Anden del Hvordan behandler echinacoside DNA-oxidativ skade og hæmmer celleapoptose?

KLIK HER FOR AT DEL 1

For mere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

3. Eksperimentel Afsnit

3.1. Celler og Kemikalier

En human kolorektal adenokarcinom SW480-cellelinje blev købt fra ATCC. Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) indeholdende 10 procent føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) og 1 procent (v/v) penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 37 grader i en befugtet atmosfære indeholdende 5 procent CO2.Echinacosideblev købt fra Yuanye Biotechnology, Shanghai, Kina (HPLC > 98 procent). Stamopløsninger blev fremstillet i DMSO (Sigma-Aldrich), og arbejdsopløsninger blev fremstillet i et cellekulturmedium.

3.2. MTT levedygtighedsanalyse

Celler blev podet i 96-brøndsplader med 1 × 104 celler pr. brønd i 12 timer og derefter inkuberet i nærvær afEchinacosideeller 0,01 procent DMSO i 24 eller 48 timer. Til sidst, 20 μL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-opløsning (5 mg/ ml i PBS, pH 7,2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 4 timer. Efter fjernelse af mediet indeholdende MTT blev 150 μL DMSO tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet på en pladeryster i 10 minutter, og absorbans ved 570 nm blev målt med en BioRad 680 mikropladelæser (Hercules, CA, USA). Hvert eksperiment blev udført to gange i tre eksemplarer. Data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism-softwaren (San Diego, CA, USA).

3.3. Kolonidannelsesassay

Celler blev podet i 6-brøndsplader ved en tæthed på 1 × 104 pr. brønd i 12 timer og derefter inkuberet i nærvær afEchinacosideeller {{0}},01 procent DMSO i 10 dage. Pladerne blev vasket med PBS, og celler blev fikseret med iskold methanol og farvet med krystalviolet opløsning (Sigma-Aldrich) (0,5 procent i 25 procent methanol). Billeder blev fotograferet efter pladerne var tørret natten over. De krystalviolette krystaller blev opløst i 70 procent ethanol, og absorbans ved 595 nm blev målt med en BioRad mikropladelæser. Data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism-softwaren.

3.4. DNA-fragmenteringsanalyse med DAPI-fluorescens Farvning

Efter lægemiddelbehandling blev celler i {{0}}brøndsplader vasket én gang i PBS, fikseret i iskold 4 procent paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich) i PBS i 20 minutter og derefter farvet med 4 ,6-diamidino-2- phenylindol (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 ug/ml) i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev celler forseglet i VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Nuklear morfologi blev fotograferet med et Olympus fluorescerende mikroskop.

Echinacoside i cistanche kan booste immunsystemet

3.5. Cellecyklusanalyse

Celler blev podet i 96-brøndsplader med 1 × 104 celler pr. brønd i 12 timer og derefter inkuberet i nærvær afEchinacosideeller {{0}}.01 procent DMSO i 24 timer. Til sidst blev cellerne høstet med trypsin (Invitrogen), vasket i PBS to gange og derefter fikseret med iskold ethanol (70 procent) i 2 timer ved -20 grader. Faste celler blev vasket to gange i kold PBS og resuspenderet i 300 μL frisklavet PBS med 0,1 procent Triton X-100, 0,2 mg/ml DNase-fri RNase A (Sigma), 10 ug/ml Propidium Iodide (PI) (Roche, Indianapolis, IN, USA). Efter inkubation ved 37 grader i mørke i 20 minutter blev cellerne filtreret gennem et nylonnet (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, USA), indlæst til FACSCalibur flowcytometeret (BD Biosciences). Data blev analyseret ved hjælp af ModFit-softwaren (Topsham, ME, USA).

