Phloretin undertrykker neuroinflammation ved autofagi-medieret Nrf2-aktivering i makrofager

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt

Baggrund: Makrofager spiller en dobbelt rolle i neuroinflammatoriske lidelser såsom dissemineret sklerose (MS). De er involveret i læsionens begyndelse og progression, men kan også fremme løsningen afbetændelseog reparation af beskadiget væv. I denne undersøgelse undersøger vi om og hvordanphloretin, et flavonoid, der er rigeligt til stede i æbler og jordbær, sænker den inflammatoriske fænotype af makrofager og undertrykkerneuroinflammation.

Metoder: Transskriptionelle ændringer i museknoglemarvs-afledte makrofager efter phloretineksponering blev vurderet ved bulk-RNA-sekventering. Underliggende veje relateret til inflammation, oxidativ stressrespons og autofagi blev valideret ved kvantitativ PCR, fluorescens- og absorbansassays, nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2 (Nrf2) knockout mus, western blot og immunfluorescens. Den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) model blev brugt til at studere virkningen af ​​phloretin på neuroinflammation in vivo og bekræfte underliggende mekanismer.

Resultater: Vi viser, at phloretin reducerer den inflammatoriske fænotype af makrofager og markant undertrykker neuroinflammation i EAE. Phloretin medierer sin virkning ved at aktivere Nr2-signalvejen. Nrf2-aktivering blev tilskrevet 5'AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK)-afhængig aktivering af autofagi og efterfølgende kelch-lignende ECH-associeret protein 1(Keap1) nedbrydning.

Konklusioner: Denne undersøgelse åbner fremtidige perspektiver for phloretin som en terapeutisk strategi for neuroinflammatoriske lidelser såsom MS.

Prøveregistrering: Ikke anvendelig.

Nøgleord: Phloretin, Makrofager, Neuroinflammation, Multipel sklerose, Autoimmunitet

Klik her for at få flere oplysninger

Baggrund

Aktiv multipel sklerose (MS) læsioner er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​talrigemakrofager[1-5]. Tidlige undersøgelser viste, at makrofager indtager en pro-inflammatorisk fænotype i MS-læsioner og derved fremmerneuroinflammation, demyelinisering og neurodegeneration. Sygdomsfremmende effektorfunktioner omfatter præsentationen af ​​centralnervesystemet (CNS)-afledte antigener til autoreaktive T-celler og produktionen af ​​inflammatoriske mediatorer såsom pro-inflammatoriske cytokiner, reaktive oxygenarter (ROS) og nitrogenoxid (NO)[ 6,7]. For nylig har det vist sig, at makrofager også har gavnlige funktioner i MS-læsioner, da de kan omforme deres fænotype til en, der typisk er forbundet med immunsuppression og CNS-reparation. Denne beskyttende fænotype er karakteriseret ved en reduceret produktion af pro-inflammatoriske mediatorer, produktion af anti-inflammatoriske mediatorer og vækstfaktorer og aktivering af antioxidative veje såsom den nuklear faktor erythroid 2-relaterede faktor 2(Nrf2) pathway [8-14]. Da makrofagernes inflammatoriske status er blevet forbundet med progressionen af ​​MS og udviklingen af ​​kroniske aktive læsioner, anses det for at drive makrofager til en gavnlig fænotype for at være en lovende strategi til at begrænse progressionen af ​​MS [15].

Kostkomponenter driver makrofagfunktion og neuroinflammation [16]. Især er familien af ​​flavonoider i stigende grad anerkendt for at indeholde lovende forbindelser, der påvirker patogene veje og modulerer fænotypen af ​​immunceller såsom makrofager[17,18]. Flavonoider danner en af ​​de største phytonutrient-familier, der indeholder over 8000 phenolforbindelser med forskellig bioaktivitet. Adskillige medlemmer af flavonoidfamilien udviser antiinflammatoriske og antioxidative virkninger på makrofager [19-21]. Flavonoidet phloretin er et medlem af dihydrochalconerne og er til stede i almindeligt forbrugte frugter som æbler og jordbær. Phloretin er kendt for at udøve immunmodulerende egenskaber og er meget brugt til hudpleje på grund af dets antioxidative egenskaber [22-24]. Desuden er phloretin en glukosetransportør (GLUT) hæmmer, en funktion, der påvirker fænotypen af ​​makrofager, da makrofagaktivering er drevet af GLUT [25, 26]. Samlet set gør disse egenskaber phloretin til en lovende forbindelse til at modulere fænotypen af ​​makrofager og neuroinflammation. I denne undersøgelse viser vi, at phloretin driver makrofager mod en mindre inflammatorisk fænotype og lindrer neuroinflammation i den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. RNA-sekventering og funktionelle eksperimenter identificerede Nrf2-vejen som et knudepunkt og driver for denne beskyttende makrofagfænotype induceret af phloretin. AMPK-afhængig aktivering af autofagimaskineriet og efterfølgende SQSTMl/p62-medieret (herefter benævnt p62) nedbrydning af Keapl, en adapter, der letter proteasomal Nrf2-nedbrydning, blev fundet at ligge til grund for Nrf2-aktivering i makrofager. Disse resultater viser, at phloretin har potentialet til at blive brugt i terapeutiske strategier for neuroinflammatoriske lidelser.

