Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Venligst klik her til del 1

Cistanche urt har en meget god neurobeskyttende effekt

2.6. Anti-apoptotiske virkninger af cytokininer bestemt af caspase-3/7 aktivitetsmålinger

Som vist af PI-farvningsassays beskrevet ovenfor, inducerede SAL stigninger i SH-SY5Y-cellernes dødsrater. Da SAL er forbundet med både apoptose og nekrose [51] undersøgte vi også aktiveringen af ​​caspase-3 og 7 (casp-3/7) som en specifik markør for apoptose (udførelsesfasen) [52] efter at have udsat cellerne for CK'er. Caspase-3/7 aktiviteter registreret efter behandling med hver af testforbindelserne blev normaliseret i forhold til dem, der blev registreret efter behandling med 50{{30}} uM SAL (sat til 100 procent). Som vist i figur 4 hæmmede den velkendte caspasehæmmer Ac-DEVD-CHO (inkluderet som en specifik, apoptose-relateret kontrol) kraftigt caspase-3/7 aktivitet ved sub-mikromolære koncentrationer (til 36,3 ± 2,66 og 25,2) ± 2,69 procent af niveauerne i celler behandlet med SAL alene ved henholdsvis 0,05 og 0,5 uM). Lignende niveauer af hæmning er tidligere blevet observeret [53] i forskellige in vitro SH-SY5Y celle-baserede modeller af neurodegeneration. Den positive kontrol NAC reducerede også signifikant caspase-3/7 aktivitet til 88,7 ± 1,87 procent og 78,5 ± 2,56 procent af SAL-inducerede niveauer ved henholdsvis 100 uM og 1000 uM. De testede CK'er havde en bred vifte af effekter på caspase-3/7-aktiviteter. Interessant nok fra CK-ribosiderne havde kun cZR signifikante effekter på aktiviteterne ved 0,1 uM (reducerede dem til henholdsvis 83,3 ± 4,33 procent af SAL-inducerede niveauer), mens iPR ved 1 uM ikke havde signifikant reduktion af casp{{60} ,7. Endelig reducerede K3G caspase-3/7 aktivitet med maksimal effekt ved 10 uM (til 81,7 ± 4,31 procent af det SAL-inducerede niveau). Samlet set inducerede SAL en 1.6-fold stigning i caspase-3/7-aktivitet sammenlignet med raske kontrolceller (CTR, figur 4), i overensstemmelse med resultaterne af en tidligere undersøgelse, hvor en lignende SAL-koncentration (400 uM) og den samme cellelinje blev anvendt [54]. NAC er kendt for at påvirke caspase-3/7-aktivitet i flere modeller afneuronaldød [55-58]. Resultaterne præsenteret her giver dog den første demonstration af deres caspase-3/7 i en SH-SY5Y cellebaseret SAL-induceret model afneuronaldød. Den positive kontrol reducerede caspase-3/7-aktiviteten induceret af 500 uM SAL på samme måde som CK'er, men cZR og K3G var effektive selv ved submikromolære eller mikromolære koncentrationer. Andre undersøgelser med stressmodeller forbundet med PD (proteasomhæmmer MG 132- eller H2O2-induceret toksicitet i SH-SY5Y-celler [17] og fibroblaster [15]) og Huntingtons sygdom (serum-sultmodel i PC12-celler [19]) har også vist, at CK'erne K og tZR kan have anti-apoptotiske (caspase-3) aktiviteter [17], og at både K og tZR kan have anti-ældende aktiviteter [17,19] . Desuden er der sammenhænge mellem faldende casp-3,7 aktivering ogneurobeskyttendeaktivitet blev rapporteret for SAL og SAL-relaterede modeller [54,59,60].

Figur 4. Caspase-3/7 aktivitet i den SAL-inducerede model af PD. Tredobbelt på mindst fire uafhængige dage. * P sammenlignet med køretøjet med 500 uM SAL, # P sammenlignet med køretøjet uden 500 uM SAL.

