Porcint placentaekstrakt øger de cellulære NAD-niveauer i humane epidermale keratinocytter

Bedste urter til anti-aging-urtecistanche

Nikotinamid adenindinukleotid(NAD) er en klassisk cofaktor for mange redoxreaktioner og er til stede i alle levende celler i de oxiderede (NAD plus ) og reducerede (NADH) former. NAD plus er også kendt som et essentielt co-substrat for NAD plus-forbrugende enzymer såsom sirtuin (SIRT) og poly ADP-ribose polymerase (PARP). Fordi disse enzymer spiller en central rolle i forskellige biologiske processer, herunder DNA-reparation, mitokondriel metabolisme og stressresistens, påvirker ubalanceret NAD-homeostase deres centrale processer1. NAD-niveauer i væv/organer falder med alderen, hvilket resulterer i ubalanceret NAD-homeostase2-6. Derfor er der nu enighed om, at opretholdelse af NAD-niveauer fører til forebyggelse og behandling af aldring og aldersrelaterede sygdomme7. NAD biosyntetiseres via en række forskellige veje, herunder de novo biosyntese fra tryptophan, Preiss-Handler-vejen fra nikotinsyre og redningsvejen fra nikotinamid (NAM)8. Hos pattedyr er redningsvejen den vigtigste vej til opretholdelse af cellulære NAD-niveauer9. I denne vej omdannes NAM til nikotinamidmononukleotid (NMN) af NAM-phosphoribosyltransferase (NAMPT) og omdannes derefter til NAD af NMN-adenylyltransferaser. Nikotinamidribosid (NR) omdannes til NMN af NR-kinaser og integreres derefter i redningsvejen. NAD-mellemmetabolitter, såsom NMN og NR, har vist sig at hæve NAD-niveauer i forskellige celler og væv og forbedre aldersrelaterede sygdomme10,11.

Placentalekstrakt (PE) er blevet meget brugt i traditionel medicin til sårheling. PE er en rig kilde til adskillige bioaktive komponenter, herunder aminosyrer, nukleinsyrer, fedtsyrer, mineraler, vitaminer, hormoner, bioaktive peptider, cytokiner og vækstfaktorer. Det er kendt for at have forskellige farmakologiske aktiviteter, såsom anti-inflammatorisk, antioxidant, regenerativ og immunmodulerende virkning12. Subkutane og intramuskulære injektioner af human PE (HPE) er således blevet klinisk brugt til behandling af flere sygdomme, herunder menopausale symptomer og kronisk leversygdom13. Desuden bruges HPE klinisk som et anti-rynkemiddel hovedsageligt i asiatiske lande på grund af dets virkninger på cellevækst og kollagensyntese14. Da brugen af ​​HPE er begrænset til medicinske anvendelser i nogle lande, såsom Japan, blev porcin PE (PPE) for nylig udviklet som et alternativ til HPE og brugt som en råingrediens i helsekost og kosmetik. En in vivo-undersøgelse med en musekontaktdermatitis-model viste, at topisk PPE har antiinflammatoriske og antioxidative virkninger på huden15. Kliniske undersøgelser har rapporteret, at topisk PPE er gavnlig til behandling af kroniske ikke-helende sår og til at forhindre rynkedannelse16,17. Ydermere blev et randomiseret, dobbeltblindt, placebokontrolleret klinisk forsøg udført med raske voksne kvinder for at validere hudfordelene ved oral indtagelse af PPE og viste, at hudtilstanden for PPE-indtagsgruppen var signifikant forbedret18. Disse rapporter understøtter konceptet om, at PPE-behandling kan lindre eller forhindre hudens aldring.

PE er konventionelt blevet brugt som enanti-aldringsmiddel, og talrige kliniske undersøgelser har etableret detanti-aging egenskaber. Den mekanisme, der ligger til grund for anti-aldringseffekterne af PE, er dog stadig uklar. Denne rapport viste, at PPE indeholder flere NAD-prækursorer, såsom NMN og NR, og øger intracellulære NAD-niveauer i normale humane epidermale keratinocytter (NHEK'er). Vores resultater giver ny indsigt i den mekanisme, hvorigennem PE udøver sine anti-aldringseffekter ved at opretholde intracellulær NAD-homeostase.

Resultater

PPE øger intracellulære NAD-niveauer. For at undersøge, om PPE ændrer cellulære NAD-tilstande, dyrkede vi NHEK'er i et medium suppleret med PPE og kvantificerede deres intracellulære NAD plus- og NADH-niveauer. Resultaterne viste, at PPE signifikant øgede mængden af ​​både NAD plus og NADH i NHEK'er på en dosisafhængig måde (fig. 1A). Det totale NAD (NAD plus plus NADH) niveau for cellerne behandlet med 1 mg/ml PPE var ca. 1,5 gange højere end for ubehandlede celler (fig. 1A). Derudover blev der i et tidsforløbseksperiment observeret signifikant stigning i NAD plus, NADH og totale NAD niveauer efter 4 timers behandling med 1 mg/ml PPE (fig. 1B). Te {{10}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-assay bekræftede, at {{20} },5-2 mg/mL PPE havde ingen effekt på cellemetaboliske aktivitet, hvorimod 5 mg/mL PPE eller den positive kontrol (0,2 procent Triton X-100 [TX-100]) udviste signifikant celletoksicitet (fig. 1C). Da NAD næppe blev påvist i selve PPE (data ikke vist), så den NAD-producerende effekt af PPE ikke ud til at skyldes tilstrømningen af ​​PPE-afledt NAD til NHEK'er. Disse resultater tyder således på, at PPE kan øge intracellulære NAD-niveauer. Aktive ingredienser i PPE er små molekyler, ikke proteiner. For at bestemme, om PPE booster cellulær NAD-biosyntese via NAMPT-reaktionen i NAD-redningsvejen, udførte vi en NAD-gendannelsesassay ved hjælp af NAMPT-hæmmeren FK866 (fig. 2A). FK866 reducerede de totale NAD-niveauer betydeligt 24 timer efter tilsætning (fig. 2B).