Metoder

Antistoffer og kemiske reagenser

Phloretin(Sigma Aldrich) blev opløst i 50 mM KOH til en 15 mM stamopløsning og opbevaret ved -20 grad. Yderligere fortyndinger blev foretaget i et RPMI1640 (Gibco) medium. Til in vivo-behandling blev phloretin opløst i 1 N NaOH, hvorefter pH-værdien blev genjusteret til 7,2 med 1 N HCL, og opløsningen blev yderligere fortyndet i fysiologisk vand til opnåelse af en koncentration på 50 mg/kg. BML-275(1 μM, Santa Cruz Biotechnology) blev tilsat 1 time før phloretinbehandling for at hæmme AMPK-aktivering. Bafilomycin A1 (BAF, 0,1 μM, InvivoGen) blev tilsat 2 timer før opsamling for at blokere fusionen af ​​autophagosomer og lysosomer. Lipopolysaccharid (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) blev brugt til at stimulere celler til inflammatorisk fænotyping. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) blev brugt til at inducere ROS-produktion. Følgende antistoffer blev brugt til western blot: muse anti- -actin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), muse anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), kanin anti-AMPK (1:1000;5831S, cellesignalteknologi), kanin anti-phosphoryleret AMPK(1:1000; 2535S, cellesignalteknologi), kanin anti-LC3 (1:1000;L7543,Sigma-Aldrich),kanin anti-p62(1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Følgende antistoffer blev brugt til immunfluorescens: rotte anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), rotte anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), kanin anti-LC3 (1:1000) ;L7543, Sigma-Aldrich), kanin anti-p62 (1:500;23214, cellesignalteknologi), kanin anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), kanin anti-TMEM119(1) :100, ab209064,Abcam). Passende sekundære antistoffer blev købt fra Invitrogen.

Mus

Vildtype(WT) C57BL/6JOlaHsd-mus blev købt fra Envigo. Dyrene blev fodret med en almindelig kost og opstaldet i dyrefaciliteten på det biomedicinske forskningsinstitut ved Hasselt Universitet. Alle forsøg blev udført i henhold til institutionelle retningslinjer og blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg ved Hasselt Universitet.

Cellekultur

Knoglemarv-afledtmakrofager(BMDM'er) blev isoleret fra WT og Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd mus, købt fra Envigo og leveret af RIEN BRC i henhold til en MTA til henholdsvis Prof S. Kerdine-Römer [27,28]. BMDM'er blev opnået som beskrevet tidligere [29]. I korte tibiale og femorale knoglemarvsceller fra 12-ugegamle WT- og Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd-mus blev dyrket i 10-cm petri-plader i en koncentration på 10×106 celler/ plade, i RPMI1640-medium suppleret med 10 procent føtalt kalveserum (FCS, Gibco), 50 E/ml penicillin (Invitro-gen), 50 E/ml streptomyciner (Invitrogen) og 15 procent L929--konditioneret medium (LCM) ). Efter differentiering blev BMDM'er løsnet ved 37 grader med 10 mM EDTA i PBS (Gibco) og dyrket (0,5 × 10 grader celler/ml) i RPM1640 suppleret med 10 procent FCS, 50 U/ml penicillin, 50 U/ml streptomycin og 5 procent LCM ( 37 grader C,5 procent CO2). Mikroglia-kulturer blev isoleret fra hjerner fra postnatale P1-3 C57BL/6/OlaHsd-unger. Efter at hjernestammen, choroid plexus og meninges var blevet fjernet, blev hjernerne mekanisk dissocieret og enzymatisk fordøjet i 15 minutter med 1 x trypsin (Gibco) ved 37 grader. Bagefter blev cellesuspensionen udsået i DMEM, et medium med højt glukoseindhold (Sigma) suppleret med 30 procent LCM, 10 procent FCS, 50 U/ml penicillin og 50 U/ml streptomycin i T75-kulturkolber. To til 3 dage senere blev der udført en fuldstændig mediumændring. Blandede gliakulturer blev rystet (230 rpm, 3 timer, 37 grader) efter 6-7 dage for at opnå rene mikrogliakulturer.

