Phenylethanoid glycosider inducerer apoptose i Eca-109-celler via den mitokondrier-afhængige vej

Indledning

Spiserørskræft er en af ​​de mest almindelige kræfttyper med den 11. højeste sygelighedsrate og 6. højeste dødelighed på globalt plan og forårsagede ~439,000 dødeligheder i 2015. Forekomsten af ​​spiserørskræft varierer især mellem forskellige regioner, med østlige Asien og det østlige og sydlige Afrika udviser de højeste forekomster, og det vestlige Afrika udviser de laveste forekomster i 2012. I Kina var de anslåede tilfælde og dødelighed af spiserørskræft henholdsvis 477,000 og 375,000 , i 2015. Selvom sygelighedsraten for spiserørskræft er faldet i mellem- og høj-mellem sociodemografiske indekslande mellem 2005 og 2015, er dødeligheden fortsat høj på grund af den dårlige prognose. Kombinationen af ​​kirurgisk resektion med kemoterapi eller strålebehandling er blevet brugt til at behandle kræft i spiserøret, men det er blevet rapporteret, at mellem 2003 og 2014 forblev 5-årsoverlevelsesraten<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studydemonstreret detCistanche tubulosa phenylethanoid glycosider(CTPG) kunne undertrykke væksten af ​​melanom B16-F10-celler in vitro og in vivo (24). Imidlertid begrænser den dårlige vandopløselighed af CTPG tidligere anvendt lægemiddeludvikling. Derfor blev vandopløseligt CTPG (CTPG-W) brugt, og antitumoreffekten på esophageal cancerceller (Eca-109) blev undersøgt. Det blev bestemt, at CTPG-W dosisafhængigt kunne hæmme levedygtigheden af ​​Eca-109-celler gennem induktion af apoptose via en mitokondrieafhængig vej.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialer og metoder

Dyr.

C57BL/6 hunmus (6-8 uger, ~25 g) blev købt fra Beijing Laboratory Animal Research Center (Beijing, Kina) og anbragt i temperaturkontrolleret (25˚C), lyscyklus (12/ 12) Dyrefacilitet ved Xinjiang Universitet (Urumqi, Kina). Alle dyr modtog patogenfrit vand og mad.

Cellelinje og kultur.

Den humane esophageal carcinomcellelinje (Eca-109) blev bevaret af Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Kina) og dyrket i RPMI{{1} } medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kina), 1 % L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin ved 37˚C i en befugtet atmosfære indeholdende 5 % CO2.

Højtydende væskekromatografi (HPLC).

CTPG-W (kat. nr. SGJG20170410) blev købt fra Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Kina). De vigtigste forbindelser af CTPG blev kvalificeret og kvantificeret ved HPLC ifølge vores tidligere undersøgelse (24). Kort fortalt blev HPLC udført på en ZORBAX SB-C18-søjle (250x4,6 mm; 5 µm) ved 30˚C og elueret med 0,2% myresyreopløsning og en gradient af methanol startende ved 23%, da 1 ml blev tilsat hvert min. i 45 minutter, indtil 31 % er nået. I alt 10 µl prøve blev injiceret og detekteret ved 330 nm. Echinacosidstandarden blev købt fra Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Kina), og acteosidstandarden blev købt fra Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Standarderne blev brugt til at analysere komponenterne i CTPG-W.

MTT assay.

Celleproliferation blev målt med et MTT-assay. Eca{{0}}-celler blev inokuleret i 96-brøndsplader med en tæthed på 5x103 celler i 100 µl RPMI{{5 }} medium/brønd og dyrket ved 37˚C i 24 timer, derefter behandlet med forskellige koncentrationer (0, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) CTPG-W eller 0,4 % dimethylsulfoxid (DMSO) i 24, 48 og 72 timer. DMSO blev anvendt som opløsningsmiddelkontrol (800 µg/ml CTPG-W indeholdende 0,4 % DMSO). Cisplatin (20 µg/ml) blev anvendt som den positive kontrol. Efterfølgende blev supernatanten kasseret efter centrifugering ved 225 xgi 5 minutter ved stuetemperatur, og 100 µl MTT-opløsning (0,5 mg/ml i RPMI-1640-medium uden FBS) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37˚C i 3 h. De dannede formazankrystaller blev opløst i 200 µl DMSO. Værdierne for optisk tæthed (OD) blev målt ved en bølgelængde på 490 nm af en 96-brønds mikropladelæser (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Den relative cellelevedygtighed blev beregnet efter formlen: Cellelevedygtighed (%)=(ODbehandlet/ODubehandlet)x100%. Morfologien af ​​Eca-109-celler blev observeret med et inverteret fluorescensmikroskop (forstørrelse, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

