Del 3 undersøgelser har vist, at autofagi spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellulær LD-aflejring

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

ABSTRAKT

Nye beviser indikerer, at uventet aflejring af lipiddråber (LD) og peroxidation kan fremskynde organelle stress og spiller en afgørende rolle i patogenesen af ​​neurodegenerative sygdomme (NDD'er). I vores tidligere undersøgelse bekræftede vi, at kaempferol (Ka), et naturligt lille flavonoid-molekyle, udviste neurobeskyttende virkninger på mus med LPS-induceret Parkinsons sygdom (PD). Derudover har tidligere undersøgelser vist, at autofagi spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellulær LD-aflejring. I den aktuelle undersøgelse viste vi, at Ka beskyttede mod TH plus neuronalt tab og adfærdsmæssige underskud i MPTP/p-inducerede PD-mus, ledsaget af reduceret lipidoxidativ stress i substantia nigra pars compacta (SNpc). I dyrkede neuronale celler udviste Ka et relativt sikkert koncentrationsområde og undertrykte signifikant LD-akkumulering og cellulær apoptose induceret af MPP plus. Yderligere undersøgelse indikerede, at den beskyttende virkning af Ka var afhængig af autofagi, specifikt lipofagi. Kritisk fremmede Ka autofagi til at mediere LD-nedbrydning i lysosomer, som derefter lindrede lipidaflejring og peroxidation og den resulterende mitokondrielle skade, som følgelig reducerede neuronal død. Ydermere afskaffede AAV-shAtg5-medieret Atg5 knockdown de neurobeskyttende virkninger af Ka mod lipidoxidation i PD-mus.Cistanche til forbedring af hukommelsenDette arbejde viser, at Ka forhindrer dopaminerg neuronal degeneration i PD via inhibering af lipidperoxidationsmedieret mitokondriel skade ved at fremme læbeautofagi og giver en potentiel ny terapeutisk strategi for PD og relaterede NDD'er.

Klik venligst her for at vide mere

Introduktion

Parkinsons sygdom (PD) er en almindelig neurodegenerativ sygdom (NDD), der er patologisk karakteriseret ved det progressive tab af dopaminerge (DA) neuroner i substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Selvom den nøjagtige ætiologi og det naturlige forløb af denne sygdom endnu ikke er fuldstændig afklaret, er adskillige processer og dysfunktioner på systemniveau, herunder mitokondriefunktioner, dopaminhomeostase, neuroinflammation og autofagi, blevet impliceret i patogenesen af ​​PD [1, 2]. Nylige rapporter afslørede, at lipiddråber (LD)-relateret lipotoksicitet kan deltage i PD-patologi [3,4]. LD'er er meget dynamiske organeller, der kommer ud fra den endoplasmatiske reticulum (ER) membran og normalt tjener som intracellulære steder for neutral lipidlagring [5 ].LD'er har for nylig vist sig at spille en meget bredere rolle end lagring af fedtsyrer (FA) og deltager i mange sygdomme. (cistanche para que serve) For eksempel danner myeloide celler, herunder makrofager, leukocytter og eosinofiler, LD'er som reaktion på inflammation og stress,cistanche på kinesiskog LD'er er steder for inflammatorisk cytokinproduktion og -lagring og er yderligere involveret i antigenpræsentation og patogenclearance [6]. Det er vigtigt, at i åreforkalkning har LD-rige skumceller vist sig at være skadelige i alle stadier af sygdommen [7].

Cistanche kan forbedre immuniteten

Imidlertid er LD'er ikke blevet grundigt undersøgt i centralnervesystemet (CNS), med få artikler, der rapporterer den histologiske tilstedeværelse af LD'er i humant hjernevæv [8,9]. Alligevel kan LD'er have vigtige funktioner i hjernen, da nyere undersøgelser bekræftede, at aggregerede LD'er i glia accelererede neurodegeneration i en Drosophila-model [10]. Det er for nylig blevet rapporteret, at i mus, olierøde O-positive lipid-ladede celler, inklusive neuroner, gliafibrillært surt protein (GFAP)t-astrocytter og ioniseret calciumbindende adaptermolekyle-1 (IBA{{7} })t mikroglia, er til stede i mange hjerneregioner og har vist sig at deltage i aldersrelaterede processer [11]. Vores tidligere arbejde viste også øget LD-akkumulering i hjernen i en PD-musemodel [12]. Tilsammen tyder disse undersøgelser på, at LD'er kan være involveret i patogenesen af ​​PD såvel som andre NDD'er.