RNA-sekventering

Celler blev forbehandlet med phloretin (50 μM) i 20 timer og LPS-stimuleret (100 ng/ml) i 6 timer. Cellelyse blev udført under anvendelse af Qiazol Lysis-reagens (Qiagen). RNA blev ekstraheret fra celler ved hjælp af RNeasy mini kit (Qiagen). Prøver blev derefter behandlet af Genomics Core Leuven (Belgien). Biblioteksforberedelse blev udført med Lexogen's QuantSeq kit for at generere Illumina-kompatible biblioteker. Biblioteker blev sekventeret på Illumina HiSeq4000 sekventeringssystemet. Splejsningsbevidst justering blev udført med STAR v2.6.1b[30]. Kvantificering af aflæsninger pr. gen blev udført med HT-seq Count v2.7.14. Optællingsbaseret differentiel ekspressionsanalyse blev udført med R-baseret (The R Foundation for Statistical Computing, Wien, Østrig) Bioconductor-pakke DESeq2. En liste over differentielt udtrykte gener blev udvalgt ved ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitativ revers transkription PCR

Celler blev forbehandlet med phloretin (50 μM) i 20 timer og LPS-stimuleret (100 ng/ml) i 6 timer. Lyse blev udført ved at bruge Qiazol Lysis reagens (Qiagen). RNA blev ekstraheret ved hjælp af RNeasy mini-kittet (Qiagen). RNA-koncentration og kvalitet blev bestemt med et Nano-drop spektrofotometer (Isogen Life Science). cDNA-syntese blev udført under anvendelse af Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) ifølge producentens instruktioner. qPCR blev udført på et StepOne-Plus" Real-Time PCR system (Applied Biosystems) ved hjælp af en SYBR grøn blanding indeholdende 1 × SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM primere (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA og nukleasefrit vand Den sammenlignende Ct-metode blev brugt til at kvantificere genekspression Data blev normaliseret til de mest stabile referencegener cyclin A og hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1. Primersekvenser er tilgængelige på anmodning.

Bestemmelse af reaktive oxygenarter

Celler blev forbehandlet med phloretin (50 uM) i 2 timer. Bagefter blev celler stimuleret med PMA (15 min, 100 ng/ml), og ROS-produktion blev målt ved hjælp af den fluorescerende probe 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat ved 10 μM i PBS i 30 min. Fluorescens blev målt under anvendelse af fluorescens FLUOstar optima mikropladelæser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) (excitation: 495 nm, emission: 529 nm).

Målinger af nitrogenoxid

Celler blev forbehandlet med phloretin (50 μM) i 2 timer. Bagefter blev celler stimuleret med LPS (24 timer, 100 ng/ml). NO blev indirekte overvåget ved hjælp af Griess-reagensnitritmålesættet (Abcam). Kort fortalt reagerer nitrat med sulfanilamid og N-(1-naphthyl)ethylen-diamin-dihydrochlorid til dannelse af et lyserødt azofarvestof. Absorbansen af ​​dette azoderivat blev derefter målt ved 540 nm under anvendelse af en mikropladelæser (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Celler blev behandlet med phloretin（5{{10}} μM） og LPS（100 ng/ml) i 1 time eller 24 timer for at bestemme AMPK-aktivering eller henholdsvis p62-, LC3- og Keapl-proteinniveauer. Celler blev lyseret under anvendelse af RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1 procent Triton X-100, 0,5 procent natriumdeoxycholat, 1 procent SDS, 50 mM Tris) og adskilt via natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese. Geler blev overført til en PVDF-membran (VWR), og blots blev blokeret i 1 time i 5 procent bovint serumalbumin i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1 procent Tween-20(TBS-T). Membraner blev probet med primære antistoffer natten over ved 4 "C, vasket med TBS-T og inkuberet med det tilsvarende sekundære peberrodsperoxidase-mærket antistof i 1 time ved stuetemperatur (RT). Immunoreaktive signaler blev påvist med forstærket kemiluminescens (ECL Plus, Thermo Fisher) under anvendelse af Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences). Densiteterne af båndene blev bestemt ved anvendelse af ImageJ.