2.7. Identifikation af cytokinin neurobeskyttende aktivitet i den glutamat-inducerede celledødsmodel

Da SH-SY5Y-celler ikke udtrykker alle NMDA-receptorunderenheder [61], er den mest sandsynlige mekanisme for glutamat (Glu) toksicitet blokering af cystin/glutamat Xc-antiporteren med massiv induktion af oxidativt stress [62]. Tidligere forfattere har allerede påvist en sammenhæng mellem glutamat-induceret celledød og nekroptose i SH-SY5Y-celler [63] og vigtigheden af ​​caspase-3-aktivering i glutamat-induceret toksicitet over for dem [62,64]. Adskillige undersøgelser har også vist forekomsten af ​​jerndrevet celledød (ferroptose) efter glutamatforgiftning [62,65,66], og indikerede forekomsten af ​​tre typer celledød (nekroptose, apoptose og ferroptose) efter blokade af Xc. -antiporter system. For at gennemføre en omfattende evaluering afneurobeskyttendede testedes potentialecytokininer, blev det glutamat-inducerede celledødsassaysystem inkluderet i et analytisk panel med det kendteneurobeskyttendejernchelator deferoxamin (DFO) og inhibitor af nekroptose nekrostatin-1 (NEC-1) [67] som positive kontroller. Her blev SH-SY5Y-celler differentieret i 48 timer, derefter behandlet med 160 mM Glu eller i sambehandling heraf med forskelligecytokininkoncentrationer ({{0}}.1-10 uM) i 24 timer og farvet med PI. I denne model var virkningen af ​​Glu på celledød 100 procent PI-signal, så reduktionen i celledød med testforbindelserne blev evalueret. Glu inducerede næsten en 4-fold stigning i celledød sammenlignet med raske SH-SY5Y-kontroller (26,1 ± 0,42 procent). Screening af positive kontroller ogcytokininerviste, at både positive kontroller NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 procent) og DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 procent) reducerede celledøden induceret af glutamat. Som vist i figur 5A, fra panelet afcytokininer, kun trecytokininervar i stand til at beskytteneuron-lignende SH-SY5Y-celler på en lignende måde som positive kontroller. De mest aktivecytokininervar trans-zeatin (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 procent; 1 uM, 81,3 ± 2,77 procent) og cis-zeatin (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29 procent ; 1 uM, {{20}},2 ± 2,89 procent ) og kinetin (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 procent ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 procent). For at bekræfte deres lovende aktivitet blev et ortogonalt assay brugt til mere detaljeret at belyse CK'ers biologiske virkninger i denne model: En lactatdehydrogenase (LDH)-frigivelsesanalyse [68], som også viste en dramatisk (4-fold) stigning i toksicitet efter Glu-behandling. Interessant nok tillod bestemmelsen af ​​LDH-frigivelse os at skelne mellem aktiviteterne af CK'er og de positive kontroller (NEC-1 og DFO). CK'erne havde moderat, men signifikant beskyttende aktivitet (tZ reducerede dødsraterne til 91,9 ± 1,40 procent ved 0,1 uM; cZ reducerede dem til 92,3 ± 1,15 procent ved 0,1 uM og 91,7 procent ± 1,56 procent ved 1 uM; K2 reducerede dem til 92,3 ± 1,15 procent ved 0,1 uM og 91,7 procent ± 1,56 procent ved ±92.2. 1,06 procent ved 1 uM). De positive kontroller NEC-1 og DFO havde stærkere beskyttende virkninger, men var effektive ved meget højere koncentrationer (reducerede hastighederne til 76,9 ± 2,94 procent og 81,6 ± 3,74 procent ved henholdsvis 50 og 10 uM) (Figur 5B). LDH-assayet validerede indikationerne opnået med PI-farvning, og de observerede effekter af de positive kontroller var i overensstemmelse med publicerede data [69,70]. Fund vedrørende virkninger af K i den Glu-inducerede celledødsmodel i HT22-celler [18] og vores observationer af virkninger af repræsentative CK'er såsom tZ, cZ og K viser, at CK'er er lovende kandidater til behandling af neurodegenerative sygdomme forbundet med oxidativt stress. 71]. Endelig blev tZ og cZ foretrukket, fordi de var effektive ved lavere koncentrationer og blev udvalgt sammen med K til yderligere undersøgelser af deres virkninger på niveauer af oxidativ stress og caspase-3,7-aktivering.