Normalt nedbrydes intracellulære LD'er i lysosomer og leverer FA'er til mitokondrier til deres forbrug som en alternativ energikilde i perioder med udtømning af næringsstoffer [13]. Imidlertid har neuroner en lav kapacitet til mitokondrielt FA-forbrug til energiproduktion [14]. Denne egenskab gør neuroner særligt følsomme over for LD-akkumulering og peroxidation. Desuden øger akkumuleringen af ​​LD'er FA-oxidationshastigheden og pålægger et vedvarende pres på den mitokondrielle elektrontransportkæde, hvilket øger produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) af elektrontransportkædekomplekser I og III [15] for at forstærke oxidativ stress. Lipidoverbelastning fører også til ROS-produktion af ekstramitokondrielle kilder såsom nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) oxidaser og andre oxidative enzymer. Kombineret med den nedsatte ekspression af antioxidantenzymer og den lave kapacitet til FA-forbrug i neuroner, medierer LD-akkumulering oxidativt stress og kan yderligere føre til mitokondriel skade, lysosomal dysfunktion, defekt autofagi og aktivering af inflammatoriske responser [16,17]. Medmindre de akkumulerede LD'er kan hæmmes eller fjernes, gennemgår meget aktive neuroner patofysiologi, hvilket giver anledning til neurodegeneration [17]. (cistanche penis) Beviser indikerer, at den lysosommedierede kataboliske proces kaldet autofagi spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​cellulær LD-homeostase i flere væv [17,18]. I detaljer,cistanche penis vækstLD'er kan selektivt sekvestreres i autofagosomer og leveres til lysosomer til nedbrydning af lysosomale sure lipaser, en proces, der specifikt er kendt som lipofagi [19]. Derfor kunne målretning af LD'er og deres autofagiske fjernelsesvej repræsentere en ny tilgang til håndtering af neurodegeneration.

Studiet af naturlige produkter og diætmidler som kilder til potentielle NDD-behandlinger og strategier har fået enorm interesse i de senere år [20]. Kaempferol (Ka) er et naturligt polyphenolisk lille molekyle, der kan findes i en række kinesiske lægeurter og kostkilder [21]. Ka er blevet rapporteret at udøve antibakterielle, anti-aldrings- og immunmodulerende virkninger såvel som antioxidant- og neurobeskyttende aktiviteter [20,22,23]. Tidligere blev Ka rapporteret at hæmme inflammation i BV2 mikrogliaceller in vitro [24] og øge modstanden af ​​DA neuroner mod neuroinflammation in vivo [25]. Effekten af ​​Kaon LD'er i PD er dog endnu ikke undersøgt.

I betragtning af vigtigheden af ​​LD'er og den intime forbindelse mellem LD'er, mitokondrier og autofagi [16], som alle er involveret i PD, antager vi, at Ka hæmmer LD peroxidation og forhindrer DA neurodegeneration i PD. I denne undersøgelse viste vi, at Ka signifikant beskyttede mod neurodegeneration i en murin PD-model ved at hæmme LD-akkumulering. (cistanche pulver) Yderligere undersøgelse afslørede, at Ka udløste autofagi og reducerede akkumuleringen af ​​oxiderede LD'er for at lindre mitokondriel dysfunktion og mitokondriel ROS (mtROS) produktion og derved forhindre neuronal apoptotisk død.cistanche propiedadesResultaterne opnået i denne undersøgelse kan hjælpe med at styre kliniske beslutninger vedrørende brugen af ​​det naturlige molekyle Ka i NDD'er såsom PD.

2. Materialer og metoder

2.1. Forsøgsdyr

C57BL/6J-mus (han, 4-måned gamle) blev opnået fra Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosMus blev vedligeholdt og opdrættet i Animal Resource Center på Det Medicinske Fakultet, Nanjing Medical University og i dyrefaciliteten på Nanjing Drum Tower Hospital. Mus har fri adgang til mad og vand i et rum med en omgivelsestemperatur på 22 grader ±2 grader og en lys/mørke-cyklus på 12:12 timer. Alle dyreprocedurer blev udført i nøje overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health Guide for pleje og brug af laboratoriedyr.

