Del 2: Proteinurisk kronisk nyresygdom er forbundet med ændret levetid for røde blodlegemer, deformerbarhed og stofskifte

For del 1, klik venligstHER.

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Doxorubicin-induceret nyreskade ændrer murine RBC levetid, morfologi og biofysiske egenskaber

Tyve dage efter induktion af DIN, faldende sammen med udviklingen af ​​reduceretnyrefunktion(Figur 1b), det fluorescerende farvestof 5(6)-CFDA, SE,24, som hurtigt optages i RBC'er, blev iv injiceret for at undersøge RBC-clearance-hastigheden på de angivne tidspunkter in vivo. Repræsentative histogrammer, vist i figur 4a, indikerer fjernelse af mærkede RBC'er fra cirkulationen og erstatning med umærkede RBC'er. Øget RBC-tab var allerede tydeligt 3 dage efter administration af farvestoffet, og clearance af RBC'er var signifikant hurtigere i 129S1/SvImJ-mus med DIN op til dag 37. På dag 41 blev z17 procent flere RBC'er fjernet fra kredsløbet i disse mus sammenlignet med med raske mus (figur 4b).

Cistancheforbedrenyrefunktionogfordelenyrer

Billeder taget fra en blodudstrygning afslørede morfologiske ændringer i RBC'er tegnet fra 129S1/SvImJ-mus med DIN (Figur 4c) og Nphs2Dipod-mus (Supplerende Figur S4A). Hos raske mus viser RBC'er en bikonkav skiveform. I 129S1/SvImJ-mus med DIN observerede vi et øget antal stomatocytter (røde stjerner), dråbeceller (sort trekant), skistocytter (sorte punkter) og mikrocytiske celler (sort pil) (figur 4c). Nphs2Dipod-mus viste en øget andel af schistocytter (sorte punkter, supplerende figur S4A, nederste billede, venstre side), og celler var polykromatiske (Supplerende figur S4A, nederste billede, højre side).

For yderligere at undersøge RBC funktionelle ændringer blev deformerbarhedsmålinger på dag 30 udført ved hjælp af ektacytometri.³²RBC-deformerbarhed blev signifikant reduceret i 129S1/SvImJ-mus med DIN såvel som i Nphs2Dipod-mus, som angivet ved et reduceret maksimalt forlængelsesindeks (EImax) (Figur 4d og Supplerende Figur S4B). Forskydningsspænding for 50 procent (SS1/2) af EImax (Figur 4e) og dermed SS1/2 EImax-forholdet (Figur 4f) var signifikant forøget i 129S1/SvImJ-mus med DIN, hvilket indikerer stivere RBC'er. SS1/2 af EImax var ens i Nphs2Dipod-mus (Supplerende figur S4C). SS1/2 EImax-forholdet havde en tendens til at blive forøget i Nphs2Dipod-mus sammenlignet med raske C57BL/6-mus; forskellen nåede dog ikke statistisk signifikans (P ¼ 0,06) (Supplerende figur S4D).

Da eksponering af røde blodlegemer for hypertoniske ekstracellulære tilstande in vitro efterligner det osmotiske miljø, man støder på i nyremarven, kan en kosmos udføres på dag 30, og adskillige osmosensitive parametre blev bestemt, som beskrevet tidligere.³³ Omin repræsenterer osmolaliteten ved minimum RBC-deformerbarhed, ud over hvilken RBC'er ville lysere med et yderligere fald i osmolaritet. Omin-værdier var højere i 129S1/SvImJ-mus med DIN og skiftet til højre (figur 5a og d). En lignende tendens til en højere Omin blev observeret i Nphs2Dipod-mus (Supplerende figur S4E). Værdier af Ohyper, der afspejler cellernes hydreringstilstand, var signifikant højere i 129S1/SvImJ-mus med DIN (figur 5b), men var ens i Nphs2Dipod-mus og deres respektive kontrolmus (Supplerende figur S4F). Den maksimale deformerbarhed (EImax) ved isotonicitet er det punkt, hvor celler har opnået maksimal ellipticitet. EImax ved isotonicitet blev signifikant reduceret i 129S1/SvImJ-mus med DIN (figur 5c), men viste ingen forskelle i Nphs2Dipod-mus sammenlignet med raske C57BL/6-mus (Supplerende figur S4G). Samlet set indikerer disse resultater reduceret membranintegritet og elasticitet, men også formændringer i 129S1/SvImJ- og Nphs2Dipod-mus såvel som en højere osmotisk skrøbelighed af RBC'erne fra 129S1/SvImJ-mus med DIN.

