Del Ⅱ: Tubulær mitokondriel AKT1 aktiveres under iskæmisk reperfusionsskade og har en kritisk rolle i prædisposition for kronisk nyresygdom.
Apr 04, 2023
Forøgelse af renal tubuli mitokondriel AKT1 beskyttet mod AKI og efterfølgende CKD
Da inhibering af AKT1 i nyreepitelceller forværrer nyrefunktionen og dyrenes overlevelse efter IRI, undersøgte vi derefter, om forbedret tubulær mitokondriel AKT1-signalering kunne beskytte nyren mod IRI. Til dette formål genererede vi en to-gen muselinje med den tubulære cellespecifikke ekspression af tam-induceret mitokondrie-målrettet konstitutivt aktiv AKT1 (mcaAKT) (KMCAKT-mus) ved den samme strategi, som vi udviklede til KMDAKT-mus. Western blot-resultater viste, at i mitokondrierne af TAM-KMCAKT-mus blev konstitutivt aktiv AKT1 udtrykt specifikt i nyren, hvorimod den var fraværende og nyrespecifik i kontrolmus. Som før, for at verificere, at mutant AKT1 er lokaliseret til mitokondrier i tubuli, viste immunfluorescensfarvning co-lokalisering af mutant AKT1 og mitokondrier. Mutant AKT1 blev ikke påvist uden for tubuli. for at vurdere mcaAKT-aktivitet sammenlignede vi AKT1-enzymaktivitet i mitokondrier isoleret fra TAM- og majsoliebehandlede mus. Som forventet var renal mitokondriel AKT1-aktivitet signifikant øget i TAM-KMCAKT-mus.
For at undersøge, om forbedring af tubulær mitokondriel AKT1 kunne forbedre resultatet af IRI i TAM-KMCAKT og majsolie-KMCAKT-mus ved hjælp af unilateral IRI, mens kontralateral Nx inducerede AKI. serum BUN var forhøjet i majsolie-KMCAKTmus på dag 7 og 45 efter IRI sammenlignet med TAM-KMCAKT-mus (p=0.03). Cr var signifikant lavere i TAM-KMCAKT-mus på dag 2, 7 og 45 efter IRI. Disse resultater tyder på, at forbedring af mitokondriel AKT i nyretubuli svækkede IRI-induceret AKI og forbedrede forringelsen af nyrefunktionen og efterfølgende udvikling af CKD. Histologi af disse mus viste, at nyreskade var mere alvorlig hos mus injiceret med majsolie. Sammenlignet med TAM KMCAKT-nyrer havde den tubulære skade højere Jablonski-score, tab af tubulær børstekant, tubulær lysis og mere intra-tubulært luminalt affald (p=0.038). Masson-trikromfarvning viste reduceret fibrotisk areal (procent) i TAM-KMCAKT-mus efter IRI (p<0,001). der var mindre tubulær skade og lavere KIM-1-ekspression i TAM-KMCAKT-nyrer. TUNEL-assay viste øgede apoptotiske celler i majsolieKMCAKTnyrer efter IRI. I TAM-KMCAKT-nyrer blev tubulær apoptose reduceret med 52 procent og glomerulær apoptose med 46 procent (p=0.0064 og p=0.0021). aktivering af Caspase 3 og 9 blev tilsvarende hæmmet ved aktivering af mitokondriel AKT1 i tubuli. Sværhedsgraden af glomerulosklerose vurderet ved PAS-farvning blev reduceret med 38 procent (p=0.001) i TAM-KMCAKT-mus sammenlignet med majsolieKMCAKTmus 45 dage efter IRI. Forøgelse af renal tubulær mitokondriel AKT1 beskytter således nyren mod IRI-induceret tubulær apoptose, forhindrer ophobning af affald i tubuli og dæmper glomerulær skade efter tubulær skade.
Kaplan-Meier overlevelsesanalyse blev brugt til at vurdere, om de førnævnte renale histologiske og funktionelle ændringer kunne udlede overlevelse. Faktisk var overlevelsesraten for TAMKMCAKT-mus efter IRI meget højere end for majsolie KMCAKT-mus (76,9 procent vs. 20,8 procent, p<0,001). Det tyder på detmanipulation af tubulær mitokondriel AKT1-signalering kunne betragtes som et potentielt mål for udvikling af nye terapeutiske tilgange til at forbedre resultaterne.