2.2.Reagenser

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 procent,96.353) for in vitro eksperimenter blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) og DHE (D11347) blev købt fra Thermo Fisher Scientific. Til dyreforsøg blev Ka opløst i en opløsning af 10 procent DMSO i 16 procent SBE- -CD i sterilt saltvand. Til celleforsøg blev Ka fremstillet i DMSO (Sigma-Aldrich) og PBS (endelig DMSO-koncentration er 0,01 procent), pH 7,4.

2.3. Induktion og behandling af methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)-induceret PD-musemodel

For at evaluere virkningerne af Ka i PD-modellen for MPTP/p-toksicitet blev mus (han, i alderen 4-5 måneder gamle) tilfældigt opdelt i saltvandsbehandlede gruppe, MPTP-behandlede gruppe, MPTP plus Ka-behandlede gruppe , og Ka alene behandlet gruppe. I den MPTP-behandlede gruppe modtog mus kronisk MPTP-administration med en protokol svarende til den tidligere beskrevet [26]: MPTP blev opløst i saltvand og injiceret subkutant ved 25 mg/kg efterfulgt af 250 mg/kg probenecid (opløst i dimethylsulfoxid) intraperitoneal (ip) injektion med intervaller på 1 time hver 3,5 dag over en periode på 5 uger. (cistancherod) Kontrolmus modtog saltvand og probenecid-injektion. I den MPTP plus Ka-behandlede gruppe modtog mus Ka (50 mg/kg, en enkelt injektion/dag under eksperimenter, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kina) intraperitonealt (ip) dagligt 3 dage før behandling med MPTP og over de 5 MPTP injektionsuger. En uge efter den sidste MPTP-injektion blev mus udsat for adfærdstest, blindet for grupper. Derefter blev alle mus bedøvet med 40 mg/kg natriumpentobarbital og aflivet til påvisning af hjerneproteiner og immunhistokemi eller qPCR-analyse.

2.4. In vivo stereotaksisk kirurgi og eksperimentelle behandlinger

Stereotaksisk kirurgi under natriumpentobarbital anæstesi (40 mg/kg, ip) blev udført som beskrevet [25]. Muse-Atg5 og kontrol-shRNA blev transficeret med pakningsvektorer (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP) for at generere AAV. Til mikroinjektion anbringes bedøvede mus i et stereotaksisk apparat. De blev injiceret med 1 μL AV ved hjælp af glaselektrode rettet mod DG (AP:-0.3mm; ML: ±0.13mm; DV:-0.45 mm） med en hastighed på 0,25 μL/min. Derefter blev nålen tilbageholdt i yderligere 2-min. 2 uger efter virusmikroinjektion, blev mus udsat for MPTP-induceret PD-modelledning og (eller) Ka-behandling.

Atg5 shRNA blev opnået fra Hanbio Biotechnology (Shanghai, Kina) Co., Ltd. Til Atg5 stilheden blev primerne vist i supplerende tabel 1.

2.5. Adfærdsanalyse

En uge efter den endelige injektion af MPTP eller saltvand blev rotarod-testen og pole-testen udført som beskrevet før [27]. Til rotarod-testen blev mus akklimatiseret til rotarod i to forsøg (6 minutter med en accelereret hastighed på 12-20 rpm) pr. dag i 2 på hinanden følgende dage før starten af ​​eksperimentet. Derefter blev musene testet ved 20 rpm i 300 s i andre 3 på hinanden følgende dage. Latensen til at falde blev registreret ved hjælp af Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Kina). Til stangtesten blev mus placeret med hovedet op på toppen af ​​en lodret træstang (ru overflade, højde 50 cm, diameter 1 cm). Alle mus blev vænnet til apparatet 2 dage før testning og derefter testet tre gange på den tredje dag. Den samlede tid (T-total, indtil musen nåede gulvet med sine fire poter) og vendetiden (T-vending, for musen at dreje hovedet helt nedad) blev registreret. Forsøget blev blindet for musegrupper for hver adfærdstest, og testen blev udført tre gange.

2.6. Indsamling af hjerneprøver

Efter de sidste adfærdstest blev mus bedøvet med natriumpentobarbital (40 mg/kg, ip). Til qPCR, western blotting og højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse blev hele hjernen hurtigt ekstraheret fra dyr, derefter blev mellemhjernen og striatumvævet hurtigt dissekeret, forfrosset med flydende nitrogen. Alle prøver blev opbevaret ved -80 grad indtil analyse.