Interessant nok, på trods af fraværet af NAMPT-aktivitet i NHEK'er, inducerede PPE-undertrykte FK{{0}} udtømning af NAD på en dosisafhængig måde (fig. 2B). Mange rapporter har vist, at PE indeholder proteiner som cytokiner og vækstfaktorer13,19,20. Derfor antog vi, at nogle bioaktive proteiner eller porcin NAMPT indeholdt i PPE kunne forbedre intracellulær NAD-biosyntese i NHEK'er. For at bekræfte vores hypotese adskilte vi PPE i høj- og lavmolekylære (HMW, LMW) fraktioner ved hjælp af en centrifugalfilteranordning (cutoff: 3 kDa). Da NAD-genvindingsassayet ved hjælp af FK866 viste effekten af ​​PPE på NAD-biosyntese mere tydeligt end i fravær af FK866 (fig. 1A og 2B), fortsatte vi med at identificere de aktive ingredienser i PPE ved at bruge dette assay. Uventet krævede HMW-PPE en høj koncentration på 1 mg/ml for signifikant genoprettelse af NAD-niveauer, mens LMW-PPE klart forbedrede den FK866-inducerede NAD-depletering selv ved en lav koncentration på 0,25 mg/ml (fig. 2C og D). Disse resultater tyder således på, at de primære aktive ingredienser i PPE er små molekyler på mindre end 3 kDa, snarere end proteiner såsom vækstfaktorer og cytokiner.

PPE indeholder NAD-prækursorer, såsom NMN og NR. Vi fraktionerede yderligere LMW-PPE i 12 fraktioner ved hjælp af omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) og undersøgte, hvilken fraktion der bidrog til genoprettelse af FK866-induceret NAD-udtømning. Et typisk HPLC-kromatogram af LMW-PPE er vist i fig. 3A. NAD-genvindingsassayet viste, at kun fraktion 3 tydeligt øgede NAD-niveauer i FK866-behandlede NHEK'er (fig. 3B). NAD-prækursorer, såsom NMN og NR, hæver intracellulære NAD-niveauer uden NAMPT-intervention i forskellige cellelinjer, herunder NHEKs10,21. Da LMW-PPE stadig øgede NAD-indholdet i NHEK'er, selv når NAMPT blev hæmmet af FK866, antog vi, at NAD-prækursorer indeholdt i PPE øger intracellulær NAD-produktion. For at teste denne hypotese analyserede vi fraktion 3 ved hjælp af væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) for at detektere NAD-prækursorerne. Resultaterne viste, at tre iontoppe i overensstemmelse med NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) og NAM (m/z 123→80) blev påvist i fraktion 3 ( Fig. 3C). Kvantificeringsanalyserne afslørede, at koncentrationen af ​​NMN, NR og NAM indeholdt i hele PPE var henholdsvis 0,22, 17,62 og 0,14 ng/mg (tabel 1). Disse resultater tyder på, at mindst tre NAD-precursorer, NMN, NR og NAM, er til stede i PPE og deltager i intracellulær NAD-boosting.

Figur 2. PPE forbedrer udtømningen af ​​NAD af FK866 i NHEK'er. (A) Bjærgningsvejen for NAD-biosyntese. Te NHEK'er blev forbehandlet med FK866 i 30 minutter og inkuberet med hel-PPE (B), HMW-PPE (C) eller LMW-PPE (D) ved de angivne koncentrationer i 24 timer. De totale NAD-niveauer blev bestemt under anvendelse af NAD plus/NADH-assay-kittet. †s<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Topisk administration af PPE på rekonstrueret human epidermis øger NAD-niveauer af væv. De primære aktive ingredienser i den NAD-boostende effekt af PPE er små molekyler, som kan forventes at have højere transdermal absorberbarhed end større proteiner såsom vækstfaktorer. Derfor synes topisk påføring af PPE på huden at være en passende mulighed for at øge NAD-niveauer i hudvæv. For at undersøge, om topisk administration af PPE påvirker NAD-niveauer i epidermis under stratum corneum, blev den 3-dimensionelle rekonstruerede humane epidermis (RHE) behandlet med PPE på stratum corneum-siden og dyrket i et medium med tilstedeværelse eller fravær af FK866 (fig. 4A). Topisk anvendelse af PPE øgede NAD-niveauer med henholdsvis 9,1 procent (ikke signifikant) eller 7,3 procent (signifikant) i fravær eller tilstedeværelse af FK866 (fig. 4B). PPE havde ingen effekt på cellemetaboliske aktivitet, når de blev testet op til 10 mg/ml, hvorimod 1 procent TX-100 var markant reduceret (fig. 4C). Disse resultater tyder på, at de aktive ingredienser i PPE kan infiltrere den subcorneale hud og øge hudens NAD-niveauer uden at forårsage skadelige virkninger.

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: plus 86 15292862950