Immunfluorescens

Kryosektioner af rygmarven blev lufttørret og fikseret i iskold acetone i 10 minutter ved - 20 grader. Muse-BMDM'er blev dyrket på dækglas og fikseret i iskold methanol i 10 minutter ved -20 grad. Sektioner og BMDM'er blev blokeret i 30 minutter under anvendelse af Dako proteinblok (Agi-lent). Bagefter blev de inkuberet natten over ved 4"C med primære antistoffer, vasket og inkuberet med de passende sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Billeder af rygmarvsvævet blev taget ved hjælp af et Nikon Eclipse 80i mikroskop (10× objektiv) og NIS Elements BR 3.10-software (Nikon). Billeder af BMDM'er farvet til p62, LC3 og Keapl blev taget ved hjælp af Zeiss LSM 880-konfokalmikroskopet og blev Airyscan-korrigeret (63× objektiv).P62-og LC3- positive puncta blev bestemt ved semi-automatiseret puncta analyse image J. Kort sagt, efter at billedet var gjort binært og cellerne blev udvalgt manuelt, blev puncta analyseret pr. celle. P62 og Keapl colocalization blev udført ved hjælp af en colocalization pipeline i CellProfiler softwaren [31 ]. Billederne vist på figurerne er digitalt forbedret.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeutisk opsætning). Mus blev vejet og scoret dagligt for neurologiske tegn på sygdommen i henhold til producentens EAE-scoringsguide for mus:0:ingen kliniske symptomer,0.5:halespidsen er slap, 1:slapp hale , 1.5: halt hale og bagben hæmning 2: slap hale og svaghed af bagben, 2.5: slap hale og slæbning af bagben, 3: slap hale og fuldstændig lammelse af bagbenene, 3.5: slap hale og fuldstændig lammelse af bagben ben og mus er ude af stand til at rette sig op, når de placeres på siden, 4: lammelse af mellemgulvet, 5: død af EAE.

Statistisk analyse

GraphPad Prism blev brugt til statistisk at analysere dataene, som er repræsenteret som middel±sem D'Agostino og Pear-son omnibus normalitetstest blev brugt til at teste for normal fordeling. To-halet uparret Students t-test (med Welchs korrektion om nødvendigt) blev brugt til normalfordelte data. Mann-Whitney analysen blev brugt til data, der ikke bestod normalitetstesten.p-værdier<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Resultater

Transkriptionelle ændringer forbundet med phloretinbehandling af makrofager

For at etablere potentielle antiinflammatoriske virkninger og identificere underliggende mekanismer for phloretinbehandling på makrofager, udførte vi bulk RNA-sekventering (supplerende Fig. 1). Pathway-analyse af aktiverede makrofager behandlet med phloretin viste, at differentielt udtrykte gener var overrepræsenteret i kanoniske veje relateret tilbetændelse, såsom iNOS(z-score:-2.449), toll-like receptor(z-score:-2.236), interferon-signalering (z-score:- 2), og akut fase responsvej (z-score:- 1.633)(fig. 1A, B). I lighed med kanonisk pathway-analyse forudsagde opstrømsanalyse af RNA-seq-dataene, at phloretin reducerede aktiveringen af ​​vigtige pro-inflammatoriske transkriptionsregulatorer såsom IRF7 (z-score:2.229), IRF1(z-score:-2. 025)og STAT1(z-score:-2.022)(fig. 1D). Udover at nedregulere makrofags pro-inflammatoriske veje, viste RNA-seq-analyse af phloretin-behandlede makrofager, at phloretin blandt andre veje kraftigt aktiverede Nrf2-vejen (z-score: 1,897), dokumenteret ved opregulering af Nrf2-associeret gener såsom mafG og proxy (fig. 1A, C). Endnu mere blev Nrf2(NFE2L2) identificeret som den mest aktiverede opstrøms transkriptionelle regulator (z-score: 2.801), og regulering af ROS-niveauer blev identificeret som en af ​​de mest opregulerede biologiske funktioner i phloretin-behandlede BMDM'er (z-score: 2.008 (Fig. 1D, E). Samlet viser resultaterne, at phloretin aktiverer Nrf2 og undertrykker den inflammatoriske fænotype af makrofager.

Nrf2-vejen kontrollerer fænotypen af ​​phloretin-behandlede makrofager

Dernæst validerede vi den antiinflammatoriske virkning af phloretin og bestemte, om det modulerer den inflammatoriske fænotype af makrofager ved at virke på Nrf2. Reducerede ROS-niveauer blev observeret i phloretin-behandlede WT BMDM'er stimuleret med PMA (fig. 2A). Desuden blev reduceret NO-produktion og mRNA-niveauer af pro-inflammatoriske gener NOS2, I-6, COX2 og I-12 observeret i phloretinbehandlede WT BMDM'er stimuleret med LPS (fig. 2B, C). i forhold til Nrf2's afgørende rolle i at inducere en mindre inflammatorisk fænotype, viser vores data, at phloretin aktiverer Nrf2-responsgener HO1 og NQO1 i WT, men ikke Nrf2 KO BMDM'er stimuleret med LPS (fig. 2D). Endvidere reducerede phloretinbehandling ROS-produktion i WT, men ikke i Nrf2 KO BMDM'er (fig. 2E). Bortset fra at kontrollere antioxidative responser, er Nrf2 rapporteret at undertrykke den inflammatoriske fænotype af makrofager [12]. Til støtte for sidstnævnte var phloretin ikke i stand til at reducere ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske gener NOS2, IL-6, COX2 og IL-12 i aktiverede Nrf2-deficiente BMDM'er (fig. 2F). Alt i alt indikerer disse resultater, at Nrf2 driver det phloretin-medierede inflammatoriske fænotypeskift af makrofager.