3.6. Apoptoseanalyse

Celler blev podet i 96-brøndsplader med 1 × 104 celler pr. brønd i 12 timer og derefter inkuberet i nærvær afEchinacosideeller 0,01 procent DMSO i 24 timer. Til sidst blev cellerne undersøgt ved hjælp af et Annexin V-FITC Apoptose detektionskit (Best, Shanghai, Kina) i henhold til producentens instruktioner. Celler blev vasket to gange med PBS og derefter resuspenderet i bindingsbuffer. 5 μL hver af Annexin V-FITC og Propidium Iodide (PI) (Roche) blev tilsat sekventielt, og cellerne blev inkuberet i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur. Cellerne blev indlæst på FACSCalibur flowcytometeret (BD Biosciences). Data blev analyseret ved hjælp af Cell Quest-softwaren (BD Biosciences).

3.7. Immunfluorescerende farvning af 53BP1

SW480-celler blev podet på runde dækglas i 24-brøndsplader. Efter behandling medEchinacosideeller {{0}},01 procent DMSO i 24 timer, celler blev fikseret med 4 procent PFA i 20 minutter og blokeret med 15 procent FBS (0,1 procent Triton X-100) ​​i 1 time i rummet temperatur. Faste celler blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med kanin anti-53BP1 antistof (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) fortyndet 1:1000 i den blokerende opløsning, efterfulgt af farvning med Cy3-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) fortyndet 1:500 i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask i PBS i 3 × 5 minutter blev dækglassene forseglet på objektglas i VECTASHIELD monteringsmedium med DAPI. Billeder blev taget med et Zeiss LCM 510 konfokalmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

3.8. 8-oxoG Incorporation Assay

Intracellulær 8-oxoG blev målt ved farvning med Alexa 488-konjugeret avidin (Invitrogen) [25]. Celler blev podet på runde dækglas i 12-brøndsplader. Efter behandling medEchinacosideeller {{0}}.01 procent DMSO i 24 timer, celler blev fikseret med iskold methanol i 20 minutter efterfulgt af inkubation i Tris-bufret saltvand (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) med 0,1 procent Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i 15 min. Prøverne blev blokeret i TBS med 0,1 procent Triton X-100 og 15 procent FBS i 1 time ved stuetemperatur og derefter farvet med Alexa 488-konjugeret avidin (0,5 ug/ml) i blokeringsopløsning i 1 time ved 37 grader. Efter vask i PBS i 3 × 5 minutter blev dækglassene forseglet på objektglas i VECTASHIELD monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories). Billeder blev taget og analyseret med et Zeiss LCM 510 konfokalmikroskop.

3.9. Western Blot Analyse

Celler dyrket og behandlet i {{0}}brøndsplader blev skrabet i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1,0 procent IGEPAL CA-630, {{12 }},5 procent natriumdeoxycholat, 0,1 procent SDS og 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0) (Sigma). Den samlede proteinkoncentration blev målt med BCA-kit (Dingguo, Changchun, Kina) ifølge producentens instruktioner. Prøver blev denatureret ved 95 grader i 10 minutter, adskilt på 4 procent –12 procent SDS-PAGE gel og derefter overført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membraner blev blokeret i 5 procent fedtfri mælk i TBST i 2 timer og inkuberet med primære antistoffer (Bcl-2, sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Bax, Santa Cruz , sc-493; til c, Santa Cruz, sc-7159; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, USA; caspase 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs-2318 R; 53BP1, Bethyl Laboratories, A300-272A) natten over ved 4 grader . Efter vask med PBS blev membraner inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (Jackson ImmunoResearch Laboratories) og visualiseret med ECL Western blotting detektionskit (Transgen Biotech, Changchun, Kina). Billeder blev taget og analyseret af en billedkamera (Tanon, Shanghai, Kina).

3.10. Måling af Cellular ROS

Intracellulær ROS blev målt ved flowcytometri under anvendelse af et cellebaseret ROS-assaykit (Beyotime Biotechnology, Haimen, Kina; S0033). Ved udgangen afEchinacosidebehandling blev cellerne vasket to gange med PBS og inkuberet med 10 μM dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) i 30 minutter ved 37 grader. Cellerne blev derefter trypsiniseret og analyseret med FACSCaliber flowcytometeret (BD Biosciences). Intracellulære ROS-niveauer blev udtrykt som den gennemsnitlige DCF-fluorescensintensitet af cellerne.