Til proliferation af splenocytter blev C57BL/6-mus aflivet ved cervikal dislokation, og milte blev isoleret. Enkeltcellesuspensionen blev fremstillet, og splenocytter blev podet i 96-brøndsplader med en tæthed på 1x105 celler/brønd i 100 µl RPMI-1640 medium og derefter behandlet med forskellige koncentrationer (0, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) CTPG-W i 24, 48 og 72 timer ved 37˚C med 5 % CO2. Proliferationen af ​​splenocytter blev målt ved MTT-assay ifølge den førnævnte protokol. Stimulerende indeks=ODbehandlet/ODubehandlet.

Måling af apoptose og cellecyklus. Eca{{0}}-celler blev dyrket i 60 mm skåle ved en tæthed på 2,5x105 celler/skål i 24 timer og behandlet med forskellige koncentrationer ({{31} }, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) CTPG-W eller 0,4 % DMSO i 24 timer ved 37˚C med 5 % CO2. Celler blev opsamlet og farvet med et Annexin V-fluorescein isothiocyanat (FITC)/Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection Kit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina), i henhold til producentens protokoller. Prøver blev indsamlet ved flowcytometri (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og analyseret ved FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). For at analysere effekten af ​​CTPG-W på cellecyklussen blev 2,5x105 Eca-109-celler podet i 60 mm kulturskåle og behandlet med CTPG-W (0, 100, 200 og 400 µg/ml) eller 0,4 % DMSO i 24 timer ved 37˚C med 5 % CO2. Alle celler blev høstet og vasket to gange med iskold PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), derefter fikseret i 70% iskold ethanol ved 4˚C i 30 min. Efter vask to gange med iskold PBS blev cellerne resuspenderet i 300 µl PI/RNase-farvningsbuffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellecyklusfordelingen blev analyseret med ModFit LT 3.0-softwaren ved flowcytometri (BD FACSCalibur).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSAAnti træthedBeskyt leveren PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analyse af mitokondrielt membranpotentiale (Δψm) og reaktive oxygenarter (ROS).For at analysere Δψm blev Eca{{0}}-celler behandlet med CTPG-W (0, 400, 600 og 800 µg/ml) eller 0,4 % DMSO for 24 timer ved 37˚C med 5 % CO2 og farvet med Mitochondrial membran potential assay kit med JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina), i henhold til producentens protokol, i 20 minutter ved 37˚ C. Efter vask to gange med JC-1 vaskebuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) blev prøverne resuspenderet med 300 µl JC-1 vaskebuffer og analyseret ved flowcytometri (BD FACSCalibur). Fluorescensen af ​​JC-1-farvestof i Eca-109-celler blev også observeret med et omvendt fluorescensmikroskop (forstørrelse, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Til analyse af ROS blev Eca-109-celler behandlet med CTPG-W (0, 400, 600 og 800 µg/ml) i 2, 4, 6, 12 og 24 timer og farvet med Reactive Oxygen Species Assay kit (Beyotime Institute of Biotechnology), i henhold til producentens protokol, i 20 minutter ved 37˚C. Efter vask tre gange med iskold PBS blev prøver indsamlet ved flowcytometri (BD FACSCalibur) og analyseret med FlowJo 7.6-software.

Figur 1. Den kvalificerede kontrol af CTPG-W. Komponenterne i CTPG-W blev kvalitativt og kvantitativt analyseret ved højtydende væskekromatografi og sammenlignet med standarderne for echinacosid og acteosid. CTPG-W, vandopløselige phenylethanoid glycosider afC. tubulosa.