cistancheanmeldelserpå virkningerne afneurobeskyttelse

2.8. Virkninger af cytokininer på glu-induceret oxidativ stress i SH-SY5Y-celler

I modsætning til den tidligere model kan Glu inducere oxidativ stress i SH-SY5Y-celler ad forskellige veje. Den ene er baseret på blokering af Cystin/glutamat (Xc-) antiporteren, hvilket fører til glutathion (GSH) udtømning og negative effekter på superoxiddismutase (SOD) aktivitet [62]. Glu-medieret celledød involverer formodet også Rac-NADPH-oxidase-drevet ROS-dannelse (især superoxidradikal) i SH-SY5Y-celler [72]. Disse fund indikerer, at den primære årsag til celledød i den Glu-inducerede model er OS. Inden for modellen,neuron-lignende celler blev co-behandlet med Glu og testede forbindelser, farvet med DHE og observeret ved fluorescensmikroskopi. Som det kan ses i figur 6A, blev der observeret en dramatisk stigning i rød DHE-fluorescens i Glu-behandlede celler, som blev forbedret af de positive kontrolstoffer og testede CK'er. Baseret på mikroskopiobservationen blev kvantificeringen af ​​superoxidniveauer udført i Glu-inducerede celler på en lignende måde ved DHE-assayet som dem i SAL-inducerede celler. Resultaterne blev normaliseret med hensyn til niveauer induceret af Glu alene (sat til 100 procent ), hvilket forårsagede en dramatisk, næsten 3-fold stigning i superoxidniveauer inden for kun 4 timer ineuron-lignende SH-SY5Y-celler i forhold til niveauer i raske kontrolceller (CTR: 33,79 ± 1,45 procent). Som vist i figur 6B reducerede CK'er såsom tZ, cZ og K superoxidniveauet i glu-berusede celler signifikant: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM og 10 uM K reducerede det til 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 og 83,8 ± 2,32 procent af niveauerne i celler behandlet med Glu alene. Disse niveauer er sammenlignelige med dem, der opnås med nekroptosehæmmeren NEC-1 (80,5 ± 3,19 procent ved 5 uM og 80,4 ± 2,70 procent ved 50 uM) og jernchelator DFO (80,2 ± 3,80 procent ved 10 uM). Resultaterne opnået med den Glu-inducerede celledødsmodel, især virkningerne af positive kontroller, er i overensstemmelse med tidligere rapporter [70,73]. Tidligere beviser for, at CK'er har OS-reducerende virkninger i Glu-inducerede eller lignende modeller er begrænset til en demonstration af, at K er et potent OS-reducerende middel (ved ca. 23 uM) i den HT22-celle-baserede Glu-inducerede celledødsmodel [18 ]. Vi fandt ud af, at K havde en OS-reducerende effekt ved lavere koncentrationer (1-10 uM) i vores SH-SY5Y-celler. Derudover er gavnlige langsigtede virkninger af tZ på humane fibroblaster, herunder hydrogenperoxid-nedbrydende aktivitet, blevet observeret [15], hvilket tyder på, at tZ og cZ kan have indirekte OS-reducerende effekter i Glu-inducerede celledødsmodeller. Derudover påpegede andre rapporter sammenhængene mellem CKs-medieret OS-reducerende effekt og beskyttende aktivitet [22,74-76]. Tilsammen viste tZ, cZ og K overraskende stærke OS-reducerende effekter, sammenlignelige med positive kontroller, på trods af forskellige styrker genereltneurobeskyttendeeffekt.

Figur 5. (A) Dødsrate påneuron-lignende SH-SY5Y-celler i glutamat (Glu)-induceret model for celledød; (B) Glu-induceret toksicitet (LDH-frigivelse) afneuron-lignende SH-SY5Y-celler. Tredobbelt på mindst tre uafhængige dage.* P sammenlignet med vehikel med 160 uM Glu, # P sammenlignet med vehikel uden 160 uM Glu.

