1. DEL Echinacosid øger sædmængden hos rotter ved at målrette mod den hypotalamiske androgenreceptor

Hvordan stimulerer echinacoside østrogen og øger sædceller?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Mandlig infertilitet er et stort sundhedsproblem med en anslået udbredelse på 4,2 procent af mandlig infertilitet på verdensplan. Vores tidlige arbejde viste, at Cistanche-ekstrakter beskytter mod sædskade hos mus og detechinacoside(ECH) er en af ​​de vigtigste aktive komponenter. Her rapporterer vi en væsentlig rolle forECH, et naturprodukt, der reverserer eller beskytter mod oligo som aspermi hos rotter.ECHblev analyseret ved HPLC, kvantiteten og kvaliteten af ​​sperm blev evalueret, og hormonniveauer blev bestemt ved radioimmu-sorbentassay. ECH reducerede niveauer af androgenreceptor (AR) og nøglesteroidogene-relaterede gener som bestemt ved Western blot og qPCR-analyse. Samspillet mellemECHog AR blev evalueret ved indirekte ELISA og molekylær docking. Resultaterne viser, at ECH kombineret med hypothalamus AR i lommen på Met-894 og Val-713 hæmmer overførslen af ​​AR fracytoplasmaet til kerner i hypothalamus. Mens negativ feedback af kønshormonregulering blev hæmmet, blev positiv feedback stimuleret for at øge udskillelsen af ​​luteiniserende hormon og testosteron, hvilket efterfølgende øgede mængden af ​​sæd. Tilsammen viser disse dataatECHblokerer AR-aktivitet i hypothalamus for at øge mængden af ​​sperm og beskytte mod oligo aspermia hos rotter.

For mere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

Produktionen af ​​testosteron i testikelceller er stærkt reguleret af hypothalamus-hypofyse-gonadeaksen (HPG) ved at danne en homøostatisk feedback-loop1. Gonadotropin-frigivende hormon (GnRH), der udskilles af hypothalamus, kan stimulere udskillelsen af ​​luteiniserende hormon (LH) fra hypofysen, hvilket yderligere stimulerer testosteronproduktionen i testikel Leydig-celler. Testosteron biosyntetiseres af en række steroidogene enzymer. Som en af ​​de vigtigste veje kan steroidogent akut regulatorisk (StAR) protein transportere kolesterol fra intracellulære kilder ind i mitokondrierne2, hvor det udsættes for kolesterolsidekædespaltningsenzym (CYP11A1), 3 -hydroxysteroiddehydrogenase (HSD3), { {10}}hydroxylase (CYP17A1) og 17-hydroxysteroiddehydrogenase (HSD 17), der katalyserer omdannelsen af ​​kolesterol til testosteron3,4. Testosteron feeds derefter negativt tilbage til HPG-elementet for at nedregulere yderligere LH-sekretion på en dosisafhængig måde.

Effekten af ​​testosteron på HPG-aksens feedback-loop opstår ved binding til androgenreceptoren (AR), der findes i både hypothalamus og hypofysen5. Hos musene forårsager ablation af AR og minimal testosteronproduktion niveauer af LH og follikelstimulerende hormon (FSH) til at stige6, hvilket tyder på, at AR deltager i reguleringen af ​​den negative fodringsløkke. Den klassiske genomiske mekanisme for testosteronsignalering opstår, når testosteron diffunderer ind i cellen og binder sig til AR. Dette ligand-receptorkompleks translokerer derefter til kernen, hvor det binder til androgenresponselementer (ARE'er) i de regulatoriske regioner af testosteron-responsive gener for at modificere deres translokation. Testosteron inducerer også den ikke-klassiske vej for steroidhormonvirkning, karakteriseret ved hurtige hændelser, der fører til aktivering af cytosoliske signalkaskader, der normalt udløses af vækstfaktorer7,8. Klassiske og ikke-klassiske testosteronveje bidrager begge til at opretholde spermatogenese og fertilitet. Funktionen af ​​AR er dog vigtigere i den klassiske vej, da testosteron virker til at øge sædkvaliteten.