3.11. Måling af mitokondriel membran Potentiel

Mitokondriel membranpotentiale blev målt ved hjælp af JC-1 farvestoffet (Beyotime Biotechnology, C2006) efter producentens instruktioner. Kontrol ogEchinacoside-behandlede celler blev inkuberet med JC-1 i 20 minutter og derefter undersøgt med et Olympus fluorescerende mikroskop.

3.12. Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism Software. Signifikans blev beregnet ved hjælp af en-vejs variansanalyse (ANOVA) ogp < 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

Echinacosideicistanche: Neurobeskyttelseeffekter

4. Konklusioner

I denne undersøgelse har vi testet virkningerne afEchinacosidepå en række humane cancercellelinjer. Det fandt vi overraskende ud af

Cistanchedeserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

hæmmede spredningen af ​​human SK-HEP-1 hepatom, MCF-7 brystkræft og SW480 kolorektale cancerceller. Yderligere analyser viste, at Echinacoside standsede SW480-celler i G1-fasen og inducerede caspase-afhængig apoptose ved at aktivere den mitokondrier-associerede iboende apoptose-vej. Cellecyklusstop var relateret til opregulering af G1/S-CDK-blokkeren og DNA-syntesehæmmeren CDKN1B (p21), og apoptose var forbundet med nedregulering af det anti-apoptotiske protein Bcl-2 og opregulering af pro-apoptotisk Bax, samt tab af mitokondriemembranpotentiale. Den signifikante stigning i intracellulær oxideret form af guanin, 8-oxoG, tyder på, at der var øget oxidation af dNTP'er og/eller DNA-molekyler, hvilket kan have forårsaget cellecyklusstop og apoptose i SW480-kræftceller. Mens de underliggende mekanismerEchinacoside's virkninger på oxidativ skade og apoptose er endnu ikke karakteriseret, disse resultater understøtter Echinacoside som et nyt kemisk stillads til udvikling af lægemidler mod kræft.

Anerkendelser

Disse undersøgelser blev støttet af et tilskud fra Jilin-provinsen (bevillingsnummer: 20130101120JC) og af en forskningsfond fra Jilin University (projektnummer: 450091099029).

Forfatterbidrag

Liwei Dong udførte det meste af det eksperimentelle arbejde, analyserede dataene og skrev manuskriptet; Debin Yu og Nuoting Wu udførte MTT- og kolonidannelsesassayet; Hongge Wang og Jiajing Niu udførte immunfarvning og Western blot-eksperimenter; Ye Wang hjalp med cellecyklus- og apoptoseeksperimenter; og Zhihua Zou udviklede konceptet, analyserede dataene og overvågede implementeringen af ​​denne undersøgelse og skrivningen af ​​manuskriptet. Alle forfattere har godkendt det indsendte manuskript.

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Echinacosideicistanchekananti-inflammatorisk

Referencer

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analyse af kemiske bestanddele i Cistanche-arter.J. Chromatogr.2009,

1216, 1970–1979.

2. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W.Cistanche deserticolaYC Ma, "ørkenginseng": En anmeldelse.Er. J. Chin. Med.2012, 40, 1123–1141.

3. Freeman, C.; Spelman, K. En kritisk evaluering af lægemiddelinteraktioner medEchinacea spp.

Mol. Nutr. Food Res.2008, 52, 789–798.

4. Hudson, JB Anvendelser af fytomedicinenEchinacea purpurea(Purple Coneflower) i infektionssygdomme.J. Biomed. Biotechnol.2012, 2012, 769896.

5. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside hæmmer amyloid fibrillering af HEWL og beskytter mod A-induceret neurotoksicitet.Int. J. Biol. Macromol.2015, 72, 243–253.

6. Wu, Y.; Li, L.; Wen, T.; Li, YQ Beskyttende virkninger af echinacoside på carbontetrachlorid-induceret hepatotoksicitet hos rotter.Toksikologi2007, 232, 50–56.

7. Li, X.; Gou, C.; Yang, H.; Qiu, J.; Gu, T.; Wen, T. Echinacoside forbedrer D-galactosamin plus lipopolysaccharid-induceret akut leverskade hos mus via hæmning af apoptose og inflammation.Scand. J. Gastroenterol.2014, 49, 993–1000.