2,2‑diphenyl‑1‑picrylhydrazyl (DPPH) radikalfjernende aktivitet. Den frie radikalfjernende aktivitet af CTPG-W blev bestemt med et DPPH-frit radikal-assay ifølge den offentliggjorte protokol med en mindre modifikation, da methanol blev erstattet med ethanol for at opløse DPPH (25,26). Til steady-state målinger blev 150 µl DPPH (100 mmol/l) i ethanol blandet med forskellige koncentrationer af CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 og 600 µg/ml) i 50 µl PBS og inkuberet i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur. Absorbansen ved 517 nm blev påvist i nærvær og fravær af CTPG-W. I alt 50 µl C-vitamin blev anvendt som den positive kontrol. DPPH-radikalopfangningsaktiviteten blev beregnet ved hjælp af formlen: Opfangning (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, hvor Ablank er absorbansen af ​​kontrollen (uden DPPH), Asample er absorbansen af ​​prøven, og A0 er absorbansen af ​​PBS med DPPH.

Western blot analyse. Eca{{0}}-celler blev behandlet med CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) eller 0,4 % DMSO i 24 timer ved 37˚C med 5 % CO2. Den følgende vask to gange med PBS, celler 

Figur 2. Virkningen af ​​CTPG-W på væksten af ​​Eca-109-celler og splenocytter. (A) Eca-109-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W i 24, 48 og 72 timer, og derefter blev cellelevedygtighed påvist med et MTT-assay. (B) De morfologiske ændringer af Eca-109-celler efter CTPG-W-behandling efter 24 timer. (C) Splenocytter af C57BL/6-mus blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W i 24, 48 og 72 timer, og derefter blev proliferationen analyseret med et MTT-assay.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

blev lyseret i radioimmunpræcipitationsassay-lysisbuffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Kina) i 20 minutter på is. Efter centrifugering ved 10,000 xgi 10 minutter ved 4˚C, blev supernatanterne opsamlet, og proteinkoncentrationer blev påvist med et bicinchoninsyrekit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) i henhold til producentens protokoller. Western blot-analyse blev udført i overensstemmelse med vores tidligere beskrivelse (24). Antistofferne mod caspase-7 (kat.nr. D120077), caspase-8 (kat.nr. D155240), caspase-9 (kat.nr. D220078), B-cellelymfom{ {13}} (Bcl-2)-associeret X (Bax) (kat.nr. D220073) og Bcl-2 (kat.nr. D260117) og anti-muse-IgG-peberrodsperoxidase (HRP) ) (kat. nr. D111050) og anti-kanin IgG-HRP (kat. nr. D110058) blev købt fra BBI Life Sciences (Shanghai, Kina). Antistofferne mod caspase-3 (kat.nr. E-AB-10050) og aktiv caspase-3 (kat.nr. E-AB-22115) blev købt hos Elabscience ( Wuhan, Kina). Andre antistoffer mod caspase-7 (kat. nr. 9492), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (kat. nr. 9542), cytochrom c (kat. nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminal kinase (JNK) (kat. nr. 9252S) og -actin (kat. nr. 58169) blev opnået fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Alle primære og sekundære antistoffer blev fortyndet i forholdet 1:1,000. De primære antistoffer blev inkuberet ved 4˚C natten over, og de sekundære antistoffer blev inkuberet ved 37˚C i 1 time.

Figur 3. Apoptosen af ​​Eca-109-celler induceret af CTPG-W. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W i 24 timer. (A) De apoptotiske og nekrotiske Eca-109-celler blev analyseret ved flowcytometri. Det øverste panel viser de individuelle prikplot, og det nederste panel viser oversigtsdataene. *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Målproteinerne blev påvist ved hjælp af et forbedret kemiluminescensassay-kit (Beyotime Institute of Biotechnology) i henhold til producentens protokol.

Statistisk analyse. Statistisk signifikans blev beregnet ved envejsanalyse af varians med Tukeys post hoc-test, og resultaterne blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 5.0-software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) blandt behandlings- og kontrolgrupperne. Alle data blev præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT TIL FORBEDRING AF NYREFUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Resultater

CTPG-W undertrykker væksten af ​​Eca-109-celler.

