Del 2: Nyreskademolekyle-1 er en potentiel receptor for SARS-CoV-2

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Kliniske manifestationer af coronavirus

1. Inkubationsperioden er lang, og hovedsymptomerne er feber, træthed, ondt i halsen og hoste. Feberen kan være høj feber, moderat feber eller lav feber;

2. Spædbørn og ældre er ikke typiske og ledsages ofte af hvæsende vejrtrækning og dyspnø. I alvorlige tilfælde kan der opstå skader på flere systemer;

3. Den tørre hoste i det tidlige stadie er hovedsageligt paroxysmal og alvorlig, svarende til kighoste, som påvirker søvn og aktiviteter; i det senere stadium er hosten sputum, sputumet er ondskabsfuldt, indeholder lejlighedsvis en lille mængde blod, og nogle er ledsaget af hvæsen;

4. Nogle patienter har milde symptomer og har muligvis ingen feber. De fleste patienter har en god prognose, og et lille antal patienter er kritisk syge eller dør endda;

5. Akut respiratorisk distress-syndrom, septisk shock, refraktær metabolisk acidose og koagulationsdysfunktion.

Hvordan man forebygger den nye coronavirus, at forbedre sin egen immunitet er det mest effektive middel for folk til at bekæmpe virussen. Cistanche, som har været brugt som en nærende skat siden oldtiden, er kendt som "ørkenginseng" og er kongen af ​​at øge immuniteten. Cistanche - Kongen af ​​at styrke immuniteten

Moderne medicinsk forskning har bevist, at udover funktionerne til at nære og styrke kroppen, har Cistanche betydelige helbredende virkninger til at forhindre tumorer, anti-aging, anti-arytmi, hæmme apoptose og forbedre immuniteten. gunst.

Dettotale glucosider af Cistancheer de aktive komponenter i ginseng til at regulere immunfunktionen, som kan forbedre immunfunktionen ikke kun for normale mennesker, men også for mennesker med lav immunfunktion.

Klinisk observation har bekræftet, at Cistanche har en vis helbredende effekt på ondartede tumorer og har den åbenlyse effekt at øge leukocytter. Indtagelse af ginseng under strålebehandling og kemoterapi kan reducere de toksiske og bivirkningerne ved strålebehandling og kemoterapi, fremskynde reparationen af ​​beskadiget væv og forhindre leukopeni;

Diskussion

At kæmpe imodCOVID-19-pandemi, en dyb forståelse af hvordanSARS-CoV-2invaderer menneskelige celler er berettiget. Undersøgelser har vist direkte infektion af SARS-CoV-2 inyreud over lungen (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). ACE2 er dog fortsat den eneste velkendte receptor, der kan mediere denne invasion. Desuden nyretropismen af ​​SARS-CoV-2 og tilhørendenyreskadesynes uforklarlige ved det relativt nedsatte niveau af ACE2 efter viral invasion (Kuba et al., 2005). Her tyder vores undersøgelse på, at KIM1, en drastisk opreguleret biomarkør for nyreskade (Yang et al., 2015), medierer SARS-CoV-2 nyreinvasion som en receptor.

Vi fandt også, at SARS-CoV-2-RBD binder til KIM1 med en højere affinitet end SARS-CoV-RBD og MERS-COV-RBD, hvilket sandsynligvis ligger til grund for den stærkere smitte af SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); Derfor er nyreinfektionen og KIM1's roller i disse alvorlige luftvejssygdomme værd at gense. Vores resultater tyder især på distinkte bindingssteder for KIM1 og ACE2 på viral RBD, så det er værd at undersøge, om og hvordan KIM1 og ACE2 medierer SARS-CoV-2-invasion i disse organer. Da KIM1 er endocyteret via clathrin-afhængige veje (Zhao et al., 2016), ville det også være interessant at udforske den KIM1-afhængige proces yderligere efter viral binding til cellemembranen.

ACE2 er den mest velundersøgte receptor for SARS-CoV-2, men det er ikke et ideelt terapeutisk mål for COVID-19, da det er bredt udtrykt i flere organer og spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​blodtrykket og forebyggelse af hjerte-/nyreskade (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). I modsætning hertil har KIM1 en stærkere sammenhæng med nyrefunktion og kommer først stærkt til udtryk efternyreskade(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda og Kaplan, 2018), hvilket gør det til et mere specifikt og måske også sikrere terapeutisk mål for COVID-19 patienter med nyresygdomme.