8. Xie, H.; Zhu, H.; Cheng, C.; Liang, Y.; Wang, Z. Echinacoside hæmmer cellulær senescens af humane fibroblastiske celler MRC-5.Pharmazie2009, 64, 752–754.

9. Wang, S.; Zheng, G.; Tian, ​​S.; Zhang, Y.; Shen, L.; Pak, Y.; Shen, Y.; Qian, J. Echinacoside forbedrer hæmatopoietisk funktion i 5-FU-inducerede myelosuppressionsmus.Life Sci.2015, 123, 86–92.

10. Jia, Y.; Guan, Q.; Guo, Y.; Du, C. Echinacoside stimulerer celleproliferation og forhindrer celleapoptose i intestinale epiteliale MODE-K-celler ved opregulering af transformerende vækstfaktor- 1-ekspression.J. Pharmacol. Sci.2012, 118, 99–108.

11. Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Imamura, M.; Akaki, J.; Fujikura, S.; Pan, Y.; Yuan, D.; Yoshikawa, M.; Jia, X.; Li, Z.;et al.Acylerede phenylethanoidglycosider, echinacosid og acteosid fraCistanche tubulosa, forbedre glukosetolerance hos mus.J. Nat. Med.2014, 68, 561–566.

12. Yang, X.; Li, F.; Yang, Y.; Shen, J.; Zou, R.; Zhu, P.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Effekt og sikkerhed af echinacoside i en rotte-osteopeni-model.Evid. Baseret komplement. Altern. Med.2013, 2013, 926928.

13. Kuang, R.; Sun, Y.; Zheng, X. Undertrykkelse af nitrogenoxid impliceret i den beskyttende virkning af echinacosid på H2O2-induceret PC12-celleskade.Nat. Prod. Commun.2010, 5, 571–574.

14. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioxidative virkninger af phenylethanoider fra

Cistanche deserticola. Biol. Pharm. Tyr.1996, 19, 1580–1585.

15. Zhang, Y.; Du, Y.; Le, W.; Wang, K.; Kieffer, N.; Zhang, J. Redox kontrol af overlevelsen af ​​sunde og syge celler.Antioxid. Redox signal.2011, 15, 2867–2908.

16. Russo, MT; Blasi, MF; Chiera, F.; Fortini, P.; Degan, P.; Macpherson, P.; Furuichi, M.; Nakabeppu, Y.; Karran, P.; Aquilina, G.;et al.Den oxiderede deoxynukleosidtrifosfatpulje er en væsentlig bidragyder til genetisk ustabilitet i mismatch reparationsmanglende celler.Mol. Celle. Biol.2004, 24, 465–474.

17. Ventura, I.; Russo, MT; de Luca, G.; Bignami, M. Oxiderede purin-nukleotider, genom-ustabilitet og neurodegeneration.Mutat. Res.2010, 703, 59–65.

18. Rajendran, P.; Nandakumar, N.; Rengarajan, T.; Palaniswami, R.; Gnanadhas, EN; Lakshminerasaiah, U.; Gopas, J.; Nishigaki, I. Antioxidanter og menneskelige sygdomme.Clin. Chim. Acta2014, 436, 332–347.

19. Rai, P.; Onder, TT; Young, JJ; McFaline, JL; Pang, B.; Dedon, PC; Weinberg, RA Kontinuerlig eliminering af oxiderede nukleotider er nødvendig for at forhindre hurtig indtræden af ​​cellulær senescens.Proc. Natl. Acad. Sci. USA2009, 106, 169–174.

20. DeNicola, GM; Karreth, FA; Humpton, TJ; Gopinathan, A.; Wei, C.; Frese, K.; Mangal, D.; Yu, KH; Yeo, CJ; Calhoun, ES;et al.Onkogen-induceret Nrf2-transkription fremmer ROS-afgiftning og tumorigenese.Natur2011, 475, 106–109.

