DEL 2 Isolering og identifikation af phenylethanoidglycosider fra Aloysia Polystachya og dets aktivitet som hæmmere af monoaminoxidase-A

Hvad er grunden til, at Cistanche Actosider kan hæmme enzymaktivitet?

Princippet om Cistanches antioxidantvirkning

For mere information kontakt venligst:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

Adskillelse og identifikation af bestanddele ved ultra-performance væskekromatografi-massespektrometri

Kromatografiske analyser blev udført under anvendelse af et Waters Acquity UPLC H-Class system udstyret med en diode array detektor (DAD) og et Waters Xevo TQ-S tandem quadrupol massespektrometer med en Z-spray kilde, der arbejder i negativ ion tilstand. Stamopløsninger indeholdende 1.0mg/ml ekstrakt eller standarderneakteosid, isoacteosid, 6'-acetylacteosidog 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7-O-C7'']-biflavon i LC-grade methanol blev fremstillet separat, med sonikering i 30min. hver, når det var nødvendigt, og filtreret gennem 0.45μm Millipore-filtre (Merck Millipore). Opløsninger blev fortyndet til 10µg/ml med methanol, og alikvoter (5μL) blev injiceret på en Sigma-Aldrich Ascentis Express C18-søjle (1{{30}}0×4,6 mm id; 2,7 µm partikelstørrelse). Den mobile fase bestod af vand indeholdende 0,1 procent myresyre (opløsningsmiddel A) og methanol indeholdende 0,1 procent myresyre (opløsningsmiddel B) tilført med en strømningshastighed på 0,5 ml/min i henhold til elueringsprofilen: isokratisk med 3 procent B mellem 0 og 4 min, efterfulgt af lineære gradienter fra 3 til 60 procent B mellem 4 og 19 minutter og fra 60 til 90 procent B mellem 19 og 23 minutter, og til sidst vendt tilbage til 3 procent B mellem 23 og 28 minutter. Spildevandet blev overvåget af DAD i området 210 til 720 nm og af MS med de optimerede kilde- og driftsparametre som følger: kapillærspænding 2,50 kV, Z-spraykildetemperatur 150 grader, desolvationstemperatur (N2) 350 grader, desolvationsgasflow 600 L/h og masseområde på m/z 150 til 600 i fuld scanningstilstand.

Oprensning af identificerede bestanddele

Den rå hydroethanoliske ekstrakt (10 g) blev opløst i vand:ethanol (50:50; v/v) og delt i rækkefølge mod hexan, ethylacetat og n-butanol. Butanolfraktionen blev koncentreret på en rotationsfordamper, og en 3 g prøve af den fraktionerede ekstrakt blev påført en glaskolonne (10 × 3 cm od) fyldt med C-18 RP silicagel (230-400 mesh; Sigma -Aldrich) og elueret med vand, efterfulgt af successive blandinger af vand: methanol (90:10, 50:50 og 10:90; v/v). Subfraktionen opnået ved eluering med vand: methanol (90:10; v/v) blev yderligere oprenset ved RP-HPLC under anvendelse af et Shimadzu LC-20AP System koblet til en SPD-20A UV/Vis-detektor og udstyret med en Phenomenex Luna® C-18 kolonne (250 × 10 mm id; 5 μm partikelstørrelse). Den mobile fase var vand: methanol, der startede ved 90:10 (v/v) og skiftede til 30:70 (v/v) på 100 minutter for at give de fire kendte forbindelserakteosid(750 mg), isoleret side (430 mg), 6'-acetylacteosid(42 mg) og 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7-O-C7'']-biflavon ( 13 mg). Strømningshastigheden af ​​den mobile fase var 1 mL/min, injektionsvolumenet var 500 μL, kromatogrammet blev registreret ved 340 nm, og UV-spektre blev opnået i området 240 til 400 nm. Identiteten af ​​de rensede bestanddele blev bekræftet fra deres 1H- (500 MHz) og 13C-NMR (125 MHz) spektre optaget på et Bruker model DPX 500 spektrometer og sammenligning af dataene med dem, der er tilgængelige i litteraturen [18, 19, 41]. Renheden af ​​de isolerede forbindelser blev bekræftet af UPLC-DAD-MS (▶Fig. 1b–d) og NMR (▶Fig. S1–S12, Understøttende oplysninger).

Kvantificering afakteosidved hjælp af en HPLC-diode array detektor

En prøve (1 mg) af den tørrede hydroethanoliske ekstrakt blev genopløst i 1 ml af en blanding (80:20; v/v) methanol (JT Baker HPLC-kvalitet) og Milli-Q Ultrarent vand (Merck Millipore), sonikeret i 30 min. og filtreret gennem et 0.45-μm Millipore-filter. Alikvoter (20 µL) af denne opløsning blev analyseret på et Shimadzu LC-10APvp-system koblet til en SPD-M10Avp DAD og udstyret med en Phenomenex Luna C18-søjle (250 × 4,6 mm id, 5 µm) beskyttet af en Phenomenex C18-prækolonne (4,0 x 3,0 mm id, 5 µm). Separationer blev udført ved stuetemperatur (22 ± 1 grad) under anvendelse af en mobil fase omfattende eddikesyre 0,1 procent i vand (opløsningsmiddel A) og methanol (opløsningsmiddel B;

JT Baker HPLC-kvalitet) leveret med en konstant flowhastighed på 1,0 mL/min i henhold til programmet: lineær gradient fra 10 til 70 procent B mellem 0 og 32 minutter, fra 70 til 10 procent B mellem 32 og 35 minutter, og en afsluttende isokratisk eluering med 10 procent B mellem 35 og 40 minutter. Detektionsbølgelængden blev sat til 330 nm.