Klik her for at fåCistanche-ekstraktprodukter
Mitokondriel AKT1 moduleret mitokondrier respiration og ATP produktion i nyretubuli
For at undersøge den direkte rolle af mitokondriel AKT1 i renale tubulære epitelceller, isolerede vi primære renal tubulære epitelceller (RTE) fra KMDAKT-mus. Analyse af cellepræparater med et antistof mod den proksimale tubulære epitelcellemarkør aquaporin 1 (aquaporin1) viste, at 97 procent af RTE-cellerne udtrykte denne markør (ved direkte celletælling under mikroskop). 72 timer efter 4-OH TAM eller vektorbehandling blev RTE-celler først farvet med mitotisk sporstof rødt og derefter immunfarvet med anti-his-tag-antistof (grønt). Der var intet His-Tag-signal i vektorbehandlede celler, i overensstemmelse med det forventede fravær af mdnAKT-ekspression. I modsætning hertil er His-Tag blevet detekteret i 4-OH TAM-behandlede celler og co-lokaliseret med Mitotracker Red.
For at analysere, hvordan mitokondriel AKT1-signalering regulerer RTE-cellebioenergetik, brugte vi en hippocampal ekstracellulær analysator til at vurdere mitokondriel funktion. OCR angiver den målte værdi af oxidativ respiration. Den samlede basale respiration af KMDAKT RTE-celler behandlet med 4-OH TAM var signifikant højere end kontrol (p<0.001). den alternative respirationsprofil for KMDAKT RTE-celler dyrket med 4-OH TAM var også højere end kontrollen (p={{0}}.00076). den ATP-afhængige respirationsprofil for KMDAKT RTE-celler dyrket med 4-OH TAM var signifikant højere end kontrollen (p<0,001). højere protonlækage i 4-OH TAM-behandlede KMDAKT RTE-celler indikerede ukoblet respiration (p<0,001). reduceret ATP-produktion i KMDAKT-afledte RTE-celler efter 4-OH TAM-induktion. tam-induceret cellulær lipidperoxidation var signifikant højere, hvilket indikerer forhøjet ROS. Ændringerne i oxidativ phosphorylering var ikke forårsaget af ændringer i mitokondrieindhold i disse celler. I TAM-KMDAKT-nyrer observerede vi imidlertid højere niveauer af Drp1, en markør for mitokondriel fission, hvilket tyder på, at mitokondriel dynamik er reguleret. Disse resultater tyder på, at inhibering af mitokondriel AKT1-signalering fører til respiratorisk ukoblet mitokondriel dysfunktion, som sammen med reduceret ATP-produktion forværrer apoptose i KMDAKT-nyrer under IRI.
Vi undersøgte også, hvordan aktiveringen af mitokondriel AKT1 regulerer oxidativ phosphorylering i RTE-celler isoleret fra KMCAKT. Resultaterne viste den modsatte effekt af mitokondriel AKT1 sammenlignet med KMDAKT RTE-celler. Basal respiration, alternativ respiration, ATP-afhængig respiration, protonlækage og glykolytisk potentiale var lavere i celler dyrket med 4OH-TAM. Disse resultater tyder på, at mitokondriel AKT1-aktivering øger effektiviteten af oxidativ phosphorylering og reducerer respiratorisk frakobling. drp1-analyse viste lavere drp1-farvning i TAM-KMCAKT-nyrer, hvilket yderligere bekræftede højere drp1 i TAM-KMDAKT-nyrer og involvering af mitokondriel AKT1 i reguleringen af mitokondriel dynamik.
