Phenylethanol Glycosider fra Cistanche Tubulosa undertrykker leverstellatcelleaktivering og blokerer ledningen af signalveje i TGF-01/smad som potentielle antihepatiske fibrosemidler
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang og Tao Liu
Abstrakt: Cistanche tubulosaer en traditionel kinesisk urtemedicin, der i vid udstrækning anvendes til at regulere immunitet ogphenylethanoid glycosider(CPhG'er) er blandt de primære komponenter, der er ansvarlige for denne aktivitet. Tidligere undersøgelser har indikeret de forebyggende og terapeutiske virkninger af CPhG'er på bovint serumalbumin (BSA)-induceret hepatisk fibrose hos rotter. Formålet med undersøgelsen var at evaluere den antihepatiske fibrose-effekt af CPhG'er og monomererneechinacosideogakteosidved at hæmme hepatisk stellate celle (HSC) aktivering, blokere ledningen af signalveje i transformerende vækstfaktor-p1 (TGF-p1)/smad, og bestemme, at de er in vitro hepatobeskyttende aktivitet. HSC-proliferation blev tydeligvis hæmmet efter behandling med CPhG'er (100,50 ^g/ml)/echinacosid (500.250.125 ^g/mL)/acteosid (6, 3 ^g/mL), med IC50-værdier på 119.125.520.399 g/ mL i MTT-assayet. Forskellige koncentrationer af CPhG'er/echinacoside/akteosidpåvirkede ikke den cellulære toksicitet på HSC ifølge målinger af laktatdehydrogenase (LDH). Forskellige koncentrationer af CPhG'er/echinacoside/akteosidøgede mRNA-niveauet og proteinekspressionen af smad7 og reducerede mRNA-niveauerne af smad2, smad3 og proteinekspressionen af smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) i HSC. Sammenfattende viser disse resultater, at CPhGs/echinacoside/akteosidkan blokere ledningen af signalvejene i TGF-p1/smad og hæmme aktiveringen af HSC, hvilket tyder på, atC. tubulosakan således være et potentielt naturlægemiddel til behandling af leverfibrose.
Nøgleord: Cistanche tubulosa; phenylethanolglycosider fraCistanche(CPHG'er);echinacoside; akteosid; hepatiske stellatceller (HSC); TGF-p1/smad
1. Introduktion
bliver proliferative og fibrogene, akkumulerer efterfølgende ECM og differentierer i sidste ende til fibrogene myofibroblast-lignende celler. Transformerende vækstfaktor-.1 (TGF-p 1) anses for at være den vigtigste profibrogene mediator. Signalvejen relateret til TGF-&1 er en vigtig mekanisme for hepatisk fibrose, og den inkluderer hovedsageligt smad-afhængig og smad-uafhængig signalering, og den smad-afhængige signaltransduktionsvej menes at være en hovedkanal for TGF-p1-signalering . Derfor kan blokade af TGF-p1/smad-signalvejen undertrykke kollagenproduktion og i sidste ende lindre hepatisk fibrose, hvilket har gjort denne vej til et vigtigt mål i anti-hepatisk fibrose-lægemiddelforskning i de senere år.
På trods af den høje verdensomspændende forekomst af hepatisk fibrose er der ingen almindeligt accepteret antifibrogen behandling tilgængelig [2-4]. Traditionelle kinesiske urtemedicin (TCHM'er) er af stor interesse til behandling af leversygdomme, fordi nogle kan bruges terapeutiske lægemidler til behandling og forebyggelse af leverfibrose. I øjeblikket er mange undersøgelser fokuseret på potentielle anti-fibrogene lægemidler, der har været brugt som TCHM'er i tusinder af år [5].