Phloretin fremmer AMPK-aktivering

Phloretin er en veldefineret GLUT-hæmmer, og nyere undersøgelser fremhæver vigtigheden af ​​GLUT-medieret glukoseoptagelse for makrofagaktivering [26,32]. Derfor bestemte vi, om phloretin kunne aktivere energisensoren AMPK, som aktiveres ved lave energi-/glukoseniveauer. Vores resultater viser, at phloretinbehandling fører til AMPK-phosphorylering og aktivering (fig. 3A, B). Desuden forhindrer tilføjelsen af ​​AMPK-hæmmeren BML-275 stort set AMPK-aktivering i phloretin-behandlede BMDM'er (fig. 3A, B). Endnu mere viser vores resultater, at AMPK-aktivering er afgørende for, at phloretin kan undertrykke ROS-produktion, som vist ved højere ROS-niveauer i BMDM'er behandlet med både phloretin og AMPK-hæmmer sammenlignet med BMDM'er behandlet med phloretin alene (fig. 3C). I alt tyder vores data på, at phloretin-induceret AMPK-aktivering er afgørende for at drive makrofager mod en mindre inflammatorisk fænotype.

Phloretin stimulerer autofagi på en AMPK-afhængig måde

Da AMPK-aktivering er relateret til aktiveringen af ​​kataboliske processer som reaktion på næringsstofmangel [33], undersøgte vi derefter, om phloretin kan aktivere autofagi. Autofagi er en bevaret katabolisk proces, der induceres ved sult og andre stressreaktioner, som fremmer den lysosomale nedbrydning af intracellulær last sekvestreret i vesikler kaldet autophagosomer. RNA-seq-analyse forudsagde autofagi som en af ​​de nedstrøms biologiske processer, der viste øget aktivitet i phloretin-behandlede BMDM'er (z-score: 0.779) (fig. 4A). Ydermere viste immunocytokemisk analyse af BMDM'er behandlet med phloretin og autofagihæmmeren bafilomycin Al øget akkumulering af autofagimarkørerne MAP1LC3/LC3 (mikrotubuli-associeret protein 1 let kæde 3) og p62 sammenlignet med bafilomycin A1-behandlet BMDM'er (FigDM'er). 4B-D), hvilket indikerer øget autofagisk flux ved phloretinbehandling [34]. Ved induktion af autofagi omdannes LC3 fra LC3I-formen til den lipiderede LC3I-form, hvilket korrelerer med antallet af autophagosomer. I overensstemmelse med dette blev højere proteinniveauer af LC3II og p62 bestemt i phloretin-stimulerede BMDM'er ved western blot (fig. 4E, F). Interessant nok blev denne stigning i p62 og LC3II af phloretin forhindret ved at behandle BMDM'er med AMPK-hæmmeren BML-275(Fig.4E-F). Samlet viser vores data, at phloretin stimulerer autofagi på en AMPK-afhængig måde.