Figur 6. (A) Glu-induceret oxidativ stress (OS) og OS-reducerende aktivitet af indikerede forbindelser hos menneskerneuron-lignende SH-SY5Y celler visualiseret ved fluorescensmikroskopi efter dihydroethidium (DHE) mærkning. Barer=50 um. Billeder viserneuron-lignende SH-SY5Y-celler behandlet med DMSO (kontrol), 160 mM glutamat (Glu) alene og sammen med: 10 uM deferoxamin (plus DFO), 50 uM nekrostatin{{6} } (plus NEC-1), 0,1 uM tZ (plus tZ) og 0,1 uM cZ (plus cZ) i 4 timer, derefter farvet med DHE. (B) Glu-induceret superoxidradikaldannelse ineuron-lignende SH-SY5Y-celler efter 4 timer. Grafen viser kvantificeringen af ​​DHE-farvede celler ved hjælp af Infinite M200 Pro mikropladelæser (Tecan, Østrig). Tredobbelt på fem uafhængige dage.

* P sammenlignet med vehikel med 160 uM Glu, # P sammenlignet med vehikel uden 160 uM Glu.

2.9. Virkninger af cytokininer på Caspase-3/7-aktivitet i den glu-inducerede celledødsmodel

Glu har lignende toksiske effekter på SH-SY5Y-celler som tidligere rapporterede effekter på HT22-celler forbundet med Xc-antiporter-blokering. Således er ikke-apoptotiske celledødsmekanismer (ferroptose, nekroptose osv.) involveret i begge tilfælde [62], selvom ekspression af caspase-3 og til en vis grad NMDA-underenheden af ​​NR1 kan forekomme kraftigere i SH -SY5Y celler [61]. Derfor kan de sidste stadier af celledød i de to cellelinjer være forskellige. En medvirkende rolle af caspase-3-aktivitet er blevet observeret i mange undersøgelser i den Glu-inducerede model for celledød af SH-SY5Y-celler [62,77-79]. I denne analyse,neuron-lignende SH-SY5Y-celler blev her behandlet med 160 mM Glu, hvilket fører til forhøjelse af caspase-3/7-aktivitet. I bestræbelserne på at belyse apoptoses rolle i Glu-induceret død af SH-SY5Y-celler blev en specifik caspase-3/7-hæmmer, Ac-DEVD-CHO, anvendt og fundet at have en stærk hæmmende effekt: Ved 50 nM reducerede det caspase-3,7 aktivitet til 23,70 ± 1,01 procent af niveauet i behandlede celler

med Glu alene og ved 0,5 uM blokerede det næsten fuldstændigt for aktiviteten (reducerede den til et normaliseret niveau på kun 7,22 ± 1,05 procent; sammenlignelig med niveauet observeret i raske celler:

7,8 ± 0,39 procent), som vist i figur 7. Anvendelse af positive kontroller resulterede i et gradvist dosisafhængigt fald i caspase-3,7 aktivitet. Interessant nok havde NEC-1 en lille effekt med maksimal effekt ved 50 uM, og DFO havde mere robust hæmmende aktivitet ved 10 uM (reducerede aktiviteten til 80,5 ± 1,85 og 75,8 ± 3 .00 procent henholdsvis). På den anden side blev der kun opnået små, men signifikante effekter på casp-3,7 ved tZ ved 1 uM (89,5 ± 2,50 procent), cZ ved 0,1 uM (87,4 ± 1,62 procent) og K ved 1 uM ( 91,0 ± 2,06 procent). Tilsammen viser resultaterne, at begge positive kontroller havde stærkere caspase-3/7 aktivitetsnedsættende aktivitet end de testede CK'er, men CK'erne havde virkninger ved meget lavere koncentrationer. Samlet set indikerer resultaterne, at modulering af caspase-3/7-aktivitet spiller en nøglerolle i den potenteneurobeskyttendeaktivitet af midler såsom DFO [58] i den Glu-inducerede model for celledød [79,80]. Men som vist i dette afsnit havde NEC-1 ogsåneurobeskyttendeaktivitet, hvilket tyder på, at andre typer celledød kan være involveret i Glu-induceret død af neuronlignende SH-SY5Y-celler [63,67,81]. Indikationer på, at caspase-uafhængige mekanismer er involveret i Glu-induceret celledød, er også blevet opnået i analyser af virkninger af NEC -1 [70], DFO [69] og K [18] på HT22-celler.