Til immunhistokemisk analyse blev mus perfunderet trans-kardialt med 4 procent paraformaldehyd (PFA). Hjerner blev ekstraheret, postfikseret, dehydreret, indlejret i OCT (Tissue-Tek), og serielle sektioner af hjernerne blev kryosektioneret (30 μm pr. skive) gennem hvert hele stratum og mellemhjernen ved hjælp af en frysemikrotom (Leica CM1950, Nussloch, Tyskland ). Alle sektioner blev samlet i seks separate serier, og hjerneskiver blev opbevaret i 50 procent glycerin og frosset i -20 grad indtil analyse.

Til TEM blev mus perfunderet med 2,5 procent glutaraldehyd og 2 procent paraformaldehyd som beskrevet 【12】. En lille portion (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunhistokemisk analyse

Hjerneskiver blev skyllet i PBS efterfulgt af 3 procent H2O2 i 10 min og derefter inkuberet med 0.3 procent Triton X-100 i PBS suppleret med 5 procent BSA i 1 time. Derefter blev objektglassene inkuberet med de primære antistoffer ved 4 grader natten over i PBS indeholdende 5 procent BSA ved 4 grader natten over, derefter vasket og inkuberet i sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af inkubation med diaminobenzidin (DAB) eller montering i DAPI (Life Technologies, Cat P36931) som immunfluorescerende farvning i 5 min. Til Nissl-farvning blev objektglassene slået sammen i cresylviolet (CV) opløsning (0,1 g cresylviolet, 99 ml H20 og 1 procent eddikesyre 1 ml) i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter dehydreret med alkohol og xylen. Billeder blev observeret, og fotografier blev taget under et Olympus BX52-mikroskop (Olympus America Inc., Melville, NY, USA). Det samlede antal TH-positive og Nissl's-positive neuroner i SNpc blev opnået serologisk ved at bruge den optiske fraktioneringsmetode med MicroBrightField Stereo-Investigator-software (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7.Højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse

Striatalprøver fra mus blev homogeniseret med {{0}},1 M perchlorsyre (1 mg væv i 100μL perchlorsyre) og 0,1 mM EDTA, behandlet med ultralyd og centrifugeret ved 20,000 rpm i 30 minutter som rapporteret [27]. Derefter blev supernatantvæsker opsamlet til måling. Den mobile fase er en blandet opløsning bestående af 90 mM monobasisk natriumphosphat, 1,7 mM 1-oktansulfonsyre, 50 mM citrat, 50 uM EDTA, 10 procent acetonitril med en strømningshastighed på 0,2 ml/min. Parallelt blev der til kvantitativ standardkurveberegning fremstillet stamstandardopløsning for dopamin og dihydroxy-phenyleddikesyre (DOPAC) (Sigma-Aldrich, USA) i 0,1 M HClO4. En mængde på 10 ul klargjort supernatant eller standardopløsning blev injiceret ind i den mobile fase og testet af ESA Coulochem III elektrokemisk detektor (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific) Prøver blev målt og toppe blev kvantificeret. Koncentrationerne af monoaminer blev kvantificeret ved at sammenligne med standarden ved hjælp af ClarityChrom software (Knauer, Tyskland) og derefter indholdet i stratumet blev omregnet i henhold til fortyndingsforholdet Standardkurven for DA og DOPAC blev vist i Supplerende Fig. 1a og b.

2.8. Cellekulturer og behandlinger

Mesencephaliske primære neuronkulturer blev udført som beskrevet tidligere [12]. Kort sagt blev det mesencefaliske væv fra C57BL/6-mus på embryonal dag 14/15 (E14/15) forsigtigt fjernet, mekanisk dissocieret for at fjerne membranerne og store blodkar, og derefter dissekeret. Derefter blev de fordøjet med trypsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) og derefter filtreret gennem et 100-um-filter for at opnå en enkeltcellesuspension. Efterfølgende blev cellerne udpladet på poly-L-lysin-præcoatede 12-/24-brøndsplader ved 2,5 × 10 graders celler/ml indeholdende neurobasalt medium (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) suppleret med B27 (2 procent v:v, Cat 1750404, GibcoTM) og penicillin/streptomycin (0,5 procent v:v). Kulturerne blev holdt i et befugtet kammer (37 grader, 5 procent CO2 inkubator). Dyrkningsmediet blev skiftet hver 3. dag, og cellerne kan bruges efter 7-10 dage.