Phloretin aktiverer Nrf2-vejen gennem autofagi-medieret Keap1-nedbrydning

Vores data viser, at phloretin aktiverer Nrf2 og stimulerer autofagi i makrofager. Interessant nok kan autophagy-receptoren p62 konkurrere med Nrf2 om binding til Keapl, adapteren, der letter Nrf2 ubiquitinering og nedbrydning under normale forhold. Denne p62-medierede dissociation af Keap1/Nrf2 vil derfor forhindre Nrf2-nedbrydning og i sidste ende føre til Nrf2-aktivering [35]. Af denne grund bestemte vi, om phloretin fremmer p62/Keapl-interaktion og derved aktiverer Nrf2-vejen. Her viser vi, at phloretin aktiverer Nrf2-vejen gennem p62-medieret Keapl-nedbrydning i makrofager. Ved at bruge højopløsnings Airyscan konfokalmikroskopi kombineret med kolokaliseringsanalyse viser vi, at phloretin stimulerer interaktionen mellem p62 og Keapl, som vist ved en øget værdi af kolokaliseringsparameteren (Pearsons koefficient) i phloretinbehandlede BMDM'er (fig. 5A) , B). Desuden viser vores resultater, at lavere proteinniveauer af Keapl er til stede i phloretin-behandlede BMDM'er, hvilket bekræfter nedbrydning af Keapl (fig. 5C). For at bekræfte, at nedbrydningen er autofagi-afhængig, tilføjede vi autofagi-hæmmeren bafilomycin A1 til phloretin-behandlet BMDM'er. Interessant nok blev denne reduktion i Keapl vendt ved behandling med bafilomycin Al (fig. 5C). Disse resultater blev bekræftet ved western blot, der viser en reduktion i Keapl-proteinniveauer i phloretinbehandlede BMDM'er, som blev forhindret af bafilomycin A1 (fig. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), reducerede phloretin sygdommens sværhedsgrad (fig. 6B). Reduceret sygdomssværhedsgrad i phloretin-behandlede dyr var parallelt med en nedsat ekspression af inflammatoriske gener MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 og CXCL2 i rygmarven (fig. 6C). Desuden blev der fundet en reduceret mængde af F4/80t-celler i rygmarven hos phloretin-behandlede dyr (fig. 6E, F). Da både F4/80*microglia og F4/80* makrofager bidrager til neuroinflammation, illustrerede mere dybdegående analyser, at phloretin markant reducerede mængden af ​​F480 plus TMEMl19-

makrofager i EAE-mus (supplerende Fig. 2 DF), mens en ikke-signifikant tendens blev observeret i retning af en reduktion i F480 plus TMEMl19 plus mikroglia. I overensstemmelse med dette fund undertrykte phloretin produktionen af ​​inflammatoriske mediatorer i mikroglia, men denne suppression var mindre udtalt sammenlignet med makrofager (supplerende Fig. 2 AC). Disse resultater tyder på, at EAE-forbedring af phloretin hovedsageligt er makrofag-drevet. Ud over at reducere ekspressionen af ​​inflammatoriske gener øgede phloretin ekspressionen af ​​antiinflammatoriske og neurotrofiske faktorer, dvs. IL-4, CNTF og IGF-1 i rygmarven hos EAE-dyr (fig. 6D) ). Disse resultater tyder stærkt på, at phloretin reducerer sværhedsgraden af ​​EAE-sygdomme ved at drive makrofager i retning af en sygdomsopløsende fænotype. I overensstemmelse med vores tidligere in vitro-fund påviste vi også forhøjet Nrf2-signalering i CNS af phloretin-behandlede EAE-dyr som angivet ved øget mRNA-ekspression af Nrf2 og dets nedstrøms mål NQO1 og GPX1 (fig. 6G). Alt i alt viser disse data, at phloretin undertrykker neuroinflammation i både en profylaktisk og terapeutisk indstilling. Desuden indikerer vores resultater, at phloretin kan reducere neuroinflammation ved at undertrykke de inflammatoriske egenskaber ved makrofager gennem Nrf2-aktivering.

Diskussion

I denne undersøgelse demonstrerer vi, at phloretin driver makrofager mod en mindre inflammatorisk fænotype på en Nrf2-afhængig måde. AMPK-afhængig aktivering af autofagi og efterfølgende Keapl-nedbrydning blev fundet at ligge til grund for Nrf2-aktivering af phloretin. Desuden bekræfter vi de antiinflammatoriske virkninger af phloretin i en EAE-model, hvor det nedsætter sygdommens sværhedsgrad og lindrer makrofagafhængigeneuroinflammation.

Vi viser, at phloretin undertrykker den inflammatoriske fænotype af makrofager. Dette er i overensstemmelse med resultaterne af Wei-Tien Chang et al. som viste, at phloretin har anti-inflammatoriske egenskaber i en makrofagcellelinje [36]. Vi demonstrerer, at induktionen af ​​dette fænotypeskift er afhængig af Nrf2. Nrf2 er en mesterregulator af antioxidative responser, og dets aktivering er kendt for at drive makrofager hen imod en antiinflammatorisk fænotype [1l, 12, 37]. Derudover definerede adskillige undersøgelser, at Nrf2-aktivering dæmper neuroinflammation og neurodegeneration i CNS-lidelser [{{10 }}]. Selvom vores resultater viser, at Nrf2 ligger til grund for fænotypeskiftet af phloretin-behandlede makrofager, illustrerede RNA-sekventeringsdata, at blandt Nrf2-aktivering blev andre veje opreguleret. Især opreguleringen af ​​PPAR-vejen er af interesse på grund af dens anti-inflammatoriske egenskaber og krydstale med Nrf2 [41-45]. Derudover, da phloretin er en veldefineret GLUT-hæmmer, og skift til glykolyse er en afgørende metabolisk begivenhed for makrofagaktivering, kan fænotypeændringer også delvis induceres af direkte metaboliske virkninger af phloretin på disse glukosetransportører [46,47]. Mere forskning er berettiget for at definere relevansen af ​​PPAR i phloretin-induceret Nrf2-aktivering, og i hvilken grad phloretin-induceret immunmodulering er påvirket af direkte metaboliske ændringer. Samlet set viser vores resultater klart, at Nrf2-aktivering spiller en væsentlig rolle i den phloretin-medierede fænotype-switch.