Figur 7. Caspase-3/7 aktivitet i Glu-model af oxidativ skade afneuron-lignende SH-SY5Y-celler. Tredobbelt på mindst fire uafhængige dage. * P sammenlignet med vehikel med 160 uM Glu, # P sammenlignet med vehikel uden 160 uM Glu.

3. Konklusioner

Sammenfattende afslørede vores undersøgelse, at CK'er og deres metabolitter harneurobeskyttendeaktiviteter i den SAL-inducerede model afParkinsons sygdomog Glu-induceret oxidativ skade i humant differentieret SH-SY5Yneuronalceller. K3G, cZR og iPR viste sig at have biologisk signifikanteneurobeskyttendeaktiviteter. Desuden var de aktive CK'er effektive ved lavere (sub-mikromolære og mikromolære) koncentrationer end det positive kontrolstof NAC. K3G, cZR og iPR havde også positive effekter på levedygtighed, cytotoksicitet, oxidativ stress og caspase-3,7 aktivitet (undtagen iPR). De ortogonale demonstrationer indikerer kraftigt, at antioxidativ stressaktivitet spiller en nøglerolle i CK'ers beskyttende virkninger i den SAL-inducerede celledødsmodel. Kun tre metabolitter i det testede panel af CK'er (tZ, cZ og K) beskyttedeneuron-lignende SH-SY5Y-celler i den Glu-inducerede model af oxidativ skade på en lignende måde som jernchelatoren NEC1 og nekroptose-hæmmeren DFO. For at bekræfte deres lovende aktivitet testede vi deres virkninger i ortogonal lactatdehydrogenase (LDH)-frigivelsesassay. CK'erne havde moderat, men signifikant beskyttende aktivitet. Dette var svagere end kontrolstoffernes tilsvarende aktiviteter, men på trods af forskellene i moduleringen afneuronalsundhed stimulerede alle tre testede CK'er kraftige reduktioner i superoxid-radikaldannelse, på samme måde som de positive kontrolstoffer. CK'erne havde også sammenlignelige virkninger på Glu-induceret oxidativ stress i SH-SY5Y-celler som dem af NEC1 og DFO, men disse forbindelser havde stærkere hæmmende virkninger på caspase-3/7-aktivitet end CK'erne. Da Glu-induceret celledød ikke er afhængig af en caspase-afhængig vej, som vist i undersøgelser af virkninger af DFO og NEC-1 på HT-22-celler [70], kan CK'er tilsyneladende modulere både caspase- afhængig og -uafhængig celledød ved at reducere oxidativt stress [18,82]. I igangværende undersøgelser, den detaljerede virkningsmekanisme af CK'er og/eller deres mitokondrielle virkninger påneuronaleller astrocytceller vil blive undersøgt.

cistancheerfaringforPDoghukommelse

4. Materialer og metoder

4.1. Kemikalier og reagenser

Cytokininstandarder blev opnået fra OlChemIm (Olomouc, Tjekkiet). Calcein AM (1 mg/ml opløsning) og LDH-frigivelseskit og et Neurite-udvækstkit blev købt fra ThermoFisher. Propidiumiodid, dihydroethidium, komponenter af caspase- 3/7 assaybuffer, DMEM/F12 1:1 medium, føtalt bovint serum, trypsin, ATRA, salsolinolhydrobromid, glutamatmononatriumsalt, deferoxamin, N-acetylcystein Ac-DEVD-CHO og DMSO til cellekulturer blev købt fra Sigma Aldrich (Merck). Ac-DEVD-AMC substrat blev leveret af Enzo Life Science.