Cistanche tubulosa W (familien Orobanchaceae)fa parasitplante, dyrkes i vid udstrækning i den sydlige region Xinjiang i Kina [6]. Folk bruger det til at styrke nyrerne, nære blodet, slappe af tarmene og forsinke ældning uden bivirkninger, og er officielt opført i den kinesiske farmakopé [7]. C. tubulosa indeholder en række aktive komponenter, herunder phenylethanoidglycosider (CPhG'er), iridoider og polysaccharider. Blandt de mange aktive komponenter i C. tubulous er CPhG'erne, som præsenterer en række bioaktiviteter (antioxidant, anti-træthed, radioresistens osv.) Pie vigtigste karakteristiske komponenter af denne plante. I de senere år er det rapporteret, at CPhG'er har overskydende Hent-hepatobeskyttende virkninger og kan opfange træradikaler, beskytte levermembraner og udvise immunregulerende virkninger, hæmning af apoptose, hæmning af ekspressionen af hepatitis B overfladeantigen (HBs Ag) og hepatitis B e antigen (HBeAg) og hepatitis B-virus (HBV) DNA-replikationsaktivitet osv. HBV DNA-niveau er det mest pålidelige indeks, der direkte afspejler den virale replikationsaktivitet, som er nøglefaktoren til at bestemme den naturlige historie af kroniske HBV-infektioner, monitorering af effekten af oP antiviral behandling og vurdering af prognosen for akutte og kroniske HBV-infektioner. De serologiske detektionsindekser for HBV omfatter hovedsageligt HBsAg, HBeAg osv. [8-11]. Der er dog få litteraturrapporter om de antihepatiske fibrosevirkninger af CPhG'er. Tidligere undersøgelser har indikeret de forebyggende og terapeutiske virkninger af CPhG'er på bovint serumalbumin (BSA)-induceret hepatisk fibrose hos rotter, men den antifibrogene aktivitet af CPhG'er og dets vigtigste monomerer (echinacosid og acteosid, figur 1) er aldrig blevet evalueret in vitro.
økologisk Cistanche tubulosa
2. Resultater
2.1. Kvantitativ bestemmelse af CPhG'er
CPhG'er indC. tubulosaindeholder IT-to phenylethylalkoholglycosider: echinacosid og acteoside, og deres indhold i CPhG'erne blev ved HPLC-analyse (figur 1) detekteret til at være 42,71 procent 土 0,42 procent og 14,27 procent 土 0.18 procent henholdsvis.
2.2. Hæmmende aktiviteter af CPhG'er, Echinacoside og Acteosid på HSC-T6
CPhG'er, echinacosid og acteosid (62.5-500 卩g/mL) hæmmede cellelevedygtigheden af HSC på en koncentrationsafhængig måde. CPhG'er og acteosid viste en bemærkelsesværdig hæmmende aktivitet på HSC-celler, med 50 procent hæmning af cellevækstaktivitet (IC50) værdier var henholdsvis 119.125 昭/ml og 6.999 昭/ml. Echinacosid udviste moderat hæmmende aktivitet (IC50,520,345 昭/ml; tabel 1 og figur 2).
2.3. Celletoksicitet af CPhG'er, Echin acoside og Acteorida på HSC
Lactatdehydrogenase (LDH), et stabilt cytoplasmatisk enzym, der er til stede i alle celler, frigives hurtigt til cellekultursupernatanten ved plasmamembranbeskadigelse. Enzymaktivitet i kultursupernatanten korrelerer med andelen af lyserede celfs [12]. Som vist i tabel 2, når de blev behandlet med forskellige: koncentrationer af C PhG'er, echinacosid og acteosid, selvom LDH aktivitet viste en lille stigning sammenlignet med celle coirtrol gruppen, var forskellen ikke statistisk signifikant (p > 0.05 ), hvilket indikerer, at de fleste af cellemembranerne bibeholdt deres integritet, og inhiberingen af CPhG'er, echinacosid og acteosid på HSC skyldes ikke uspecifik cellulær toksicitet.