Cistanche pulver
Diskussion
Den nuværende undersøgelse viser, at IRI inducerer akut aktivering og translokation af AKT1 i mitokondrierne af proksimale tubulære epitelceller. Aktivering af mitokondriel AKT1 i den proksimale tubuli som reaktion på IRI ser ud til at repræsentere en selvbeskyttende mekanisme under iskæmi-reperfusion. Dette skyldes, at hæmning af tubulær mitokondriel AKT1 forværrer AKI og fremmer den efterfølgende udvikling af CKD efter IRI. Omvendt beskyttede forbedret tubulær mitokondriel AKT1-signalering nyren mod IRI og svækkede udviklingen af CKD. Disse data identificerer en ny rolle for den tubulære mitokondrielle AKT1-signalvej under udviklingen af nyresvigt efter nyreiskæmi-reperfusion.
Mitokondriers rolle i nyretubuli AKI
De fleste af de renale mitokondrier er placeret i de proksimale tubuli. Mitokondrier tjener som den vigtigste organel-metaboliserende ATP-produktion af næringsstoffer. Mitokondriel AKT1 regulerer cellulær oxidativ phosphorylering, ROS-produktion og celleoverlevelse Som vist i denne undersøgelse producerer nedsat mitokondriel AKT1-signalering ukoblet respiration og reducerer ATP-produktion. Selvom renal tubulær apoptose er et almindeligt fund i forskellige AKI-modeller, forbliver signalveje opstrøms fra mitokondrierne ufuldstændigt forståede. Renal IRI fører til induktion af apoptotiske gener og aktivering af Caspaser og endonukleaser, som bidrager til induktion af apoptotisk renal tubulær celleskade og død menes at være en nøglefaktor i udviklingen af AKI. Derudover menes tubulær reparation og regenerering at være de vigtigste begivenheder i AKI-genopretning. Selvom den subletale skade kan være reversibel, fører tubulær celledød til det uundgåelige tab af tubulær funktion In vitro- og in vivo-modeller er aktivering af begavede apoptotiske veje i AKI inklusive Bcl-2-proteinfamilien og mitokondrielle apoptotiske mekanismer blevet karakteriseret . Fraværet af mitokondrielle transmembrane elektrokemiske gradienter menes at være et centralt kontrolpunkt for udløsning af apoptose Mitokondriel protonlækage, reguleret af mitokondriel AKT1, kombineret med reduceret ATP-syntese i dette energikrævende organ kan bidrage til den overordnede balance af signalering til fordel for apoptose .
Standardiseret Cistanche
Krydstalen mellem nyretubuli og glomerulus
Anatomisk kan tubulær interstitiel skade føre til indsnævring af den glomerulære-tubulære forbindelse og til sidst dannelse af tubulære glomeruli, dvs. dysfunktion af glomerulære tubulære epitelceller uden åbenbar forbindelse til tubuli, kompression og obstruktion af tilstødende tubuli af den interstitielle matrix og transformation af murale epitelceller til fibroblastlignende celler er potentielle mekanismer for tubulær glomeruli-dannelse. Ufuldstændig reparation af RTE kan forekomme i den proksimale RTE, især i S1-regionen, som er følsom over for iskæmisk skade ved nyreskade, hvilket fører til tubulær atrofi og interstitiel fibrose.
Tubulær skade kan påvirke glomerulær filtrationsfunktion gennem tubulær-glomerulær feedback. Tubulær feedback er en fysiologisk krydstalemekanisme mellem tubuli og glomerulus. Lidt er kendt om rækkefølgen af hændelser efter AKI og forholdet mellem glomerulær filtrationshastighed og tubulære ændringer. I en klinisk undersøgelse antydede omfattende dannelse af tubulære glomeruli hos patienter med svær nyrearteriestenose, at kronisk iskæmi kan føre til strukturel skade og desintegration af nyretubuli. På den anden side er der rigelig evidens for, at renal tubulær dysfunktion kan føre til tab af tubulær cellepolaritet, tab af gap junctions, tubulær celledød, efterfølgende tubulær obstruktion og retrograd glomerulær skade.
Vores resultater giver ny indsigt i, hvordan mitokondrier er involveret i forsvar mod IRI-induceret nyreskade. hæmning af mitokondriel AKT1 under IRI fører til aktivering af caspaser og tubulær celledød, som kan udløse retrograd glomerulær apoptose, glomerulosklerose og nyrefibrose. Aktivering af mitokondriel AKT1 kan spille en vigtig rolle i overgangen fra AKI til CKD, da inhibering af mitokondriel AKT1 under IRI signifikant påvirker BUN/Cr 45 dage efter initial IRI.