4.2. ORAC Radical Scavenging Activity Assays

Forbindelsernes evne til at opfange frie radikaler in vitro blev bestemt ved Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) assayet. Kort fortalt blev fluorescein (100 uL, 500 mM) og 25 uL af den testede forbindelsesopløsning tilsat til en 96-brønd mikroplade præ-inkuberet ved 37oC. Dernæst 25 uL af 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. SH-SY5Y cellekultur

Den humane neuroblastomcellelinje SH-SY5Y købt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's Medium og Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM: F-12, 1:1 ), suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS) og 1 procent penicillin og streptomycin ved 37 oC i en befugtet 5 procent CO2-atmosfære. Celler blev passeret op til 20 gange, og medier blev skiftet to eller tre gange om ugen. Celletætheden blev indstillet som passende for det planlagte assay (5000, 7000, 10.000 eller 20.000 celler pr. eksperiment. Dagen efter podningen blev ATRA i 1 procent FBS DMEM/F12-medium tilsat til cellerne til en slutkoncentration på 10 uM, og inkubation blev fortsat i yderligere 48 timer for at inducere differentiering, tillade dannelsen af ​​længere neuritter og reducere spredning.

4.4. Mikroskopi

Mikrofotografier afneuron-lignende SH-SY5Y-celler blev opnået ved hjælp af et DM IL LED-fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Mannheim, Tyskland) med et passende excitationsfilter til analysen eller en lysfeltopsætning med et DP73 højtydende digitalkamera (Olympus, Tokyo, Japan ). Da signal-til-støj-forholdet for farvning var moderat, blev kontrasten justeret lidt i ImageJ-software (Fiji) uden at påvirke den resulterende observation. Originalbilleder er inkluderet i de supplerende materialer.

4.5. Cellemembranfarvning (Neurite Outgrowth kit, Invitrogen™)

Neuron-lignende SH-SY5Y-celler (5000 celler pr. brønd) opnået ved 48 timers differentieringsprocedure blev farvet med et Neurite-udvækstkit (Invitrogen™) i henhold til producentens anbefalinger med mindre modifikationer. Cellerne blev vasket med PBS, mærket med en opløsning af det membranfarvningsfarvestof, der fulgte med sættet (ved at følge protokollen for 96 multibrøndsplader) i PBS i 20 minutter ved 37 oC, vasket igen med PBS og set under et fluorescensmikroskop ( med henholdsvis 533 og 585 nm excitations- og emissionsbølgelængder).

4.6. Cellebehandling

Efter differentieringsproceduren blev differentieringsmediet ændret til 1 procent DMEM/F12-medium suppleret med testforbindelser i koncentrationer på 0.1, 1 og 10 uM (med 7000 celler pr. brønd til cytotoksicitetstests), eller sammen med toksinet SAL ved 500 uM (med 7000-10.000 celler pr. brønd) eller 160 mM Glu (med 20.000 celler pr. brønd) i en passende varighed for assaytypen (levedygtighed, celledød osv.). Kontrolceller blev behandlet med et medium indeholdende 0,0,1 procent DMSO.

4.7. Cellelevedygtighed og celledød

Levedygtigheden afneuron-lignende SH-SY5Y-celler, der voksede i 96-brønds mikroplader (med ca. 7000 celler pr. brønd) efter 24 timers behandlinger blev evalueret med Calcein AM-assayet med mindre modifikationer [31]. Den anvendte Calcein AM-opløsning i PBS havde en koncentration på 0,75 uM, og inkubationstiden blev indstillet til 50 min. Antallet af levende celler i hver brønd blev bestemt ved hjælp af en Infinite M200 Pro mikropladelæser (Tecan, Østrig) med henholdsvis 495 og 517 nm excitations- og emissionsbølgelængder.

Celledød afneuron-lignende celler (SAL-model: 10,000 celler pr. brønd; Glu-model: 20,000 celler pr. brønd) blev bestemt ved PI-assay som rapporteret af Stone et al. 2003 med små modifikationer [83]. Kort fortalt blev mediet fra den SAL-inducerede model aspireret og ændret til en 1 ug/mL opløsning af PI i PBS, men celler udsat for Glu-induktion har svagere adhærens, så en 1 mg/ml opløsning af PI i PBS blev tilsat til give en slutkoncentration på 1 ug/ml. I begge tilfælde blev celler inkuberet i yderligere 15-25 minutter ved stuetemperatur, hvorefter PI-fluorescens blev målt med en Infinite M200 Pro-læser (Tecan, Grödig, Østrig) med henholdsvis 535 og 617 excitations- og emissionsbølgelængder. Den resulterende PI-fluorescens opnået med toksiner alene blev sat til 100 procent celledød.