Komponenterne i CTPG-W blev kvalificeret og kvantificeret ved HPLC (fig. 1), som blev sammenlignet med standarderne for echinacosid og acteosid. Ifølge topretentionstiderne og toparealerne indeholdt CTPG-W 39,16% echinacosid og 2,44% acteosid. For det første blev effekten af ​​CTPG-W på levedygtigheden af ​​Eca-109-celler bestemt med et MTT-assay. CTPG-W blev opløst i DMSO ved 200 mg/ml og fortyndet med RPMI-1640-medium indeholdende 10 % varmeinaktiveret FBS til angivne koncentrationer. Eca-109-celler blev behandlet med CTPG-W, og cellelevedygtighed blev analyseret med et MTT-assay på de angivne tidspunkter. CTPG-W-behandling reducerede markant levedygtigheden af ​​Eca-109-celler på en dosis- og tidsafhængig måde (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figur 4. Effekten af ​​CTPG-W på cellecyklusfordeling i Eca-109-celler. Forskellige koncentrationer af CTPG-W blev brugt til at behandle Eca-109-celler i 24 timer, og cellecyklusfordeling blev analyseret ved flowcytometri. *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W inducerer apoptose i Eca-109-celler. For at undersøge, om CTPG-W undertrykte væksten af ​​Eca-109-celler gennem induktion af apoptose eller nekrose, blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W. Efter 24 timer blev apoptosen og nekrosen af ​​Eca-109-celler påvist med Annexin V/PI-farvning. Som afbildet i fig. 3A blev Annexin V-/PI+-celler gatet som nekrotiske celler, og Annexin V+/PI+- og Annexin V+/PI-celler blev gatet som apoptotiske celler. CTPG-W inducerede primært apoptose af Eca-109-celler på en dosisafhængig måde, selvom de nekrotiske Eca-109-celler også steg signifikant under behandlingen af ​​600 og 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W inducerer cellecyklusstop i S-fasen i Eca-109-celler. Forstyrrelse af cancercellecyklussen vil undertrykke cellevækst og fremme apoptose (27). Fordelingen af ​​cellecyklussen i Eca-109-celler blev påvist med PI-farvning efter CTPG-W-behandling i 24 timer. Det blev observeret, at celler i S-fasen steg, og celler i G0/G1-faserne viste et generelt signifikant fald ved CTPG-W-behandling (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W reducerer Δψm og inducerer frigivelsen af ​​cytochrom c. Apoptose kan induceres af en mitokondrieafhængig vej (28,29). De pro- og anti-apoptotiske medlemmer af BCL-2-proteinfamilien spiller vigtige roller i reguleringen af ​​mitokondriel membranintegritet (30,31). Efter CTPG-W-behandling i 24 timer blev Δψm vurderet ved hjælp af JC-1-farvning. JC‑1-aggregat (rød fluorescens detekteret i FL‑2) vil desintegrere til monomer (grøn fluorescens detekteret i FL-1), når Δψm reduceres (32). Som afbildet i fig. 5A steg frekvenserne af FL-1+ FL-2-/+ celler signifikant på en dosisafhængig måde, hvilket indikerer, at Δψm af Eca-109 celler faldt. Fluorescensændringerne i Eca-109-celler blev også observeret med et omvendt fluorescensmikroskop (fig. 5B). Med de stigende koncentrationer af CTPG-W faldt den røde fluorescens, og den grønne fluorescens steg, hvilket er i overensstemmelse med dataene fra flowcytometri. Det blev også observeret, at niveauet af cytochrom c i cytosolen var mærkbart øget (fig. 5C), hvilket er et resultat af en reduktion af Δψm. Dette forstærker konklusionen fra det øgede antal af FL-1+ FL-2-/+ celler, at Δψm faldt som et resultat af CTPG-W-behandling. Det er blevet rapporteret, at JNK kan regulere aktiveringen af ​​BCL-2-proteinfamilien, hvilket forårsager frigivelsen af ​​cytochrom c (33-35). Det blev også bestemt, at niveauet af JNK var særligt opreguleret efter CTPG-W-behandling (fig. 5C). Resultaterne indikerede, at CTPG-W kan inducere apoptose af Eca-109-celler gennem en mitokondrieafhængig vej.