RBC'er omprogrammeres metabolisk under proteinurisk nyresygdom hos mus

For bedre at forstå de molekylære tilpasninger forbundet med ændringer i RBC-overflod og morfologi som funktion af nyreskade, blev RBC'er fra 129S1/SvImJ-mus med DIN- og Nphs2Dipod-mus analyseret ved massespektrometri-baseret metabolomik (figur 6a og supplerende figur S5A). Ved at bruge denne tilgang blev de relative niveauer af 256 metabolitter bestemt for 129S1/SvImJ-mus og Nphs2Dipod-mus. For at analysere disse data på en systematisk måde, blev multivariatanalyser, inklusive partiel-mindste kvadraters diskriminantanalyse og hierarkisk klyngeanalyse, udført. Interessant nok afslørede delvis-mindst kvadraters diskriminant analyse af RBC-metabolomer fra begge modeller lignende klyngemønstre.

Specifikt, selvom prøverne på tidspunktet for modelinduktion klyngede sammen med sunde prøver fra alle tidspunkter, klyngede prøver fra nefrotiske mus uafhængigt af sunde kontrolprøver sammen med komponent 1 (figur 6b og supplerende figur S5B). I overensstemmelse med klyngemønstre, der er tydelige i de 2 modeller, fremhævede hierarkisk klyngeanalyse af metabolomiske data for hver model lignende tendenser for metabolitter involveret i oxidativ stresshåndtering, såvel som nukleotider, aminosyrer, acylcarnitiner og fedtsyrer (Figur 6c) og supplerende figurer S5C, S6 og S7). For eksempel niveauerne af allantoin, en purinkatabolit og markør for oxidativt stress i røde blodlegemer,³⁴ og reduceret glutathion, begge betydeligt akkumuleret over tid i begge nefrotiske musemodeller, hvilket indikerer igangværende reaktive oxygenarter generering og aktivering af antioxidant glutathion-systemet (Figur 6d og Supplerende Figur S5D). Ligeledes akkumulerede niveauerne af coenzym A (CoA) precursor pantothenat over tid (figur 6e og supplerende figur S5E).

Lignende mønstre var tydelige i niveauerne af de frie fedtsyrer hexadecensyre (C16:1), octadecensyre (C18:1) og docosapentaensyre (C22:5), selvom hver model havde unikke tidsmæssige mønstre (figur 6f og supplerende figur). S5F).

Ud over fedtsyrer reagerede acylcarnitiner, inklusive hydroxyoctanoylcarnitin (AC C8-OH), hydroxydecanoyl-carnitin (AC C10-OH) og dodecanoyl-carnitin (AC C12:1), også til induktion af proteinurisk nefropati i begge modeller (figur 6g og supplerende figur S5G).

Tilsammen tyder disse resultater på, at på induktion af proteinuricnyre sygdomi 2 lignende musemodeller kan øgede niveauer af oxidativt stress give skade på acylkæder på membranlipider. Fordi RBC'er er blottet for kapaciteten til at syntetisere nye lipider, gør de brug af et system, der afhænger af phospholipase-medieret fjernelse af beskadigede acylkæder og erstatning med ubeskadigede fedtsyrer. Benævnt Lands-cyklussen35 afhænger dette system af acylkædeaktivering ved konjugation til CoA, som etablerer en ligevægt med acylcarnitin til membranudskiftning36 (figur 6h og supplerende figur S5H).