4.8. Måling af oxidativ stress ved Dihydroethidium (DHE) assay

Celler blev differentieret og behandlet som beskrevet i det foregående afsnit for SAL-induktion (10,000 celler pr. brønd, 24 timer eller Glu-induktion (20,000 celler pr. brønd, 4 timer). Efter behandlingerne blev cellerne centrifugeret ved 500 xg i 330 s, hvorefter dyrkningsmedierne blev erstattet (efter aspiration) med 10 uM DHE-opløsning i PBS. 96-flerbrøndsplader med celler blev inkuberet i mørke i 30 min. temperatur, derefter blev DHE-fluorescens målt ved hjælp af en Infinite M200 Pro mikropladelæser (Tecan, Grödig, Østrig) med henholdsvis 500 og 580 nm excitations- og emissionsbølgelængder. Den resulterende DHE-fluorescens blev opnået med SAL eller 100 procent alene med superoxid-Gluorescens. Illustrative fluorescensmikrofotografier af DHE-farvede celler blev opnået efter DHE-måling med mikropladelæseren.

Cistanche plante har en meget god neurobeskyttende effekt

4.9. Måling af Caspase-3/7 aktivitet

Et-trins caspase-3/7-assays blev udført i henhold til en tidligere offentliggjort procedure [84]. For kulturer udsat for SAL-induktion og Glu-induktion blev reaktionsblandingerne (caspase-3,7-buffer og komponenter med celler i 96-multibrøndsplader) inkuberet i 2 timer og 3 timer ved 37 oC, henholdsvis. Caspase-3/7-aktivitet blev derefter målt med en Infinite M200 Pro mikropladelæser (Tecan, Østrig) med henholdsvis 346 og 438 nm excitations- og emissionsbølgelængder.

4.10. Statistisk analyse

Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget i tre til fem (n {0}}-5) uafhængige dage. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Værdier for alle målte variable er udtrykt som middelværdier ± SEM, som blev beregnet ved hjælp af Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), som også blev brugt til at generere tallene. Den statistiske analyse blev udført af PAST (ver. 1.97) softwarepakken [85]. Til differentieringseksperimentet blev Student t-testen brugt. Resten af ​​eksperimenterne blev evalueret ved ikke-parametrisk Kruskal-Wallis test med Mann-Whitney post hoc test med sekventiel Bonferroni korrektion. En værdi på p < 0,05="" blev="" anset="" for="" at="" være="">

Supplerende materialer: Originale billeder er tilgængelige online.

Forfatterbidrag: Forfatternes bidrag var som følger: Undersøgelse, metodologi, validering, dataanalyse, GG, CWD og JG; skrivning - originalt udkast til forberedelse GG, CWD og MS; datakuration, anskaffelse af finansiering, supervision, skrivning – gennemgang og redigering, CWD, MS og PK Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering: Dette arbejde blev støttet finansielt delvist af tilskud fra det interne tilskudsagentur ved Palacky University i Olomouc, Tjekkiet (IGA{{0}}PrF_2020_021), det tjekkiske tilskudsagentur ({{ 2}}S), og Den Europæiske Fond for Regionaludvikling – Projekt ENOCH (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) og et studiestipendium fra Palacky University's Endowment Fund.

Udtalelse fra institutionelle bedømmelsesudvalg: Ikke relevant.

Erklæring om informeret samtykke: Ikke relevant.

Erklæring om datatilgængelighed: Data er indeholdt i artiklen eller det supplerende materiale.

Tak: Forfatterne takker Dita Jordovd, Jana Hrubešovd og Lucie Koplikovd for fremragende teknisk assistance. Derudover takker forfatterne Sees-editing Ltd., Storbritannien for den engelske redigering af manuskriptet.

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Prøvetilgængelighed: Prøver af forbindelserne er ikke tilgængelige fra forfatterne.