Sammenfattende tyder vores data på en afgørende rolle for KIM1 i SARS-CoV-2 nyretropisme som en potentiel receptor for SARS-CoV-2. Her foreslår vi en model af en 'ond cirkel' medieret af KIM1 og ACE2 (figur 5G), som kan forklare nyretropismen af ​​SARS-CoV-2 hos COVID-19-patienter. Under den indledende fase af SARS-CoV-2-invasion gør det højere fysiologiske niveau (Supplerende Figur S1) og bindingsaffiniteten (Supplerende Tabel S1) ACE2 til det primære mål, som ikke er nyrespecifikt. Efter starten af ​​virus-induceret AKl fremmer den resulterende drastisk opregulerede KIM1 imidlertid hurtigt en sekundær virusinfektion medieret af KIM1 og ACE2, som er mere nyrespecifik og som følgelig forværrer nyreskade i en ond cirkel (figur 5G). Tilgange, der kan bryde interaktionen mellem SARS-CoV-2 og KIM1, herunder anti-KIM1-antistoffer, småmolekylehæmmere og KIM1-afledte antagonistpeptider, kan kaste lys over COVID-19 behandling.

Materialer og metoder

Materialer

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 procent) blev kemisk syntetiseret af Genscript. Anti-mus-lgG-antistof (p/n 18-8816-33) og anti-kanin-lgG-antistof (p/n 18-8817-33) blev opnået fra Rockland. IgG with SureBeads" Protein G magnetiske perler (J2112LB-02) blev købt fra Bio-Rad. DAPI (D9542) var fra Sigma. Alex Flour 594 mærket phalloidin (C2205S) var fra Beyotimes. Antistoffer mod KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) og ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) blev brugt.

Erhvervelse og analyse af ekspressionsprofiler af KIM1 og ACE2

For at opnå de omfattende transkriptom- og proteinprofiler af KIM1 og ACE2 for humant væv indsamlede og analyserede vi transkriptomdata og immunhistokemi-baserede proteinprofiler fra Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), som viste ekspression og lokalisering af humane proteiner på tværs af væv og organer, baseret på dyb sekventering af RNA (RNA-seq) fra 37 normalt væv og immunhistokemi på vævsmikroarrays indeholdende 44 vævstyper (Uhlen et al., 2015). HPA RNA-seq væv af det proteinkodende gen blev registreret som middelproteinkodende transkripter pr. million (pTPM), svarende til middelværdierne af prøver fra hvert væv. Histologi-baserede proteinekspressionsniveauer blev analyseret manuelt i fire niveauer (ikke detekteret, lav, medium og høj). I supplerende figur S1 er de øverste 10 vævstransskriptionsniveauer og histologibaserede proteinekspressionsniveauer for henholdsvis KIM1 og ACE2 opført, og den overlappede ekspressionsprofil af KIM1 og ACE2 er opsummeret.

Molekylær docking og dynamiksimuleringer

Dokninger blev udført via Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/). Krystalstrukturer af SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2(PDB ID 1R42) og KIM1 Ig V-domæne (PDB ID 5DZO) blev brugt til at søge potentielle bindingsmodeller. De bedst scorede proteinkomplekser blev udvalgt til følgende molekylær dynamiksimuleringer, som blev udført af Desmond-serveren og analyseret af Pymol2.3 og Maestro11.8.012. 50 ns dynamiksimuleringsdiagrammet blev anvendt til at studere de dynamiske parametre for proteinkomplekserne . MM-GBSA bindende fri energi blev beregnet af HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Root mean square deviation (RMSD) og root mean square fluktuation (RMSF)

RMSD blev brugt til at estimere den gennemsnitlige ændring i forskydning af et udvalg af atomer for en bestemt ramme som beskrevet (Li et al., 2011). RMSF blev udført for at studere forskydningsændringerne i proteinkæden (Li et al., 2011) .

AKI musemodeller og qPCR

I/R-skade blev udført på C57BL/6-mus, som vi tidligere har beskrevet (Chen et al, 2015, 2017). For cisplatin-induceret AKI blev 30 mg/kg kropsvægt cisplatin injiceret intraperitonealt i 8-uge gamle hanmus, og mus blev aflivet 3 dage senere. Blod- og nyreprøver blev indsamlet til yderligere analyse, med n=4 for hver forsøgsdyrgruppe. Total RNA blev isoleret fra nyrerne med RNAiso Plus (TaKaRa) og revers-transkriberet til cDNA ved anvendelse af M-MLV førstestrengs syntesesystemet (Invitrogen). Overfloden af ​​specifikke gentranskripter blev vurderet ved qPCR. Primere brugt i undersøgelsen er tilvejebragt (Supplerende tabel S4).

Konstruerer

Pattedyrsekspressionsplasmider for human KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 rester aa 20-127), KIM1 △lg V(trunkeret KIM1 uden rester aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S-rester aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP og TIM4-YFP blev konstrueret. PCR-amplifikationsprodukter af de tilsvarende cDNA-fragmenter blev klonet ind i en pRK-promotorbaseret vektor indeholdende enten HA- eller FLAG-mærke. SARS-CoV-2-relaterede plasmider var venlige gaver fra Dr. PHWang ved Shandong University.