2.4. Effekt af CPhG'er, Echinacoside og Acteosde på HSC-proliferation induceret af TGF-^i
Proliferation, aktivering og differentiering af HSC reguleres af en række faktorer. Blandt de forskellige faktorer, der er involveret i leverfibrose, anses TGF {0}} for at være den vigtigste, da det kan aktivere HSC, fremme myofibroblastdifferentiering, øge ECM-syntese og hæmme ECM-nedbrydning og frigive kemokiner og cytokiner involveret i leverfibrose [13]. I dette studie, bortset fra kontrolgruppen, blev stationære HSC'er stimuleret med TGF-P1 in vitro for at simulere dannelsen af tidlig leverfibrose og for at undersøge effekten af CPhG'er, echinacosid og acteosid på TGF-p1- induceret HSC-proliferation. Som vist i tabel 3, sammenlignet med kontrolgruppen, fremmede TGF-61-gruppen signifikant spredningen af HSC (p < 0.01).="" sammenlignet="" med="" tgf-p1-gruppen,="" tgf-p1="" plus="" cphg'er="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" plus="" echinacosid="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" plus="" akteosid="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" µg/ml,="" p="">< 0,05)="" hæmmede="" alle="" bemærkelsesværdigt="" spredningen="" af="" hsc'er="" induceret="" af="" tgf-|3="" 1="" i="" forskellige="">
2.5. Udtryk af smad2)smad3 og smad7 mRNA efter CPhG'er, ochmacoside og acteaside intervention på HSC'er
Smad3 og smad2 er vigtige downstream-effektorer af TTGF-p-signalvejen [14,15], og smad7 er en hæmmer af smad-signalering. Teoretisk set kan den øgede ekspression af smad7 eller nedsat ekspression af smad2/smad3 blokere ledningen af signalveje i TGF-p 1/smad. Som vist i figur 3 viste kvantitafiv PCR-analyse i realtid, at mRNA-ekspressionen af smad2 og smad3 indikerede et lavere niveau, mens smad7 indikerede højere niveauer i kontrolgruppen sammenlignet med TGF-|31-gruppen. I gruppen TC (25, 50, 75,100 |dg/mL) er mRNA-niveauet for smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" og="" smad3="" (p="">< 0,01)="" var="" signifikant="" reduceret="" sammenlignet="" med="" tgf-pf-gruppen="" og="" lignede="" endda="" kontrolgruppen;="" i="" mellemtiden="" var="" mrna-niveauet="" af="" smad7="" signifikant="" øget="" i="" tc-gruppen="" (50,="" 75.100="" 卩g/ml)="" (henholdsvis="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01).="" imidlertid;="" smad7-ekspressionen="" indikerede="" en="" stigende="" tendens="" i="" tc="" 25="" 卩g/ml-gruppen="" sammenlignet="" med="" tgf-p1-gruppen="" (figur="">
I mellemtiden, sammenlignet med TGF-p1-gruppen, var ekspression af smad2 og smad3 mRNA signifikant faldet i TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /ml)-gruppen (p < 0.01),="" og="" udtryk="" for="" smad7-mrna="" var="" signifikant="" øget="" i="" te-gruppen="" (125,="" 250.500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (figur="" 4)="" .="" tilsvarende="" viste="" ta-gruppen="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" også="" den="" samme="" tendens="" (figur="">
2.6. Indflydelse af CPhG'er, Echinacoside og Ac)eosider på T GF-^i/smad signalvej i HSC
TGF-p 1/smad signalvejen afhænger af smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) og smad7, hvor p-smad2, p-smad3 er de aktiverede former for smad2 og smad3. I denne undersøgelse blev proteinniveauerne af omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 og smad7 analyseret. Western blot-analyse påviste stigninger i smad2-, smad3-, p-smad2-, p-smad3-niveauerne af TGF-p1 og inhiberingen af disse stigninger med CPhG'er, ec hinacoside og acteosid; i mellemtiden afslørede wesiern blot-analyse opregulerede smad7-niveauer af CPhG'er, echinacosid og acteosid. (Figur 6-8).
Som vist i figur 6, sammenlignet med c on2rol-gruppen (proteinekspressionerne af smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 var signifikant øget, og smad7-proteinekspressionen var reduceret i TGF-p1-gruppen. I TC (25 , 50, 75, 100 昭/ml) lægemiddelgrupper, smad/ (figur 6A), p-smad2 (figur 6B), smad 3 (figur 6C), p -smad3 (Figur 6D) ekspressioner var signifikant lavere end i TGF-p1-gruppen (卩 < 0,01), og smad7 (Figur 6E)-proteinekspression var højere end TGF-S1-gruppens (p < 0,01) (Figur 6).
Samtidig blev udtrykkene ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 og smad7 protein målt efter echinacosid og acteosid intervention på HSC. Som vist i figur 7 og 8 var smad2-, smad3-, p-smad2- og p-smad3-proteinekspressionsniveauerne signifikant hæmmet (p < 0.05="" eller="" p="">< 0.01="" ),="" var="" smad7-proteinekspressionsniveauet="" forhøjet="" (p="">< 0,01)="" sammenlignet="" med="" tgf-p="" 1-gruppen="" (figur="" 7="" og="">
3. Diskussion
Leverfibrose er en af de førende årsager til morbiditet og dødelighed på verdensplan, men meget begrænsede terapeutiske muligheder er i øjeblikket tilgængelige for denne tilstand, derfor er det meget vigtigt for os at søge potentielle mål for terapeutisk intervention for at forhindre udviklingen af leverfibrose [ 16]. For nylig har forskere fundet ud af, at forskellige naturlægemidler har hepatobeskyttende af anti-fibrotiske virkninger. Mange TCHM'er såsom Fufang Biejia Ruangan piller [17] og Xiao-chai-hu afkog (shosaiko til i Japan) [18,19] er blevet meget brugt til at behandle leverfibrose i Kina, Korea og Japan i tusinder af år. C. tubulosa indeholder en række aktive komponenter, herunder CPhG'er, iridoider og polysaccharider. Som en af de effektive materialebaser af C. tubulosa har CPhG'er fremragende hepatobeskyttende aktivitet, men der er begrænset information om de anti-fibrotiske virkninger af GPhC'er og dets relaterede forbindelser. I denne undersøgelse undersøgte vi, hvordan CPhG'er, echinacosid og acteosid undertrykker HSC-aktivering og blokerer signalvejsføringen i TGF-p1/snaad som potentielle anti-hep a tic fibrose-midler in vitro.