Indholdet afakteosidi ekstraktet blev estimeret vhaakteosid(Sigma-Aldrich; CAS-nr. 61276-17-3) som ekstern standard. Opløsninger indeholdende 500, 250, 125, 62,5, 31,2 og 15,6 ug/ml af referencestandarden blev fremstillet, og kalibreringskurver blev konstrueret ved at udsætte hver opløsning for HPLC-analyse i tre eksemplarer [42]. Forholdet mellem topareal af standardakteosidtil den tilsvarende koncentration af analyt blev etableret ved lineær regression af standardkurverne (▶Fig. S13, Understøttende oplysninger). Analytiske data blev valideret med hensyn til linearitet, præcision og nøjagtighed i henhold til retningslinjerne udstedt af Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Detektionsgrænser (LoD) og kvantificering (LoQ) afakteosidvar henholdsvis {{0}},30 og 0,92 µg/mL.

Monoaminoxidase-A-hæmningsassays

Rekombinant human MAO-A, tyramin, clorgylin, vanillinsyre, 4-aminoantipyrin og peberrodsperoxidase blev købt fra Sigma-Aldrich. MAO-A-hæmningsassays blev udført under anvendelse af 96-brøndsplader efter en modificeret version af metoden beskrevet af López et al. [43]. Hver brønd blev fyldt med 50 μL kromogen opløsning (0,8 mM vanillinsyre, 2,5 mM 4-aminoantipyrin og 4 U/mL peberrodsperoxidase i phosphatbuffer ved pH 7,6), 100 μL af 3 mM tyramin og en 50-μL alikvot af det rå hydroethanoliske ekstrakt eller en af ​​de oprensede phenylethanoider opløst i methanol. Til sidst blev 50 μL alikvoter af 8 U/mL MAO-A tilsat til hver af brøndene, og pladen blev inkuberet ved 37 grader i 30 minutter, i løbet af hvilken tid absorbanser blev registreret hvert 5. minut ved hjælp af en mikropladelæser. Clorgylin (Større end eller lig med 97 procent GC; Sigma-Aldrich) og methanol blev inkluderet som henholdsvis positive og negative kontroller på hver assayplade.

Statistisk analyse

Tre uafhængige vurderinger af MAO-A-hæmmende aktiviteter blev udført, og de opnåede data blev analyseret ved hjælp af Graph-Pad Prism-software. IC₅₀værdier af det hydroethanoliske ekstrakt, oprensede phenylethanoider og den positive kontrol blev beregnet ved ikke-lineær regression, simulering af plots af log (inhibitorkoncentration) versus normaliseret procentvis inhibering.

Understøttende information

H- og 13C-NMR-spektre afakteosid, isoacteosid, 6'-acetylacteosid og 4,4,5,5-tetrahydroxy-6,6,3 trimethoxy-[C7-O-C7'']-biflavon og HSQC/HMBC korrelationsanalyser for de tre phenylethanoider er tilgængelige som understøttende information.

Referencer

[1] Verdenssundhedsorganisationen. Depression og andre almindelige psykiske

Lidelser: Global Health Estimates. Genève: WHO; 2017

[2] Ferguson JM. SSRI antidepressiv medicin: Bivirkninger og tolerabilitet. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3:22-27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Komplementær og alternativ medicin til behandling af angst og depression. Curr Opin Psykiatri 2008; 21:37-42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Plantebaserede lægemidler til angstlidelser, del 1: En gennemgang af prækliniske undersøgelser. CNS Drugs 2013; 27: 207-219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Plantebaserede lægemidler til angstlidelser, del 2: En gennemgang af kliniske studier med understøttende præklinisk evidens. CNS Drugs 2013; 27: 301-319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (República Argentina). Primera parte: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49-66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), cultivado en Paraguay. Rojasiana 2014; 13:31-41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Anxiolytiske og antidepressiv-lignende virkninger af det hydroalkoholiske ekstrakt fraAloysia polystachyahos rotter. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373-378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. De anxiolytisk-lignende virkninger afAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) hos mus. J Ethnopharmacol- col 2006; 105: 400-408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. De antidepressiva-lignende virkninger afAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) hos mus. Phytomedicine 2008; 15: 478-483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

-Carboline alkaloider i Peganum harmala og hæmning af human monoaminoxidase (MAO). Food Chem Toxicol 2010; 48: 839-845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Identifikation, forekomst og aktivitet af quinazolin-alkaloider i Peganum harmala. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261-269

[13] Herraiz T, Guillén H. Monoaminoxidase-A-hæmning og associeret antioxidantaktivitet i planteekstrakter med potentielle antidepressive virkninger. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektive MAO-B-hæmmere: En lektion fra naturlige produkter. Mol Divers 2014; 18: 219-243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Behandling af angst og depression: Lægeplanter i retrospekt. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198-215

[16] Fišar Z. Lægemidler er relateret til monoaminoxidaseaktivitet. Prog Neuropsy- chopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112-124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. Type A monoaminoxidase og serotonin er koordineret involveret i depressive lidelser: Fra neurotransmitterubalance til nedsat neurogenese. J Neural Transm 2017; 125: 53-66