Proteinuriske CKD-patienter med anæmi viser øget RBC-død

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min pr. 1,73 m2) og 15 patienter med CKD med nefrotisk proteinuri og GFR<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Patientkarakteristika er vist i tabel 1. Nyresygdomsassocieret anæmi, som defineret ved en hæmoglobinkoncentration<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

Humane RBC'er fra patienter med primært nefrotisk syndrom og fremskreden CKD viste morfologiske ændringer, som observeret i musemodellerne (figur 4c og 7j-l og supplerende figur S4A). Selvom RBC-morfologi var normal i kontroller, havde anæmiske patienter med primært nefrotisk syndrom og fremskredne CKD-patienter et øget antal dråbeceller (sorte trekanter) og echinocytter (sorte krydsninger) (figur 7k og l). Derudover forekom målceller i primære nefrotiske patienter med anæmi og hos patienter med fremskreden CKD (røde krydser; figur 7k og l). Alle patientgrupper, inklusive primære nefrotiske patienter uden anæmi, havde en øget andel af sfærocytter (blå pile; figur 7j-l). For at analysere deformerbarheden af ​​humane RBC'er blev ektacytometri udført. Sammenlignet med raske kontroller blev maksimal deformerbarhed (EImax) reduceret hos patienter med fremskreden CKD (figur 7h); EImax havde en tendens til at være lavere hos patienter med et primært nefrotisk syndrom uden at nå statistisk signifikans (figur 7h). Parametrene SS1/2, Omin, Ohyper og EImax ved isotonicitet var ikke signifikant forskellige mellem raske kontroller, primære nefrotiske patienter og patienter med fremskreden CKD (Supplerende figur S8A-D).

Cistanche fordelenyrer og hjælp med CKD.

DISKUSSION

Den nuværende undersøgelse afslører nye patofysiologiske mekanismer, der fører til nyresygdom-associeret anæmi i 2 murine modeller af proteinuricnyre sygdommed svært svækkedenyrefunktion. Vores undersøgelse viser, at i disse modeller er anæmi resultatet af en reduceret RBC-levetid udløst af eksponering for PS og accelereret fagocytisk clearance. Spændende nok udviklede anæmi hos disse mus sig på trods af stimuleret erytropoiese, hvilket tyder på, at reduceret RBC-levetid gennem øget RBC-celledød kan være en alternativ forklaring på disse fund. I modsætning til CKD-patienter med anæmi (figur 77) var begge musemodeller karakteriseret ved øget plasma-EPO-koncentration. Dette kan antages af bevarelsen af ​​EPO-udskillende evne i disse modeller, som sandsynligvis skåner de EPO-udskillende celler placeret i interstitium af nyren. Den øgede EPO-sekretion i disse modeller ugyldiggør imidlertid ikke konklusionen om, at RBC-celledød er en vigtig aktør i patogenesen af ​​nyresygdomsassocieret anæmi. Tværtimod kan stimulering af erytropoiese ved øget EPO-sekretion betragtes som en kompenserende mekanisme til øget RBC-død induceret afnyresvigti disse modeller. Langs disse linjer blev øget ekstramedullær erytropoiese med øget miltvolumen for nylig observeret i en anden proteinurisk musemodel med anæmi.³⁸

Hos patienter med proteinurisk CKD og samtidig anæmi observerede vi også en øget procentdel af PS-eksponerende RBC'er sammen med højere niveauer af reaktive oxygenarter og ceramid. Dette tyder på, at accelereret RBC-død kan være involveret i patogenesen af ​​nyresygdomsassocieret anæmi i human CKD. Plasma EPO-koncentrationer og retikulocytproduktionsindeks blev ikke øget hos anæmiske CKD-patienter, hvilket peger på reduceret erytropoiese, som sammen med RBC-død forventes at forværre nyresygdomsassocieret anæmi. Årsagerne til tabet af EPO-sekretion af nyrerne ved human CKD forbliver uklare. Bemærkelsesværdigt, selvom ikke alle patienter med normal GFR havde anæmi, var dem med reduceret GFR alle anæmiske, hvilket pegede på en effekt af langvarig og fremskreden CKD. Især kan det relative EPO-underskud i CKD overvindes ved at bruge den nye klasse af prolylhydroxylasehæmmere,³⁹tyder på forstyrret iltsansning som en mulig årsag til EPO-hyposekretion.

Cistancheforbedrenyrefunktions og hjælp med CKD.