Leverskade af enhver ætiologi vil i sidste ende føre til aktivering af HSC'er, som undergår transdifferentiering til fibrogene myofibroblast-lignende celler [20]. Det vil sige, at myofibroblaster
er afledt af aktivering og proliferation af HSCs [21], og det betragtes som mediator af hepatisk fibrosedannelse. Af denne grund udførte vi in vitro-undersøgelser for at sammenligne cellelevedygtighedsraterne for HSC'er udsat for CPhG'er, echinacosid og acteosid. Resultaterne viste, at den hæmmende virkning af acteosid på HSC var den stærkeste, og effekten af CPhG'er var bedre end effekten af echinacosid. CPhG'er, echinacosid og acteosid-medicinerede sera inhiberede alle HSC-proliferation på en dosisafhængig måde.
LDH er et cytoplasmatisk enzym i levende celler, og det kan ikke trænge ind i cellemembranen under normale omstændigheder. Når celler beskadiges, øges membranpermeabiliteten, og LDH frigives til cellens ydre. Normalt kan LDH detektere graden af celleskade [{{0}}]. Undersøgelsen viste, at LDH-aktiviteten af CPhG'er, echinacosid og acteosid-medicineret serum kun viste en lille stigning sammenlignet med cellekontrolgruppen, og forskellen var ikke statistisk signifikant (p > 0,05), hvilket indikerer, at det meste af cellemembranen bevarede deres integritet. , og inhibering af HSC'er med CPhG'er, skyldes echinacosid og acteosid ikke uspecifik cellulær toksicitet.
Når der opstår leverskade, kan aktiverede hepatocytter frigive TGF-pi, der igen aktiverer HSC-T6, derfor har TGF-pi et tæt forhold til fibrose [25-27]. I denne undersøgelse kunne CPhG'er, echinacosid og acteosid betragtes som en attraktiv terapeutisk strategi til inhibering af HSC-proliferation efter at HSC'er blev stimuleret med wTGF-pi in vitro. Vi spekulerer i, at CPhG'er, echinacosid og acteosid kan bruges som en slags behandling og/eller forebyggelse af leverfibrose og hæmmer dannelsen af tidlig leverfibrose. Dannelsen af hepatisk fibrose er en kompleks proces med multifaktor- og multicelle-involvering. I denne patologiske proces udgør celle-celle, celle-cytokiner og celle-matrix-interaktioner et besværligt netværk. I dette netværk kan udviklingen af hepatisk fibrose reguleres af forskellige signalveje og midler. TGF-pi er en klassisk aktivator af HSC og en nøglemediator i patogenesen af leverfibrose [28]. CPhG'er, echinacosid og acteosid kan hæmme ekspressionen af TGF-pi/smad pathway-relateret mRNA og proteiner i HSC'er.
