitet resulterer i immunsuppressive virkninger (56, 57). Mere specifikt, aktivering af OR af opioide alkaloider ogpeptider såsom morfin og de endogene peptider,herunder beta-endorfin og dynorphinpeptiderne, hvilket fører til ennedsat antal makrofager, nedsat leukocyttalspredning og migration til inflammatoriskwebsteder, faldtfagocytotisk aktivitet af makrofager, nedsat kemotaksi ogsuperoxidproduktion af neutrofiler og makrofager,accelereret apoptose af makrofager, svækket mikrobiologibeskyttelse og reduceret adhæsion af leukocytter og endotelceller (58). Andre negative effekter er også blevet beskrevet irelation til mastceller, dendritiske celler og NK-celler med enreduceret NK-celle cytotoksicitet og cytokinproduktion (22, 56, 59, 60). Immuncellerne, glia og neuroner danner derfor enintegreret netværk, der koordinerer immunresponser ogmodulerer excitabiliteten af ​​smerteveje (61). Målretning afopioidreceptorer på immuncellerne kan resultere i ændringer iimmunresponser for at fremme opløsningen af ​​inflflammation somsamt modulering af smerter hos ME/CFS-patienter.Interessant nok molekyler, der binder til og aktiverer opioidreceptorer betydeligtreducere TRPM3-afhængig smerte. Irespons på akut aktivering af agonister, opioidreceptorerpar til Gi/o proteiner, der dissocierer til Gai/o og Gbgunderenheder til at interagere med intracellulære effektorer (62). TRPM3aktivitet er stærkt hæmmet af aktiveringen af ​​µOR igennemden direkte interaktion med Gbgsom TRPM3-afhængig Ca2 plusindgange er stærkt og reversibelt hæmmet, når cellenmembran erflflindledt med renset Gbg(15–18). NTX er en langtidsholdbaropioidantagonist specifikthæmmendemOR'er, altsåophævelse af denne opioidreceptors hæmmende funktionTRPM3 (22, 26). I vores tidligere undersøgelse har vi rapporteret detin vitrobehandling med NTX genopretter TRPM3 ionkanalaktivitet i NK-celler isoleret fra ME/CFS (13). Tilsvarende idet nuværende studie gjorde NK-celler isoleret fra patienter, der tog LDNikke udviser nogen forringet TRPM3-ionkanalaktivitet. LDNbehandling hos ME/CFS-patienter ser ud til at genoprette TRPM3-ionkanalfunktion i NK-celler, hvilket resulterer i Ca2 plussignalerombygning for at bidrage til genoprettelse af integritetenog stabilitet af den NK-cellespecifikkesignalsystemer (10–13). Interessant nok er det blevet rapporteret, at antagonismeeffekten afNTX tændtmOR forstyrrer også den negative feedback-regulering vedrdELLER, og derved øgesdELLER-funktion.

Forstærkning afdELLERaktivitet fremmer NK-celle cytotoksicitet som reaktion på beta-endorfiner in vitropå rottesplenocytter, hvilket tyder på potentialetbrug af NTX til behandling af immundefekt (63). Mekanismen bag LDN's effektivitetfor træthed,Crohn's sygdom, fibromyalgiog dissemineret sklerose, derfor,involverer intermitterende blokade af opioidreceptorer efterfulgt afCa2 plus afhængig produktionog opregulering af endogeneopioider. Ludwig et al. rapporterede, at serum [Met5 ]-enkephalinniveauer var lavere hos mennesker med dissemineret sklerose i forhold tilikke-multipel sklerosepatienter, og LDN genoprettede deres niveauer.Tilsvarende i eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis mus,[Mødte5 ]-enkephalin-niveauer blev sænket før fremkomstenaf klinisk sygdom og blev genoprettet med LDN-behandling(28). Derfor ser det ud til, at LDN-behandling resulterer iforstærkning af de smertestillende virkninger og kan være relevant iME/CFS, hvor utilstrækkeligtsekretion af opioidpeptider påvirkerimmunrespons eller smertekontrol (29, 30), eller frigivelse af proinflammatoriskcytokiner (25, 31). Faktisk reduceret beta-endorfinerkoncentration er blevet rapporteret ved ME/CFSpatienter, der lider af dysregulering af termoregulatoriskreaktioner og generaliserede alvorlige eller langvarige smerter (64). Som konklusion, denne undersøgelse for den førstetid vurderet og identificereteffekten af ​​LDN på TRPM3 ionkanalfunktion iNK-celler hos ME/CFS-patienter. Denne nye undersøgelse rapportererunderliggende restaurering af TRPM3-opioidreceptorkanalinteraktion i NK-celler fra ME/CFS-patienter, der tager LDN.Desuden er den brede fordeling af TRPM3-ionkanaler ikrop antyder, at deres kompromitterede funktion kan bidrage tiltegn og symptomer på ME/CFS og derfor behandling medLDN kan have en terapeutisk rolle. Endelig tjener denne undersøgelse tilunderstøtte planlægning og godkendelse af potentielle randomiseredekliniske undersøgelser af NTX's rolle og dosis ved behandling af ME/CFS patienter.