Overgangen fra AKI til CKD
Den nøjagtige mekanisme for overgangen fra AKI til CKD er uklar. Histologisk er både AKI og CKD forbundet med renal tubulær skade I mange år har det været kendt, at renal tubulær interstitiel patologi er et træk ved mange typer CKD. Afbrydelse af intracellulær signalering i nyretubuli menes at spille en rolle i initieringen og progressionen af AKI til CKD.
Ved CKD aktiveres den transformerende vækstfaktor (TGF)-signalvej og fremmer glomerulosklerose og tubulointerstitiel fibrose ved at inducere produktionen af profibrotiske ekstracellulære matrixproteiner. TGF-signaleringens rolle i AKI er imidlertid inkonsekvent på tværs af eksperimentelle modeller. Vores data viser ikke. øget TGF-ekspression. Hypoxi aktiverer hypoxi-inducerbar faktor (HIF) til at regulere gentranskription i AKI, og den overordnede ekspression af HIF i forskellige eksperimentelle systemer udøver en genbeskyttende effekt, men andre undersøgelser har ikke kunnet bekræfte HIF's genbeskyttende rolle -1.
Cistanche kosttilskud
Aktuelle beviser tyder på, at mitokondrier kan være nøgleregulatorer i overgangen fra AKI til CKD. Ablation af pro-apoptotisk BAK og BAX forbedrer iskæmisk og cisplatin-induceret AKI. hæmning af mitokondriel fragmentering har vist sig at dæmpe sværhedsgraden af iskæmisk AKI hos diabetiske mus i en model af iskæmisk og nefrotoksisk AKI forbundet med høj aktivering af mitokondriel apoptose CKD-relateret hæmning af mitokondriel funktion og biogenese sensibiliserer nyreceller og væv over for AKI. gendannelse af AKI. Ved CKD forekommer renal mitokondriel dysfunktion også under starten og progressionen af CKD. Ved CKD inducerer høj glucose- og albuminoverbelastning apoptotisk mitokondriel signalering i nyreceller. I diabetes-induceret eksperimentel CKD er mitokondriel fragmentering resultatet af patologiske ændringer i mitokondriel fusion og fission.
Identifikationen af renal tubulær interstitiel histopatologi i patogenesen af CKD flytter Glomerulus Central-paradigmet for nyreskade til et nyt fokus på den patofysiologiske rolle af den proksimale tubuli i AKI og dens patogenese mod CKD,s. Vores resultater tyder på, at mitokondriel AKT1 indirekte kan forhindre udviklingen af glomerulosklerose ved at opretholde den strukturelle og funktionelle integritet af nyretubuli. Dataene i denne undersøgelse hjælper med at udfylde et vigtigt hul i viden om rollen af proksimale renale tubulære mitokondrier i AKI og dens efterfølgende overgang til CKD ved at aktivere og translokere AKT1 til mitokondrierne. Fremtidige undersøgelser bør bekræfte mitokondrielle AKT1's rolle i human nyreskade og udforske potentielle mål i den mitokondrielle AKT1-signalvej, der kan bruges til at forbedre resultatet af nyresvigt.
REFERENCER
1. Su CC, Yang JY, Leu HB, et al. Mitokondriel Akt-reguleret mitokondriel apoptose-signalering i hjertemuskelceller. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;302(3):H716–23.
2. Ratliff BB, Rabadi MM, Vasko R, et al. Budbringere uden grænser: mediatorer af systemisk inflammatorisk respons i AKI. J Am Soc Nephrol. 2013;24(4):529–36.
3. Basnakian AG, Ueda N, Kaushal GP, et al. DNase I-lignende endonuklease i rottenyrecortex, der aktiveres under iskæmi/reperfusionsskade. J Am Soc Nephrol. 2002;13(4):1000–7.