TGF-pi udøver sine cellulære virkninger via smad-signalvejen, og det er blevet betragtet som en nøglemediator i udviklingen af leverfibrose og inflammation. Efter binding af TGF-pi til TGF-p-type II-receptoren phosphorylerer type II-receptorkinasen GS-domænet af TGF-p-type I-receptoren, hvilket fører til aktivering af type I-receptoren [29]. Via virkningen af p-smad2 og p-smad3 ved to serinrester i SSXS-motivet af deres C-terminal, aktiveres reaktioner nedstrøms for smad-signalvejen ved aktivering af type I-receptor [30]. P-smad2 og p-smad3 danner oligomere komplekser med smad4, går derefter ind i kernen og udøver deres biologiske transkriptionsaktivitet. Smad-proteiner overfører således signaler direkte fra receptorkinasen til kernen [3i]. På den anden side er smad7 fast kombineret med TGF-pi-receptor, hvilket fører til manglende evne til at aktivere smad 2/3 såvel som hæmning af signaltransduktionsvejene [32]. Smad7 kan virke til at hæmme p-smad2 og p-smad3, nuklear translokation af aktiverede smad-komplekser og aktivering af (CAGA) (9)-MLP-Luc, hvilket resulterer i nedsat kollagen I-ekspression og fuldstændig inhibering af TGF-p-signaltransduktion [33,34]. Vores resultater viste, at CPhG'er, echinacosid og acteosid kan reducere smad2- og smad3-mRNA-ekspressioner og øge smad7-mRNA-ekspression; hæmmer smad2-, p-smad2-, smad3- og p-smad3-proteinekspressioner og opregulerer smad7-proteinekspression, hvilket tyder på, at CPhG'er, echinacosid og acteosid også spiller en rolle i at hæmme HSC-aktivering og dermed hæmme leverfibrose, hvilket fremhæver et potentielt anti-fibrotisk middel. mekanisme.
Sekvensen af de leverbeskyttende virkninger af de tre testmidler blev vist at være acteosid > CPhGs > echinacosid. For yderligere at belyse årsagerne til forskellene i den mekanisme, hvormed CPhG'er, echinacosid og acteosid beskytter mod leverfibrose, blev deres kemiske strukturer analyseret. Phenethylalkoholglycosiddelen ser ud til at være en væsentlig struktur for den hepatobeskyttende effekt [35]. Acteosid (C29H36Oi5) er et dobbeltglykosid, og echinacosid (C35H46O20) er et triglycosid, dvs. echinacosid har et ekstra glykosid i sin struktur sammenlignet med acteosid, hvilket fører til en stigning i dets rumlige størrelse. Den hepatobeskyttende eller inhibering af HSC-aktivitet af acteosid er bedre end den for echinacosid, hvilket kan være på grund af eksistensen af sterisk hindring.
beskytter leveren: cistanche ekstrakt
4. Eksperimentelt afsnit
4.1. Kemikalier og reagenser
TGF-pi blev købt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). HSC-T6-cellelinjen blev købt fra Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Kina). Dimethylsulfoxid (DMSO) blev købt fra Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Smad2, smad3 og smad7 primere blev produceret af Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Kina). Revert Aid første streng cDNA syntesesættet blev købt fra Thermo Scientific (Shanghai, Kina). Quantifast SYBR grønne PCR kit blev købt fra QIAGEN GmbH (Hilden, Tyskland). p-smad2 (ser465/467) antistof, Smad3 (C67H9) kanin mAb og p-smad3 (ser423/425) kanin mAb blev købt fra Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Smad7-antistof blev købt fra Boster (Wuhan, Kina). Smad2 polyklonalt antistof og p-actin monoklonalt antistof blev købt fra Proteintech (Wuhan, Kina). Påvisning af primært antistof blev udført under anvendelse af 2 graders antistofopløsning (Alk-Phos. Conjugated, Anti-kanin) og 2 graders antistofopløsning (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) købt fra Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Lactat dehydrogenase assay kit var fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina).
4.2. Plantemateriale
C. tubulosa blev indsamlet fra Tulufan i den autonome Xinjiang Uirghur-region i Kina i maj 2006. Plantematerialerne blev identificeret som C. tubulosa af Jiang He, Institut for Materia Medica i Xinjiang. En kuponprøve blev deponeret på Institute of Materia Medica i Xinjiang i Kina.
4.3. Isolering og oprensning af CPhG'er og dets forbindelser
Tørrede og snittede jordstængler af C. tubulosa (6,0 kg) blev efter hinanden ekstraheret tre gange under tilbagesvaling med 70 procent ethanol (4,8 L), og opløsningsmidlet blev derefter fjernet fra de kombinerede ekstrakter til for at give ethanolekstrakten (1,146 kg). Ethanolekstrakterne blev oprenset med AB-8-harpiks til opnåelse af det rå phenylethanolglycosider (CPhG s) ekstrakt. Efter d-opløsning i vand blev den ekstra virkning oprenset ved AB-8 ad sorption makroporøs harpikskromatografi for at opnå de totale phenylethanolglycosider fra C. tubulosa (CPhGs, 210 g). CPhG'er blev påført på en ODS OP{{10}}-søjle og elueret successivt med blandinger af MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Eluater blev kombineret i fem underfraktioner i overensstemmelse med TLC-adfærd under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet CHCh-MeOH-H2 (6:4:0,5). Pletter blev visualiseret efter sprøjtning med 1 procent FeCih. Forskellige fraktioner blev gentagne gange oprenset ved Sephadex LH-20-søjlekromatografi med methanol som elueringsmiddel, og to phenylethanolglycosider blev isoleret fra CPhG'erne. Deres strukturer blev bekræftet som echinacosid (C35H46O20) og acteosid (C29H36O15) ved hjælp af MS, 1H- og MC-NMR [35], hvilke renheder blev bestemt til at være henholdsvis 99,17 procent og 98,92 procent ved UV-HPLC. Strukturerne af echinacosid og acteosid er vist i figur 9.