Echinacoside(ECH) er en af ​​de bioaktive komponenter, der stammer fra lægeplantearterne Echinacea9 og Cistanche10. Med et bredt spektrum af farmakologiske aktiviteter er ekstrakter af Echinacea et af de mest populære urtetilskud i Europa og USA, hovedsagelig på grund af deres antioxidantegenskaber11 og deres evne til at forhindre almindelig forkølelse12. Interessant nok,Cistancheekstrakter ogECHer traditionelt blevet brugt som et styrkende middel til at helbrede reproduktiv dysfunktion og til at øge mandlig seksuel aktivitet i traditionel kinesisk medicin10. Nogle OTC-produkter af Cistanche-ekstraktion er blevet udviklet som nærende kosttilskud og vinder popularitet på helsekostmarkederne i Kina og nogle andre asiatiske lande (China Food and Drug Administration)13. Men de underliggende mekanismer vedECHhandling forbliver uklar. Mandlig infertilitet er et stort sundhedsproblem med en estimeret prævalens på 4,2 procent af mandlig infertilitet på verdensplan14. Diagnosen af ​​mandlig infertilitet er i øjeblikket baseret på undersøgelsen af ​​sædkvalitet, herunder analyse af sædparametre såsom sædkoncentration, motilitet og morfologi15. Den østrogen-efterlignende Bisphenol A (BPA) er en udbredt miljøforurenende stof, der er blevet undersøgt for sin indvirkning på mandlig fertilitet hos flere dyrearter og mennesker16. BPA forstyrrer hypothalamus-hypofyse-gonadeaksen, hæmmer ekspressionen af ​​testikelsteroidogene enzymer og syntesen af ​​testosteron i hanungerne17, hvilket forårsager en tilstand af hypogonadotrop hypogonadisme18. I denne undersøgelse undersøger vi effekterne afECHpå sædkvalitet og hormonniveauer. Derudover blev BPA valgt som et sædskademodel for yderligere at studere den beskyttende effekt afECHmod dårlig sædkvalitet.

Resultater ECH øger sædmængden. Sædtallene i cauda epididymis, sædlevedygtighed og sædmotilitet er vist i tabel 1. Behandling med 80 mg/kg ECH og 15 mg/kg testosteronpropionat (TP) øgede antallet af epididymale sædceller signifikant. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i sædlevedygtighed og sædmotilitet.

ECH øger testosteron- og LH-niveauerne i serum, encephalon plus hypofyse og testikler. ECH-behandling øgede især LH-niveauer i serum, encephalon plus hypofyse og testikler (fig. 1A). I ECH(H)-gruppen steg LH-niveauer signifikant med 1.1-fold i serum, 1.4-fold i encephalon plus hypofyse og 1.2-fold i testikler. Testosteron var signifikant øget med 1,5 og 1.{10} gang i henholdsvis encephalon plus hypofyse og testis, men ikke i serum efter ECH(H)-behandling. Efter TP-behandling var testosteronniveauerne signifikant øget med 1,6, 1,8 og 1.4-fold i serum, encephalon plus hypofyse og testikler.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP ændrede ikke signifikant ekspressionen af ​​CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 og HSD17. Dette afspejles i en omfattende heatmap-analyse af effekten af ​​ECH på steroidogent enzymekspression, hvilket indikerer, at ECH signifikant øgede mRNA-niveauer af CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 og HSD17, og især HSD3 1/ 2 (fig. 1C).

ECH kan krydse blod-hjerne-barrieren og i mindre grad blod-testis-barrieren. For at evaluere androgen-feedback-sløjfen ved HPG-aksen blev ECH's evne til at komme ind i hypothalamus evalueret i en række farmakokinetiske undersøgelser. ECH-koncentrationer blev påvist i hypothalamus efter 12 timers enkelt oral administration af 30mg/kg ECH, og ECH viste markant hypothalamus-penetrering med det gennemsnitlige hypothalamus/plasma-forhold på 33,92 procent (fig. 2A). Te T1/2-værdier var 2,61±0,42 timer og 1,88±0,22 timer i henholdsvis plasma og hypothalamus (fig. 2B). Meget begrænset adgang af ECH til testis blev imidlertid påvist ved hjælp af HPLC. Koncentrationerne af ECH i testiklerne var 0.083 ug/mL, 0,043 ug/mL og 0,028 ug/mL efter henholdsvis 0,5 t, 1 t og 1,5 t efter behandling .