Figur 5. Reduktionen af ​​Δψm og opregulering af cytochrom c og JNK. Eca-109-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W i 24 timer. (A) Δψm blev detekteret ved JC-1-farvning, og prøver blev analyseret ved flowcytometri. De individuelle prikplot viser ændringerne i JC-1-fluorescens. Frekvenserne af FL-1+ FL-2-/+ celler er afbildet i det nederste panel. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figur 6. Niveauerne af ROS i Eca-109-celler efter CTPG-W-behandling og antioxidantaktiviteten af ​​CTPG-W. (A) Eca-109-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W, og niveauerne af ROS blev analyseret ved flowcytometri på angivne tidspunkter. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Effekten af ​​CTPG-W på intracellulær ROS-generering.ROS kunne reducere Δψm for at inducere apoptose (36). For at undersøge om CTPG-W kan øge ROS-produktionen, blev Eca-109-celler behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG-W. Celler blev opsamlet på de angivne tidspunkter og farvet med DCFH-DA. Produktionen af ​​intracellulær ROS i Eca-109-celler blev bestemt ved flowcytometri. Som afbildet i fig. 6A øgede 800 µg/ml CTPG-W signifikant ROS-produktion fra 2-6 timer og faldt fra 12-24 timer. Derudover øgede 400 µg/ml CTPG-W signifikant ROS-produktion fra 12-24 timer. Endvidere ændrede 200 µg/ml CTPG-W ikke nævneværdigt ROS-produktion. De dynamiske ændringer i ROS-produktion kan være forbundet med Eca-109-celleapoptose. Det blev også fastslået, at CTPG-W havde fri radikal-fjernende aktivitet (fig. 6B), som kan være forbundet med den reducerede ROS-produktion i Eca-109-celler behandlet med 800 µg/ml CTPG-W efter 12 timer.

Figur 7. Niveauerne af spaltede-caspaser og spaltet-PARP efter CTPG-W-behandling. Proteiner blev isoleret fra Eca-109-celler behandlet med CTPG-W i 24 timer, og niveauerne af spaltede caspaser og spaltet-PARP blev påvist med western blot-analyse. DMSO, dimethylsulfoxid; CTPG-W, vandopløselige phenylethanoid glycosider afC. tubulosa; PARP, poly (ADP-ribose) polymerase.

CTPG-W opregulerer aktiviteten af ​​caspase-3, caspase-7, caspase-9 og PARP. Frigivelsen af ​​cytochrom c på grund af Δψm-reduktion kunne aktivere caspaseproteaserne for at inducere apoptose (29,30,37). Efter CTPG-W-behandling i 24 timer blev aktiveringen af ​​caspase-3, 7, 8, 9 og PARP påvist ved western blot-analyse. Sammenlignet med kontrollen, niveauerne af spaltet-caspase-9, spaltet-caspase-7, spaltet-caspase-3 og spaltet-PARP, men ikke niveauerne af spaltet-caspase{{20 }}, blev opreguleret ved CTPG-behandling på en dosisafhængig måde (fig. 7). Disse resultater indikerede, at CTPG-W reducerede Δψm og fremmede cytochrom c-frigivelse for at aktivere caspaser, der inducerer apoptose af Eca-109-celler.