Vores data viser formindsket RBC-deformerbarhed i begge musemodeller af proteinurisk nefropati, som kan være direkte relateret til forhøjede cytoplasmatiske Ca2þ-niveauer.⁴⁰ Tilsammen kunne disse mekanismer virke i forening for at lette induktionen af ​​RBC-celledød og fjernelse af senescent og beskadigede RBC'er fra blodcirkulationen.¹⁵Desuden observerede vi metabolisk omprogrammering i disse celler, hvilket tyder på oxidativ stress og membranlipidomdannelse. Selvom CoA og acyl-CoA ikke blev målt direkte i disse prøver, omdannes de aktivt i RBC'er til acylcarnitiner af carnitin palmitoyl transferase.³⁶Akkumulerende niveauer af sidstnævnte forbindelsesklasse indikerer aktivering af disse mekanismer ved nefropati, da disse metabolitter ikke let transporteres over RBC-membraner.⁴¹ Som yderligere støtte observerede vi akkumulering i begge modeller af CoA-prækursorer, inklusive pantothenat, som optages⁴²og metaboliseres⁴³af røde blodlegemer, parallelt med stigende frie fedtsyrer og faldende fri carnitin. Interessant nok fandt vi tidligere, at disse ændringer forekommer i forbindelse med suprafysiologiske niveauer af intracellulær Ca2þ.¹⁶Selvom disse resultater blev genereret ex vivo, rapporterer vi heri lignende svar in vivo. Ydermere er acylcarnitiner i stand til direkte at modulere membranegenskaber⁴⁴og korrelerer med RBC-deformerbarhed^,45, samt osmotisk og oxidativ hæmolyse.⁴⁶Ukonjugeret fri carnitin, fremmer membrandeformerbarhed gennem mediering af interaktioner mellem membranproteiner.⁴⁷ Vores observationer af signifikant nedsatte niveauer af carnitin i RBC'er fra mus med nefropati, formentlig på grund af øget forbrug til generering af acylcarnitiner, kan bidrage til de svækkede rheologiske parametre, vi observerede parallelt.

Vores resultater tyder på fælles mekanismer, der fører til RBC-død hos mus med både DIN- og podocin-mangel, hvilket kan være relateret til både nefrotisk proteinuri og, endnu vigtigere, udviklingen af ​​sværnyresvigti musemodellerne observeret fra dag 20 og frem. Hos mennesker er fremskreden CKD med reduceret GFR en stærk forudsigelse for anæmi,⁴⁸og stimulering af RBC-død kunne være relateret til det uremiske miljø. Man må erkende, at ved fremskreden CKD kan mange faktorer og forstyrrelser spille ind og fremme nyresygdomsassocieret anæmi. Bidraget fra tung proteinuri til stimulering af RBC-død er stadig uklart, men selvom det ikke er bevist, kan det involvere faktorer, der går tabt i urinen, såsom transferrin eller andre, der regulerer RBC-metabolismen.⁴⁹Indtil videre fokuserer den nuværende behandling af nyresygdomsassocieret anæmi på at øge erytropoiese ved jern- eller EPO-substitution,⁵⁰ved påføring af orale hypoxi-inducerbare faktorproteinstabilisatorer,⁵¹eller ved oral eller iv jernadministration.⁵²Disse behandlinger tager dog ikke højde for øget RBC-død. I et tidligere tværsnitsstudie i hæmodialyse- og peritonealdialysepatienter fandt vi, at patienter med en højere procentdel af PS-eksponerende RBC'er blev behandlet med højere EPO-doser.¹⁴ Derfor lover forbedring af RBC-celledød at være en mulig terapeutisk tilgang til behandling af nyresygdomsassocieret anæmi. I denne sammenhæng kræver den hæmmende virkning af forskellige farmakologiske midler på RBC-celledød53 yderligere undersøgelser af mennesker og dyr.

Som konklusion bidrager ændret cellulær metabolisme til RBC-dysfunktion, øget RBC-død og dermed anæmi i musemodeller af proteinurisk CKD på trods af øgede serum-EPO-niveauer. Resultaterne af denne undersøgelse kan delvist forklare mekanismerne for anæmi forbundet med CKD hos mennesker.

Cistanche fordelenyrefunktioner og hjælp til CKD.

AFSLØRING

Selvom det ikke er relateret til indholdet af artiklerne, er ADA og TN grundlæggerne af Omix Technologies, Inc. Alle de andre forfattere erklærede ingen konkurrerende interesser.

DATAERKLÆRING

Data vil blive gjort tilgængelige efter rimelig anmodning.