21. Santos, MA; Faryabi, RB; Ergen, AV; Dag, AM; Malachowski, A.; Canela, A.; Onozawa, M.; Lee, JE; Callen, E.; Gutierrez-Martinez, P.;et al.DNA-skade-induceret differentiering af leukæmiceller som en anti-cancer barriere.Natur2014, 514, 107–111.

22. Sayin, VI; Ibrahim, MX; Larsson, E.; Nilsson, JA; Lindahl, P.; Bergo, MO Antioxidanter fremskynder udviklingen af ​​lungekræft hos mus.Sci. Overs. Med.2014, 6, 221–215.

23. Harris, IS; Treloar, AE; Inoue, S.; Sasaki, M.; Guerrini, C.; Lee, KC; Yung, KY; Brenner, D.; Knobbe-Thomsen, CB; Cox, MA;et al.Glutathion- og thioredoxin-antioxidantveje synergerer for at drive kræftinitiering og -progression.Kræftcelle2015, 27, 211–222.

24. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimulerer cellulær glutathion-redox-cyklus af reaktive oxygenarter genereret fra mitokondriel respiration i H9c2-kardiomyocytter.Pharm. Biol.2013, 51, 64–73.

25. Struthers, L.; Patel, R.; Clark, J.; Thomas, S. Direkte påvisning af 8-oxo-deoxyguanosin og 8-oxoguanin med avidin og dets analoger.Anal. Biochem.1998, 255, 20–31.

26. Bridge, G.; Rashid, S.; Martin, SA DNA mismatch reparation og oxidativ DNA-skade: Implikationer for cancerbiologi og behandling.Kræft2014, 6, 1597–1614.

27. Caldecott, KW Enkeltstrenget brudreparation og genetisk sygdom.Nat. Rev. Genet. 2008, 9, 619–631.

28. Ward, IM; Minn, K.; van Deursen, J.; Chen, J. p53 Bindingsprotein 53BP1 er påkrævet til DNA-skadereaktioner og tumorundertrykkelse i mus.Mol. Celle. Biol.2003, 23, 2556–2563.

29. Nakabeppu, Y. Cellulære niveauer af 8-oxo-guanin i enten DNA eller nukleotidpuljen spiller en central rolle i carcinogenese og overlevelse af cancerceller.Int. J. Mol. Sci.2014, 15, 12543–12557.

30. Colussi, D.; Brandi, G.; Bazzoli, F.; Ricciardiello, L. Molekylær veje involveret i kolorektal cancer: Implikationer for sygdomsadfærd og forebyggelse.Int.J. Mol. Sci.2013, 14, 16365–16385.

31. Satelli, A.; Mitra, A.; Brownlee, Z.; Xia, X.; Bellister, S.; Overman, MJ; Kopetz, S.; Ellis, LM; Meng, QH; Li, S. Epitel-mesenchymal transitioned cirkulerende tumorceller indfanger til påvisning af tumorprogression.Clin. Cancer Res.2015, 21, 899–906.

32. Liao, X.; Lochhead, P.; Nishihara, R.; Morikawa, T.; Kuchiba, A.; Yamauchi, M.; Imamura, Y.; Qian, ZR; Baba, Y.; Shima, K.;et al.Aspirinbrug, tumor PIK3CA mutation og overlevelse af kolorektal cancer.N. Engl. J. Med.2012, 367, 1596–1606.

33. Domingo, E.; Kirke, DN; Sieber, O.; Ramamoorthy, R.; Yanagisawa, Y.; Johnstone, E.; Davidson, B.; Kerr, DJ; Tomlinson, IP; Midgley, R. Evaluering af PIK3CA-mutation som en forudsigelse af fordelen ved ikke-steroid anti-inflammatorisk lægemiddelbehandling ved kolorektal cancer.J. Clin. Oncol.2013, 31, 4297–4305.

34. Ahmed, D.; Eide, PW; Eilertsen, IA; Danielsen, SA; Eknaes, M.; Hektoen, M.; Lind, GE; Lothe, RA Epigenetiske og genetiske træk ved 24 tyktarmskræftcellelinjer.Onkogenese2013, 2, doi:10.1038/oncsis.2013.35.