Vores resultater indikerer, at Nrf2-aktivering af phloretin er medieret af AMPK-aktivering. AMPK spiller en afgørende rolle i at genoprette cellulær energihomeostase i tilfælde af stress, der nedbryder ATP, hvilket resulterer i øget ADP: ATP-forhold, hvorved der skiftes til alternative kataboliske veje, der genererer ATP, mens anabolske veje, der forbruger ATP, slukkes [48]. Tilsvarende er phloretin en veletableret GLUT-hæmmer og sænker cellulære glucoseniveauer [49-51]. Adskillige undersøgelser viste, at AMPK-aktivering i makrofager inducerer en immunsuppressiv fænotype, hvilket bekræfter vores resultater, der viser, at AMPK-aktivering er afgørende for, at phloretin kan sænke inflammation[52,53]. Vores data er også i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, hvor phloretin er blevet påvist at aktivere AMPK i andre celletyper, herunder adipocytter og endotelceller [50, 54-56]. Phloretin kan aktivere AMPK indirekte ved at øge AMP og sænke ATP-niveauer, da AMP og ATP henholdsvis allosterisk stimulerer eller hæmmer AMPK-aktivering [48, 57]. Ikke desto mindre kan CaMKK, som er en kinase opstrøms for AMPK, fremme AMPK-aktivering som reaktion på øgede cellulære Ca2 plus-niveauer uden nogen ændring i AMP/ATP-niveauer [58]. I betragtning af det brede netværk af samspillet mellem AMPK og op- og nedstrømsveje er der desuden behov for yderligere forskning for at belyse den underliggende mekanisme for phloretin-induceret AMPK-aktivering.

Vores data tyder på, at phloretin-medieret AMPK-aktivering stimulerer autofagi i makrofager. Som nævnt ovenfor er AMPK-aktivering en selvbeskyttende proces, der har til formål at genoprette cellens energibalance [48]. Selvom ingen undersøgelse nogensinde har vist, at phloretin var i stand til at stimulere fænotypen af ​​makrofager ved at fremme autofagi, har nogle undersøgelser ikke desto mindre vist en effekt af phloretin på autofagiveje i cancerceller og hepatocytter [59-61]. Desuden viser forskellige undersøgelser, at nedstrøms kataboliske processer af AMPK-aktivering kan aktivere autofagi [60, 62, 63]. Interessant nok induceres AMPK-medieret autofagi som reaktion på glukosesult ved phosphorylering af den vigtige autophagy-initiator unc-51 som autofagiaktiverende kinase [64,65]. Med hensyn til dette spekulerer vi på, at AMPK stimulerer autofagi til at genoprette ATP fra cellulære komponenter som svar på phloretin-induceret glukoseudtømning. Glukosesult kan dog også aktivere autofagi på en AMPK-uafhængig måde [66-68]. Derfor er mere forskning nødvendig for at afgøre, om autofagi-aktivering af phloretin også forekommer delvist uafhængigt af AMPK.