ANKENDELSER

Forfatterne anerkender den eksperttekniske assistance fra Andrea Janessa. Disse undersøgelser blev støttet af en bevilling fra den tyske forskningsfond til RB (BI 2149/2-1) og FA (AR 1092/2-2). LS blev støttet af en Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) bevilling fra det medicinske fakultet ved Tübingen Universitet. SMQ blev understøttet af ressourcer fra Canadian Blood Services. Som en betingelse for den canadiske regerings finansiering skal denne rapport indeholde erklæringen "De synspunkter, der er udtrykt heri, repræsenterer ikke nødvendigvis synspunktet fra Canadas føderale regering."

FORFATTERS BIDRAG

RB og FA har designet undersøgelsen. Dataindsamling blev udført af RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M og BF.

Statistiske analyser blev udført af RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M og ADh; og figurer blev genereret af RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF og ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

og FA fortolkede dataene. Manuskriptet blev skrevet, gennemgået og redigeret af RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ og FA.

SUPPLERENDE MATERIALE

Supplerende fil (PDF)

Supplerende materialer og metoder.

Figur S1. Eksperimentelt design af undersøgelserne i 129S1/SvImJ og Nphs2Dipod mus.

Figur S2. Sletning af podocin-ekspression og kendetegn ved nefrotisk syndrom i Nphs2Dipod-mus.

Figur S3. Reduceret overlevelsesrate for røde blodlegemer i eksperimentelt nefrotisk syndrom hos Nphs2Dipod-mus.

Figur S4. Ændret morfologi og reduceret deformerbarhed af røde blodlegemer i Nphs2Dipod-mus.

Figur S5. Metabolomics indikerer akkumulering af oxidativ stress og aktivering af membranlipid-omdannelse i røde blodlegemer i Nphs2Dipod-mus.

Figur S6. Metabolomics indikerer ændret metabolisme i røde blodlegemer opnået fra 129S1/SvImJ mus.

Figur S7. Metabolomics indikerer ændret metabolisme i røde blodlegemer modtaget fra Nphs2Dipod-mus.

Figur S8. Forskydningsstress ved halvdelen af ​​maksimal deformerbarhed af røde blodlegemer (RBC) og RBC osmotisk følsomhed er ikke signifikant forskellige i primært nefrotisk syndrom og fremskredne patienter med kronisk nyresygdom (CKD).

REFERENCER

1. Finkelstein FO, Story K, Firanek C, et al. Sundhedsrelateret livskvalitet og hæmoglobinniveauer hos patienter med kronisk nyresygdom. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4:33-38.

2. Efstratiadis G, Konstantinou D, Chytas I, et al. Kardiorenal anæmi syndrom. Hippokratia. 2008;12:11-16.

3. Staples AO, Wong CS, Smith JM, et al. Anæmi og risiko for hospitalsindlæggelse ved pædiatrisk kronisk nyresygdom. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4: 48-56.

4. Kurella Tamura M, Vittinghoff E, Yang J, et al. Anæmi og risiko for kognitiv tilbagegang ved kronisk nyresygdom. BMC Nephrol. 2016;17:13.

5. Toft G, Heide-Jørgensen U, van Haalen H, et al. Anæmi og kliniske udfald hos patienter med ikke-dialyseafhængige eller dialyseafhængige alvorlig kronisk nyresygdom: en dansk befolkningsbaseret undersøgelse. J Nephrol. 2020;33:147-156.

6. Geddes CC. Patofysiologi af nyreanæmi. Nephrol skivetransplantation. 2018;34:921-922.

7. Artunc F, Risler T. Erythropoietinkoncentrationer i serum og respons på anæmi hos patienter med eller uden kronisk nyresygdom. Nephrol skivetransplantation. 2007;22:2900-2908.

8. Erslev AJ, Besarab A. Erythropoietin i patogenese og behandling af anæmi ved kronisk nyresvigt. Nyre Int. 1997;51:622-630.

9. Wish JB, Aronoff GR, Bacon BR, et al. Positiv jernbalance ved kronisk nyresygdom: hvor meget er for meget, og hvordan fortæller man det? Am J Nephrol. 2018;47:72–83.

Howard RL, Buddington B, Alfrey AC. Urinalbumin, transferrin og jernudskillelse hos diabetespatienter. Nyre Int. 1991;40:923-926.

OG osv.