4.5. Kvantitativ bestemmelse af CPhG'er
Væskekromatografi (HPLC) (LC{{0}}Et HPLC-instrument, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) blev anvendt til at analysere indholdet af echinacoside og et cteosid i CPhG'erne. En Phenomenex Gemini ODS-søjle (250 x 4,6 mm, 5 |^m) blev brugt ved 30 grader. En isokratisk mobil fase bestående af methanol-acetonitril-1 procent eddikesyre (15:10:75, v/v/v) blev brugt til en 40 minutters kørsel med en strømningshastighed på 0,6 ml/min med UV detektion ved 334 nm.
4.6. Cellekultur
HSC-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (High Glucose) (DMEM, Beijing, Kina) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IE/mL penicillin og 100 ^g/mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, USA) i en fugtig inkubator ved 37 grader med 5 procent CO2. Disse celler blev regelmæssigt subdyrket med trypsin 0,25 procent (1x) opløsning (HyClone, Logan, UT, USA), og mediet blev skiftet hver 2. dag. Indledningsvis blev celler dyrket med DMEM indeholdende 10 procent FBS i 48 timer. Mediet blev derefter erstattet med DMEM uden FBS for at udsulte cellerne i 12 timer. Disse celler blev formeret i 48 timer, og efter 48 timer blev serum udsultet med 0,5 procent FBS i 12 timer før tilsætning af 5 ng/ml TGF-&1,
4.7. Bestemmelse af IC50-værdier
Efter en inkubation natten over i udsultningsmedium indeholdende {{0}},5 procent FBS, blev HSC-celler podet i en 96-brøndsplade ved en tæthed på 5 x 104 celler/ml i 24 timer. HSC-celler blev behandlet med CPhG'er, echinacosid og acteosid i forskellige koncentrationer (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 og 500 ^g/mL) i 48 timer. Hver koncentration havde fire brønde. Ved afslutningen af behandlingen, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] (Sigma; 5 mg/ml) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. DMSO (200 rL) blev tilsat til hver brønd efter fjernelse af supernatanten. Efter omrystning af pladen i 10 minutter på en ryster blev IC50-værdierne opnået ved at måle absorbansen ved 490 nm bølgelængde ved anvendelse af et enzymmærkningsinstrument (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), denne analyse blev udført tredobbelt. IC50-værdierne for CPhG'er, echinacosid og acteosid var henholdsvis 119.125, 520.345 og 6.999 Rg/mL.
4.8. Celleproliferative hæmmende virkninger og cellelevedygtighed
HSC-celler blev udsat for forskellige koncentrationer af CPhG'er (25,50,100 Rg/mL), echinacosid (125,250,500 Rg/mL) og acteosid (1,5,3, 6 Rg/mL). Forskellige koncentrationer af CPhG'er, echinacosid og acteosid blev påført pladen i fire på hinanden følgende brønde og inkuberet i 48 timer. Celleproliferationsinhiberingsvirkningerne og niveauet af cellelevedygtighed (baseret på måling af LDH-aktivitet frigivet fra beskadigede celler ind i supernatanten [36]) blev bestemt ved et MTT-assay. Hæmningshastigheden blev beregnet ved hjælp af følgende formel [37]:
Hæmningshastighed ( procent ) " [1 — (gennemsnitlig absorbans af forsøgsgruppe/gennemsnitlig absorbans for blind kontrolgruppe)] x 100 procent
Ifølge sættets instruktion,
LDH (U/L) {{0}} (Målt OD — kontrol OD)/(standard OD — blankOD) x 0,2 mmol/L x 1000
Vores foreløbige undersøgelse viste, at CPhG'er, echinacosid og acteosid ikke påvirkede cellelevedygtigheden.