Nylige undersøgelser viste vigtigheden af ​​autofagi til at drive den funktionelle makrofagfænotype. I denne sammenhæng er dysregulering af autofagi i makrofager især blevet forbundet med begyndelsen af ​​aterosklerose og neurologiske sygdomme [69-72]. Her giver vi et link mellem phloretinbehandling, autofagi-induktion og Nrf2-aktivering ved at vise, at phloretin fremmer Nrf2-aktivering via p62-medieret nedbrydning af Keap1. Indtil for nylig blev en stigning i p62 puncta betragtet som et tegn på nedsat autofagi, da p62 nedbrydes i autofagosomer ved aktivering af autofagi [34]. I forhold til dette er p62-akkumulering blevet forbundet med autofagisk dysfunktion i aterosklerotiske læsioner [73]. Denne opfattelse er dog blevet udfordret i de senere år, og det menes nu, at p62 er nødvendigt for dannelsen af ​​autophagosomer, og at en stigning i p62-niveauer parallelt med en stigning i LC3Il puncta kan være et tegn på autofagi-induktion [74]. Derfor tyder vores resultater sammen med phloretins evne til at aktivere AMPK og dets kendte rolle i autofagi-aktivering, at P62- og LC3-akkumuleringen ved bafilomycin A1-behandling i phloretin-stimulerede makrofager skyldes øget autofagisk flux og ikke på grund af svækket autofagi. Interessant nok, Lee Y et al. viste for nylig, at udover at aktivere Nrf2, er p62-binding til Keapl også involveret i autophagosomdannelse, hvilket tyder på, at phloretin-medieret autophagy-aktivering er direkte forbundet med øget p62-aktivitet på den ene side, men også til mere Keapl-p62-interaktion på den anden side [ 75]. Keapl er en adapter af Cullin-3-baseret ubiquitinligase, der danner en homodimer med Nrf2 ved homøostatiske forhold, og derved fremmer Nrf2 ubiquitinering og proteasomal nedbrydning [76]. Afbrydelse af Keapl-Nrf2-komplekset fører til Nrf2-stabilisering og translokation til kernen [77, 78]. Det er veldokumenteret, at afbrydelse af dette kompleks sker via enten modifikation af Keapl-cysteinrester med elektrofile molekyler, direkte interaktion af små molekyler med Keapl eller p62-medieret Keapl-nedbrydning [35]. Ying Y et al. foreslår en direkte interaktion mellem phloretin og Keapl baseret på silico-eksperimenter, som derefter fører til aktivering af Nrf2-vejen i en kardiomyocytcellelinje [79]. Her etablerede vi en yderligere autofagi-relateret mekanisme, hvorved phloretin aktiverer Nrf2.

Ved at bruge EAE-modellen konstaterede vi, at phloretin lindrer neuroinflammation in vivo. Vores data tyder stærkt på, at phloretin forbedrer EAE ved at undertrykke det inflammatoriske respons medieret af makrofager og aktivere Nrf2-vejen. I andre sygdomsmodeller blev phloretin også rapporteret at udøve neurobeskyttende og immunmodulerende egenskaber. Phloretin viste sig især at aktivere Nrf2-vejen i hjernen ved cerebral iskæmi og mindske amyloid beta-akkumulering i Alzheimers sygdomsmodellen for rotter [80-84]. Phloretin kan også påvirke andre immunceller in vivo, da denne forbindelse har vist sig at hæmme T-celle- og dendritiske celleaktivering in vitro [85, 86]. I betragtning af at neuroinflammation i EAE-modellen ikke er rent makrofagafhængig, ville det være af interesse at definere, i hvilket omfang reduktionen i neuroinflammation medieres af andre immunceller. Med hensyn til dette, selvom vores data tyder på, at EAE-forbedring hovedsageligt er makrofager drevet og er mindre afhængig af mikroglia-modulation, er yderligere eksperimenter nødvendige for at belyse, i hvilket omfang phloretin påvirker mikroglia i neuroinflammatoriske sygdomme. Samlet set viser vores resultater, at phloretin reducerer neuroinflammation ved at påvirke fænotypen af ​​makrofager, hvilket viser det terapeutiske potentiale af phloretin til neuroinflammatoriske lidelser.

Konklusioner

Vores undersøgelse viser, at phloretin er et potent immunmodulerende middel, der modulerer de inflammatoriske egenskaber af makrofager i neuroinflammatoriske lidelser. Aktivering af Nrf2-vejen, medieret af AMPK-afhængig autophagy-aktivering og efterfølgende Keapl-nedbrydning, blev etableret for at drive dette fænotypeskifte. Derfor er phloretin et lovende naturligt forekommende middel, der kan bruges til at sænke den inflammatoriske byrde af neuroinflammatoriske sygdomme som MS.

Referencer

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et al. Dihydromyricetin forbedrer skumcelledannelse via LXRalpha-ABCA1/ABCG1-afhængig kolesteroludstrømning i makrofager. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, et al. Anthocyaniner inducerer kolesteroludstrømning fra peritoneale musemakrofager: rollen af ​​den peroxisomproliferatoraktiverede receptor {gamma}-lever X-receptor {alfa}-ABCA1-vejen. J Biol Chem. 2005;280(44):36792-801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Quercetin øger ABCA1-ekspression og kolesteroludstrømning gennem ap38-afhængig vej i makrofager. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fysiologien af ​​skummende fagocytter i multipel sklerose. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Makrofager undergrupper og mikroglia i multipel sklerose. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191-213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Multipel sklerose: mekanismer og immunterapi. Neuron. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Stearoyl-CoA-desaturase-1 forringer de reparative egenskaber af makrofager og mikroglia i hjernen. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Myelin-fagocytoserende makrofager modulerer autoreaktiv T-celleproliferation. J Neuroinflammation. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Myelin-afledte lipider modulerer makrofagaktivitet ved aktivering af lever X-receptor. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Myelin ændrer den inflammatoriske fænotype af makrofager ved at aktivere PPAR'er. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.