4. Bonventre JV, Yang L. Cellulær patofysiologi af iskæmisk akut nyreskade. J Clin Invest. 2011;121(11):4210–21.
5. Kinsey GR, Sharma R, Okusa MD. Regulatoriske T-celler i AKI. J Am Soc Nephrol. 2013;24(11):1720–6.
6. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Patofysiologi af iskæmisk akut nyreskade. Nat Rev Nephrol. 2011;7(4):189-200.
7. Zarjou A, Agarwal A. Sepsis og akut nyreskade. J Am Soc Nephrol. 2011;22(6):999-1006.
8. Saikumar P, Dong Z, Patel Y, et al. Rolle af hypoxi-induceret Bax-translokation og cytochrom c-frigivelse i reoxygeneringsskade. Onkogen. 1998;17(26):3401-15.
9. Wei Q, Dong G, Chen JK, et al. Bax og Bak har kritiske roller i iskæmisk akut nyreskade i globale og proksimale tubuli-specifikke knockout-musemodeller. Nyre Int. 2013;84(1):138–48.
10. Wolfs TG, De Vries B, Walter S, et al. Apoptotisk celledød initieres under normotermisk iskæmi i humane nyrer. Am J Transplantation. 2005;5(1):68-75.
11. Wang J, Wei Q, Wang CY, et al. Minocyclin opregulerer Bcl-2 og beskytter mod celledød i mitokondrier. J Biol Chem. 2004;279(19):19948-54.
12. Martinou JC, Grøn DR. At bryde mitokondriebarrieren. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2(1):63–7.
13. Green DR, Ferguson T, Zitvogel L, et al. Immunogen og tolerogen celledød. Nat Rev Immunol. 2009;9(5):353-63.
14. Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitokondriel membranpermeabilisering ved celledød. Physiol Rev. 2007;87(1):99–163.
15. Lan R, Geng H, Singha P, et al. Mitokondriel patologi og glykolytisk skift under proksimal tubuliatrofi efter iskæmisk AKI. J Am Soc Nephrol. 2016;27(11):3356–67.
16. Yang L, Besschetnova TY, Brooks CR, et al. Epitelcellecyklusstop i G2/M medierer nyrefibrose efter skade. Nat Med. 2010;16(5):535–43, 1p efter 143.
17. Singh P, Okusa MD. Rollen af tubuloglomerulær feedback i patogenesen af akut nyreskade. Bidrag Nephrol. 2011;174:12–21.
18. Morrell ED, Kellum JA, Hallows KR, et al. Epiteltransport under akut septisk nyreskade. Nephrol skivetransplantation. 2014;29(7):1312–9.
19. Weichert W, Paliege A, Provoost AP, et al. Opregulering af juxtaglomerulær NOS1 og COX-2 går forud for glomerulosklerose hos hypertensive rotter med fawn-hooded. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;280(4):F706–14.
20. Marcussen N Atubulære glomeruli ved nyrearteriestenose. Lab Invest. 1991;65(5):558-65.
21. Chevalier RL. Den proksimale tubuli er det primære mål for skade og progression af nyresygdom: rollen som glomerulotubulær forbindelse. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;311(1):F145–61.
22. Forbes MS, Thornhill BA, Chevalier RL. Proksimal tubulær skade og hurtig dannelse af tubulære glomeruli hos mus med unilateral ureteral obstruktion: et nyt kig på en gammel model. Am J Physiol Renal Physiol. 2011;301(1):F110–7.
23. Galarreta CI, Grantham JJ, Forbes MS, et al. Tubulær obstruktion fører til progressiv proksimal tubulær skade og tubulære glomeruli ved polycystisk nyresygdom. Am J Pathol. 2014;184(7):1957–66.
24. Grgic I, Campanholle G, Bijol V, et al. Målrettet proksimal tubuliskade udløser interstitiel fibrose og glomerulosklerose. Nyre Int. 2012;82(2):172-183.
25. Takaori K, Nakamura J, Yamamoto S, et al. Sværhedsgrad og hyppighed af proksimal tubuliskade bestemmer nyreprognosen. J Am Soc Nephrol. 2016;27(8):2393-2406.