Cellelinjer: SH-SY5Y-cellelinjer blev dyrket i 10 procent FBS og 1 procent penicillin/streptomycin i en fugtig inkubator ved 37 grader og 5 procent CO2. I eksperimenterne blev SH-SY5Y-celler behandlet med MPP plus (200 μM) eller forskellige doser af Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) i 24h.Ka(3,10,30,60μM,3h）primet-SH- SY5Y-celler blev stimuleret med MPPt (400 μM) i 24 timer. Ka (30 μM, 3 timer) med (eller uden) 3-MA (3 mM, 1 h) eller -tocopherol (50 μM, 7 t. ）primede-SH-SH5Y-celler blev stimuleret med MPPT (200 μM) i 24 timer.

2.9. Cellelevedygtighed CCK8-assay

Den ændrede cellelevedygtighed af Ka-behandling blev detekteret af Cell Counting Kit-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Kort sagt blev SHSY5Y-celler udsået i en 96- brøndplade og derefter behandlet med forskellige koncentrationer af Ka（3,30,60,100,300,600,600 uM）i 24 timer. Derefter blev 10 ul CCK-8-reagens tilsat til hver brønd i 4 timer. Endelig blev absorbansen detekteret af Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) ved 450 nm.

2.10. ATP assay

De cellulære ATP-niveauer blev detekteret af et ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Kina) ifølge producentens instruktioner. Efter behandling blev celler lyseret og centrifugeret ved 12,000 rpm i 5 minutter ved 4 grader, og supernatanterne blev opsamlet. Arbejdsopløsning (100 μL) blev tilsat til 20 μL prøve i 96-brøndpladen, og luminescensen blev målt med det samme på en automatiseret mikropladelæser. Målinger fra alle prøver blev normaliseret til proteinkoncentration.

2.11. Na plus -K plus -ATPase assay

Til Nat-K plus -ATPase-måling (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kina) blev celler sonikeret og centrifugeret ved 600 rpm i 10 minutter for at erhverve supernatant. Reaktionsopløsninger af Nat-Kt-ATPase-detektion blev tilsat og inkuberet i overensstemmelse med producentens instruktioner. Derefter blev absorbansen ved 660 nm detekteret. Målinger af alle prøver blev normaliseret til proteinkoncentration.

2.12. Western blotting analyse

Celler eller hjernevæv blev lyseret i RIPA-bufferen (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl,1 procent NP-40 (FNN0021,Thermo),0,5 procent natriumdeoxycholat (D6750, Sigma),0,1 procent SDS (74255, Sigma) suppleret med protease og fosfataseinhibitorer (Roche, Shanghai, Kina). Proteinkoncentrationer blev bestemt med Micro BCA Kit (Beyotime, Shanghai, Kina). Et 30-ug-protein fra hver prøve blev adskilt ved SDS-PAGE under anvendelse af polyacrylamid-TGX-geler (Bio-Rad, Hercules, Californien, USA) og derefter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF)-membraner (Millipore, Bedford, MA). Efter blokering blev PVDF-membraner inkuberet med forskellige specifikke primære antistoffer i TBST ved 4 grader natten over, derefter vasket og inkuberet i tilsvarende peberrodsperoxidase (HRP) konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Immunoreaktive bånd blev visualiseret og detekteret ved forstærket kemiluminescens (ECL) plus detektionsreagens (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og analyseret ved hjælp af ImageQuantTM LAS 4000 billeddannelsessystem (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. Kvantitativ (Q)- og revers transkription (RT)-PCR i realtid

Total RNA blev ekstraheret fra hjernevæv og dyrkede celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Omvendt transkription blev udført under anvendelse af TAKARA PrimeScript RT-reagenskittet (TaKaRa, Japan). Realtime qPCR blev udført ved hjælp af SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) i et StepOnePlus-instrument (Applied Bio-systems). Primerne blev købt og valideret af generalen (Shanghai, Kina). Primerne anvendt til qPCR blev vist i supplerende tabel 2.

Denne artikel er uddraget fra Redox Biology 41 (2021) 101911