4.9. Anti-proliferative aktiviteter af TGF-^1
HSC aktiveret af TGF-p1 har længe været anset for at være forbundet med leverfibrose, og hæmning af HSC-vækst er blevet foreslået som en metode til behandling af leverfibrose [36,38]. De anti-proliferative virkninger af CPhG'er, echinacosid og acteosid på HSC'er aktiveret af TGF-p1 blev bestemt ved en MTT-assay [39]. Ved at bruge procedurerne og lægemiddelkoncentrationerne som beskrevet,
eksperimentelle grupper omfattede kontrolgruppen, TGF-pi-gruppen, TGF-pi plus forskellige koncentrationslægemiddelgrupper. Alle cellegrupper undtagen kontrolgruppen blev dyrket med DMEM indeholdende 5,0 ng/ml TGF-p1 (uden FBS) i 24 timer. Inhiberende aktivitet på celleproliferation blev beregnet som 100 x (absorbans af behandlet forbindelse - absorbans af baggrundslys)/(absorbans af model - absorbans af baggrundslys).
4.10. Omvendt transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR)
mRNA-ekspressionsniveauet for smad2, smad3 og smad7 blev bestemt ved real-time PCR. For at bestemme mRNA-ekspression i HSC-celler blev cellerne (5 x 104 celler) podet i plader med seks brønde med 3.0 ml DMEM med 10 procent FBS og inkuberet natten over ved 37 grader og 5 procent CO2. Efter at dyrkningsmediet var blevet ændret til serumfrit DMEM, blev CPhG'er (100,50,25 µg/ml), echinacosid (500.250.125 µg/ml) og acteosid (6, 3,1,5 µg/ml) tilsat til brøndene. Efter inkubation i 48 timer med CPhG'er og monomersammensætninger blev total-RNA ekstraheret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og omrørt kraftigt med chloroform i 15 s. Efter at have fået lov at stå ved stuetemperatur i 3 minutter, blev lysatet centrifugeret ved 12, 000 xgi 15 minutter ved 4 grader. RNA i den vandige fase blev præcipiteret med isopropanol, og den øvre vandige fase blev overført til et nyt mikrocentrifugerør. RNA blev præcipiteret ved tilsætning af 0,75 procent ethanol, hvorefter mikrocentrifugerøret og centrifugeret ved 12,000 xg ved 4 grader i højst 5 minutter. Supernatanten blev fjernet, og RNA'et blev tørret ved stuetemperatur i 5-10 min. Primerne (Sangon) blev designet under anvendelse af Batch Primer 3 og er anført i tabel 4. Resultaterne blev normaliseret til mRNA'et af husholdningsgenet p-actin som en intern kontrol og præsenteres som relative mRNA-niveauer. Reaktioner blev udført med 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM primerpar, 8,5 destilleret vand og 2,5 rL cDNA.
Hver polymerasekædereaktion blev udført under følgende betingelser: 95 grader i 3 minutter, derefter 40 cyklusser af 10 s ved 95 grader, 30 s ved 55 grader og 10 s ved 55 grader -95 grader til forlængelse, efterfulgt af en enkelt fluorescensmåling. De endelige resultater blev beskrevet med de relative værdier (2_AACt). Beregningen og analysen blev udført af iQ5 Real Time PCR Detection System.
4.11. Western Blot Analyse
Helcelleekstrakter blev fremstillet under anvendelse af Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.) med 1 procent Halt proteaseinhibitor og 1 procent Halt phosphatase inhibitor cocktails (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Det samlede protein blev brugt til påvisning af smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 og smad7. Proteinkoncentrationen blev målt og kvantificeret ved Bradford-metoden. Protein (10-30 Rg) blev separeret på en 10 procent SDS-PAGE gel og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Boston, MA, USA). Membraner blev blokeret i 1 time ved stuetemperatur med 5 procent bovint serumalbumin, og de primære antistoffer (smad2 polyklonalt antistof, p-smad2 antistof, smad3 kanin mAb og p-smad3 kanin mAb, 1:1000 fortynding; kanin mAb 1 smad7, smad7 :200 fortynding, p-actin monoklonalt antistof, 1:5000 fortynding) blev inkuberet ved 4 grader natten over. Den tilsvarende Alk-Phos. konjugerede sekundære antistoffer blev inkuberet ved stuetemperatur. Til sidst blev membranerne vasket tre gange med 1 x Tris-HCl saltvand med 0,1 procent Tween 20, og signaler blev scannet og visualiseret af et GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Densitometriske analyse blev udført på proteinerne af interesse og normaliseret til p-actin af GEL DOC Image Studio software (Bio-Rad). p-actin blev brugt som intern kontrol.