ECH reducerer hypothalamus AR-translokation til kernen. For at teste virkningen af ​​ECH på AR-translokationen blev ekspressionen af ​​AR i cytoplasmaet og kernen af ​​testis og hypothalamus bestemt ved hjælp af western blot-analyse. Som vist i fig. 3A nedregulerede ECH AR-protein i hypothalamuskerner fem gange sammenlignet med kontrolgruppen. Behandling med enzalutamid, en AR-hæmmer, reducerede niveauet af AR-protein i hypothalamuskerner med 4.8-fold. Især var cytoplasmatisk AR højere med ECH-behandling og enzalutamidbehandling end kontroller, hvilket tyder på, at ECH blokerer AR-transport fra cytoplasmaet til kernen i hypothalamus. Som forventet hæmmer ECH ikke AR-transport fra cytoplasmaet til kernen i testiklen (fig. 3B).

ECH øgede udtryk for HPG-akse-relaterede gener. ECH øgede signifikant ekspressionerne af LH, LHR, GnRH 1 og Gnrhr i blandingspuljerne af encephalon plus hypofyse, dog var der ingen signifikant forskel i GnRH 1-niveauer efter TP-behandling. Heatmap-analysen viser, at udtryk for GnRH 1 og LH var højest blandt HPG-akse-relaterede gener.

AR er et mål for ECH. For at bekræfte forholdet mellem ECH og AR blev ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) syntetiseret med succes (fig. 5A, B). Molekylvægten af ​​ECH-OVA er større end OVA, så de har forskellige mobilitetshastigheder (fig. 5A), og absorbanstoppen for ECH-OVA er mellem ECH og OVA (fig. 5B).

hvilket tyder på, at ECH med succes blev konjugeret til OVA. Indirekte ELISA-resultater (fig. 5C) viser, at anti-AR-antistof er i stand til at påvise AR-protein til stede i brønde indeholdende ECH-OVA (indikeret med anti-OVA-antistof), hvilket tyder på, at ECH kan binde til AR-protein. ECH kombineres med AR-lomme af Met-894 og Val-713. Forbindelse ECH blev forankret til AF2-stedet på overfladen af ​​det humane AR, og den teoretiske bindingsmåde for ECH og AR blev vist i fig. 5D. Compound ECH adopterede en kompakt konformationsbinding ved lommen af ​​den menneskelige AR. De to phenylgrupper af ECH binder til det hydrofobe domæne af AR-lommen og opretholdt tætte hydrofobe kontakter med resterne Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 og Ile-898, hvorimod de to andre sider af ECH var placeret ved indgangen til lommen og kun havde få kontakter. Detaljeret analyse viste, at både Met-894 (bindingslængde: 2,4Å) og Val-713 (bindingslængde: 2,7Å) dannede hydrogenbindinger med hydroxy1-grupperne i ECH, som var hovedinteraktionen mellem ECH. og menneskelig AR. ECH dæmper BPA-induceret reproduktionsskade. For at undersøge effekten af ​​ECH på reproduktionsskader blev sædkvaliteten og niveauerne af kønshormoner og steroidogene enzymer undersøgt i BPA-inducerede mus. Som vist i fig. 6 reducerede BPA-behandling signifikant sædcelleantallet og sædmotiliteten med henholdsvis 26,5 procent og 39,2 procent. ECH-administration forhindrede faldet i sædtal og sædmotilitet med henholdsvis 35,5 procent og 30,1 procent. BPA-administration resulterede også i et signifikant fald i LH- og T-sekretion, og ECH øgede niveauerne af LH og T betydeligt med henholdsvis 24,1 procent og 18,3 procent sammenlignet med BPA-behandling alene (fig. 6A, B). mRNA-niveauerne af StAR, CYP17A1, 3 -HSD og 17 -HSD i BPA-ECH-behandling var signifikant øget sammenlignet med BPA-behandling (fig. 6C, D).