26. Linkermann A, Chen G, Dong G, et al. Reguleret celledød i AKI. J Am Soc Nephrol. 2014;25(12):2689-701.
27. Nath KA. Tubulointerstitielle ændringer som en væsentlig determinant i udviklingen af nyreskade. Am J Nyre Dis. 1992;20(1):1-17.
28. Loeffler I, Wolf G. Transforming growth factor-beta og progression af nyresygdom. Nephrol skivetransplantation. 2014;29 Suppl 1(i37–i45).
29. Gewin L, Vadivelu S, Neelisetty S, et al. Sletning af TGF-beta-receptoren dæmper akut proksimal tubuliskade. J Am Soc Nephrol. 2012;23(12):2001-11.
30. Eckardt KU, Rosenberger C, Jurgensen JS, et al. Rolle af hypoxi i patogenesen af nyresygdom. Blood Purif. 2003;21(3):253-7.
31. Schley G, Klanke B, Schödel J et al. Selektiv stabilisering af HIF-1alfa i renale tubulære celler med 2-oxoglutarat-analoger. Am J Pathol. 2012;181(5):1595-606.
32. Higgins DF, Kimura K, Bernhardt W, et al. Hypoxi fremmer fibrogenese in vivo via HIF-1-stimulering af epitel-til-mesenkymal overgang. J Clin Invest. 2007;117(12):3810–20.
33. Jiang M, Pabla N, Murphy R, et al. Nutlin-3 beskytter nyreceller under cisplatinbehandling ved at undertrykke Bax/Bak-aktivering. J Biol Chem. 2007;282(4):2636-45.
34. Brooks C, Wei Q, Cho SG, et al. Regulering af mitokondriel dynamik ved akut nyreskade i cellekultur og gnavermodeller. J Clin-investeringen. 2009;119(5):1275-85.
35. Brooks C, Cho SG, Wang CY, et al. Fragmenterede mitokondrier sensibiliseres over for Bax-indsættelse og aktivering under apoptose. Am J Physiol Cell Physiol. 2011;300(3):C447–55.
36. Smith JA, Stallons LJ, Collier JB, et al. Undertrykkelse af mitokondriel biogenese gennem toll-lignende receptor 4-afhængig mitogenaktiveret proteinkinase/ekstracellulær signalreguleret kinasesignalering i endotoksin-induceret akut nyreskade. J Pharmacol Exp Ther. 2015;352(2):346–57.
37. Garrett SM, Whitaker RM, Beeson CC, et al. Agonisme af 5-hydroxytryptamin 1F-receptoren fremmer mitokondriel biogenese og genopretning efter akut nyreskade. J Pharmacol Exp Ther. 2014;350(2):257–64.
38. Whitaker RM, Wills LP, Stallons LJ, Schnellmann RG. cGMP-selektive phosphodiesterase-hæmmere stimulerer mitokondriel biogenese og fremmer genopretning efter akut nyreskade. J Pharmacol Exp Ther. 2013;347(3):626–34.
39. Granata S, Zaza G, Simone S, et al. Mitokondriel dysregulering og oxidativt stress hos patienter med kronisk nyresygdom. BMC Genomics. 2009;10:388.
40. Li X, Pabla N, Wei Q, et al. PKC-delta fremmer renal tubulær celle apoptose forbundet med proteinuri. J Am Soc Nephrol. 2010;21(7):1115–24.
41. Wang W, Wang Y, Long J, et al. Mitokondriel fission udløst af hyperglykæmi medieres af ROCK1-aktivering i podocytter og endotelceller. Celle Metab. 2012;15(2):186-200.
42. Lim BJ, Yang J, Zhong J, et al. Tubulointerstitiel fibrose kan sensibilisere nyren over for efterfølgende glomerulær skade. Nyre Int. 2017;92(6):1395-403.
43. Jablonski P, Howden BO, Rae DA, et al. En eksperimentel model til vurdering af renal restitution fra varm iskæmi. Transplantation. 1983;35:198-204.
Hugo YH Lin1,2,3,4, lækker Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, ping h. wang1,2,7
7. Department of Diabetes, Endocrinology, and Metabolism, City of Hope National Medical Center, Duarte, Californien