Cellekultur og transfektion

Human nyre-tubulær cellelinje HK-2 (opnået fra China Center for Type Culture Collection) blev dyrket i DMEM/F12-medier (Hyclone) indeholdende 17,5 mM glucose og 10 procent føtalt bovint serum. For at evaluere virkningen af ​​SARS-CoV-2 på celler blev HK-2-celler transficeret med SARS-CoV-2-S- og SARS-CoV-2-RBD-plasmider og derefter indsamlet for yderligere påvisning.

Co-IP

Indikerede HK-2/HEK293T-celler (1×10) blev lyseret i 1 ml præ-lysebuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 procent NP-40, 1 mM EDTA, 5 procent glycerol), som er formuleret til pulldown- og IP-assays og som en vaskebuffer til perler. Til IP blev cellelysat immunpræcipiteret med det angivne antistof eller respektive gG med SureBeadsTM Protein G magnetiske perler natten over ved 4C. Efter vask med en præ-lysebuffer indeholdende 500 mM NaCl blev perlerne kogt i en ladningsbuffer og udsat for immunblotting (Wan et al., 2017).

FRET assay

Intracellulær interaktion mellem KIM1 og SARS-CoV-2-RBD blev detekteret af et standard FRET-baseret assay (Karpova og McNally, 2006) ved brug af KIM1-CFP og SARS-CoV-2-RBD-YFP . Kort fortalt blev pattedyrsekspressionsplasmider, der udtrykker KIM1-CFP eller KIM1 Alg V-CFP, cotransficeret med SARS-CoV-2-RBD-YFP ind i-293T-celler. Til fluorescensspektrofotometer-baseret detektion blev celler opsamlet og lyseret 24 timer efter transfektion, og lysatet blev detekteret med et F-2700 fluorescensspektrofotometer (Hitachi) via bølgelængdescanning (500-600nm) og tidsscanning (435) /527 nm, excitation/emission). Til konfokal-baseret detektion blev celler afbildet med et Leica TCS SP8 konfokalmikroskop under højeffekt objektivlinse (40×) (CFP-kanal: 435/485 nm, excitation/emission; YFP-kanal :485/527 nm, excitation/emission; FRET-kanal: 435/527 nm, excitation/emission) (Li et al, 2020b). Cotransfektion af ukonjugeret CFP og YFP blev inkluderet som en negativ kontrol som beskrevet (Karpova og McNally, 2006). Interaktion mellem KIM1 og dets ligand TIM4 blev påvist ved FRET-assay som en positiv kontrol (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-medieret knockout af KIM1

De CRISPR-Cas9-baserede protokoller til genomteknologi blev brugt som beskrevet (Zhang et al., 2017). Guide-RNA-målsekvenser for KIM1 er tilvejebragt (Supplerende tabel S4).

FITC-mærkning og konfokalmikroskopi

FITC-mærket blev udført som vi tidligere har beskrevet (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Kort fortalt blev SARS-CoV-2-RBD inkuberet med FITC (molforhold 1:5) natten over, og derefter blev 5 mM NHCl tilsat for at standse reaktionen og standse den uomsatte FITC. Opløsningen blev dialyseret to gange og lyofiliseret til yderligere anvendelse.

HEK293T-celler (5×109) eller HK-2-celler (1×107) blev inkuberet med fri FITC eller FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml i 2. Til peptidbaserede internaliseringsassays blev AP1 eller AP2 (50μM) tilføjet sammen med FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m). Efter fiksering med 4 procent (w/v) formaldehyd blev cellemembraner farvet med Alex Flour 594 mærket phalloidin (2 ug/ml), og kernerne blev farvet med DAPI (1 ug/m) og derefter afbildet med en Leica TCS SP8 konfokalmikroskop. For hver gruppe blev mindst 100 celler fra fem felter under en højeffekt objektivlinse (64×) inkluderet i vurderingen. Repræsentative billeder blev præsenteret. Kvantificering af billeder blev udført af ImageJ1.8.0.

Cellelevedygtighedsassays

Celler blev udpladet med 3000-4000 celler pr. brønd i 96-brøndsplader. Ved 80 procent konfluens blev celler inkuberet med SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) behandlet med eller uden AP1 eller AP2 (10,50,100 μM). Derefter blev 10 ul MTT (5 mg/ml) tilsat til hver

godt i 4 timer, mediet blev fjernet, og DMSO blev tilsat. Absorbans målt ved 490 nm blev normaliseret til den respektive kontrolgruppe.

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som middel ± SD. Signifikante forskelle blev vurderet ved en tosidet Students test. En tosidet P-værdi<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">