4.12. Statistisk analyse
Data blev udtrykt som middel 土 standardafvigelse (SD). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 16.0-softwaren (Xinjiang Medical University). Probit-analyse blev brugt til at analysere IC50-værdier. Signifikansen af forskel blev beregnet ved envejs ANOVA-test, og værdier med p < 0,05="" blev="" anset="" for="" at="" være="" statistisk="">
5. Konklusioner
Som konklusion viser CPhG'er fra C. tubulosa og dets komponenter echinacosid og acteosid signifikante anti-fibrotiske virkninger. Blandt dem er aktiviteten af acteosid den mest kraftfulde, mens aktiviteten af CPhG'erne er mellem de to forbindelser. Inhibering af aktivering af TGF-p1/Smad-signalering kan være den underliggende mekanisme, hvorved CPhG'er beskytter mod kronisk leversygdom forbundet med fibrose, og echinacosid og acteosid er den effektive anti-fibrotiske materialebasis for C. tubulosa.
Anerkendelser:Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81260624). Forfatterne vil gerne udtrykke deres oprigtige tak til professor Tao Liu for hans forbedring af skrivningen i dette papir.
Forfatterbidrag:TL, JZ, S.-PY, LM og S.-LZ udtænkte og designede eksperimenterne. S.-PY, TL og JZ analyserede dataene. S.-PY og JZ skrev manuskriptet. TL, LM og JZ gennemgik manuskriptet. Alle forfattere læste og godkendte det endelige manuskript.
Interessekonflikt:Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Referencer
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Udvikling af fytomedicin til leversygdomme. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Sygdomsmekanismer: Mekanismer for hepatisk fibrose og terapeutiske implikationer. Nat. Clin. øv. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Hepatiske lipocytter: De vigtigste kollagenproducerende celler i normal rottelever. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Tilbageførsel af leverfibrose一Faktum eller fantasi? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Forståelse af mekanismen for hepatisk fibrose og potentielle terapeutiske tilgange. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; Ravn; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. I Flora of China, 23. udg.; Redaktionskomité for Flora of China: Chinese Academy of Sciences, Beijing, Kina, 2013; s. 1-16.
7. Den kinesiske farmakopékommission fra Folkerepublikken Kinas sanitære ministerium. kinesisk farmakopé; Del 1; Chemical Industry Publishing House: Beijing, Kina, 2010; s. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Virkning af roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) på reproduktionstoksicitet hos mus induceret af glycosid af Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Hage. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE- og blodpladeaggregationshæmmere fra Tamarix hohenackeri Bunge (værtsplante af Herba Cistanches), der vokser i Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Forbedring af dextransulfat-natrium-induceret colitis hos mus med echinacosid-beriget ekstrakt af Cistanche tubulosa. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimulerer cellulær glutathion-redox-cyklus af reaktive oxygenarter genereret fra mitokondriel respiration i H9c2-kardiomyocytter. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Acid phosphatase: Endpoint for in vitro toksicitetstest. Vitro celle. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 modulerer matrixmetalloproteinase-13-ekspression i hepatiske stellatceller ved komplekse mekanismer, der involverer p38MAPK, PI3-kinase, AKT og p70S6k. Er. J. Physiol. Gastrointest Lever Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load regulerer knogledannelse og Sclerostin-ekspression gennem en TGFp-afhængig mekanisme. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun associerer med onkoproteinet Ski og undertrykker Smad2 transkriptionel aktivitet. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Han, M.; Scott, C.; et al. En vitamin D-receptor/SMAD genomisk kredsløb porter leverfibrotisk respons. Celle 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Virkninger af Fufang Biejia Ruangan-piller på hepatisk fibrose in vivo og in vitro. World J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Urtemedicin Sho-saiko-to (TJ-9) øger ekspressionsmatrixmetalloproteinaser (MMP'er) med reduceret ekspression af vævsinhibitor af metalloproteinaser (TIMP'er) i rottestjerneceller. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Rollen af TGF-01 og cytokiner i moduleringen af leverfibrose ved Sho-saiko-to i rotte/s galdegang ligeret model. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biokemiske markører, ekstracellulære komponenter i leverfibrose og skrumpelever. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Kilde og rolle af myofibroblaster i leverfibrose. Hage. Pharmacol. Tyr. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Iskæmi-reperfusionsmodel i rotte-rygmarv: Cellelevedygtighed og apoptosesignaleringsundersøgelse. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toksicitet af nanopartikler og en oversigt over aktuelle eksperimentelle modeller. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]