Diskussion

Traditionel CHM kunne inducere apoptose af esophageal cancerceller gennem forskellige veje, herunder den ekstrinsiske dødsreceptor og iboende mitokondrielle og endoplasmatiske retikulumstressveje (29). Vores tidligere undersøgelse viste, at CTPG, som hovedbestanddelen af ​​C. tubulosa, hæmmede væksten af ​​melanom B16-F10-celler gennem induktion af apoptose via en mitokondrieafhængig vej (24). I denne undersøgelse blev antitumoreffekten af ​​CTPG-W på Eca-109-celler undersøgt, og det blev bestemt, at CTPG-W undertrykte væksten af ​​Eca-109-celler, inducerede apoptose og cellecyklusstandsning, reduceret Δψm, øget frigivelsen af ​​cytochrom c og aktiverede caspaser. CTPG og CTPG-W kunne inducere apoptose og cellecyklusstop i cancerceller. De nøjagtige mekanismer er imidlertid forskellige på grund af de forskellige komponenter i CTPG (26,64% echinacosid, 10,19% acteosid og 1,71% isoacteosid) og CTPG-W (39,16% echinacosid og 2,44% acteosid). CTPG standsede B16-F10-celler i G0/G1-faserne, men CTPG-W standsede Eca-109-celler i S-fasen (24). ROS-produktion blev dosisafhængigt øget af CTPG, men det indikerede en ændring på en tidsafhængig måde med en høj dosis af CTPG-W, som steg signifikant i begyndelsen af ​​CTPG-W-behandling (2-6 timer) og faldt signifikant efter 12 timer sammenlignet med kontrollen. En mulig årsag er, at hovedbestanddelen af ​​CTPG-W er echinacosid. Adskillige undersøgelser rapporterede, at echinacosid kunne hæmme ROS-produktion og ROS-induceret apoptose for at udøve dets neurobeskyttende og anti-aldringseffekter (38-40). Tilsvarende blev den frie radikalopfangende aktivitet observeret i den foreliggende undersøgelse. Derfor blev det spekuleret i, at nogle komponenter, inklusive verbascosid, iso-verbascosid og salidrosid i en høj dosis CTPG-W umiddelbart kunne inducere ROS-generering til at forårsage apoptose af Eca-109-celler (41,42), og derefter ROS blev fanget af echinacoside. En anden mulig årsag til forskellene i ROS-produktion af CTPG og CTPG-W er, at forskellige cellelinjer blev brugt i denne undersøgelse og den tidligere undersøgelse (24). Dong et al (43) rapporterede, at echinacosid kunne inducere apoptose af humane SW480 kolorektale cancerceller gennem generering af oxidativ DNA-skade uden øgede ROS-niveauer.

CTPG-W-behandling reducerede Δψm og forårsagede frigivelsen af ​​cytochrom c, som fremmer spaltningen af ​​caspase-9 (28). Konsekvent blev niveauerne af spaltet-caspase-9 opreguleret ved CTPG-W-behandling. Efterfølgende kan den aktive caspase-9 aktivere caspase-3 for at inducere apoptose (44). Niveauerne af spaltet-caspase-3 blev også opreguleret ved CTPG-W-behandling. Caspase-8 blev imidlertid ikke aktiveret af CTPG-W, hvilket indikerer, at den ekstrinsiske dødsreceptorvej ikke var involveret i apoptosen induceret af CTPG-W. Disse observationer indikerer, at CTPG-W inducerer apoptose af Eca-109-celler gennem aktivering af en mitokondrieafhængig vej.

PARP spiller en vigtig rolle i genomisk stabilitet og kan spaltes af de aktive caspaser, især caspase-3 og -7 (45). Det blev bestemt, at CTPG-W-behandling aktiverede caspase-3 og -7, som kan spalte PARP for at hæmme DNA-reparation og forårsage apoptose.

CTPG-W undertrykker også dosis- og tidsafhængigt væksten af ​​humane hepatocellulære carcinom BEL-7404-celler (upublicerede data). Selvom CTPG-W hæmmer væksten af ​​Eca-109- og BEL-7404-celler, fremmer det splenocytter, hvilket kan skyldes indholdet af polysaccharider (~50%) i CTPG-W (46) ). Tilsvarende har flere undersøgelser rapporteret, at polysaccharider kan fremme splenocytternes splenocytter (46-49). I musemodellen blev det bestemt, at CTPG-W øgede miltindekset signifikant sammenlignet med kontrolgruppen, men ikke påvirkede kropsvægten og de andre organindekser inklusive hjerte, lever, nyre og lunge (upublicerede data). hvilket indikerer, at CTPG-W ikke har nogen cytotoksisk virkning på normale celler.

Samlet indikerede dataene, at CTPG-W hæmmer væksten af ​​Eca-109-celler ved induktion af apoptose via en mitokondrieafhængig vej

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%