Del 2|Glykogensyntasekinase 3b hyperaktivitet i eksfolierede urinceller forudsiger udvikling af diabetisk nyresygdom

Klik her til del 1

For mere information kontakt venligst:emily.li@wecistanche.com

DISKUSSION

I USA og andre vestlige lande er DKD fortsat den førende ætiologi for progressivkronisk nyresygdomog pålægger statskassen og sundhedssystemerne en stor byrde uden nogen endelig behandling endnu tilgængelig.5 Det har længe været erkendt, at ikke alle patienter med diabetes vil fortsætte med at udvikle DN.5 Afhængigt af den undersøgte kohorte er det blevet estimeret, at DN rammer mellem 30 og 50 procent af diabetespatienterne. De foranstaltninger, der er truffet af den nuværende kliniske praksis for at identificere diabetespatienter med risiko for at udvikle DKD, er stort set begrænset til øjenundersøgelser for retinopati og urinanalyse for albuminuri.5 Konvergerende epidemiologiske beviser tyder imidlertid på, at ekstrarenal mikrovaskulopati eller albuminuri er signifikant uoverensstemmende med den efterfølgende progression af DKD.12,13,26,27 Som sådan er der et presserende behov for at udvikle en ny biomarkør til præcis stratificering af diabetespatienter med risiko for DN. Denne undersøgelse rapporterer for første gang, at GSK3b er overudtrykt og hyperaktiv i parenkymalnyreceller i både eksperimentel og klinisk DN, forbundet medudvikling af nyresygdom. Desuden er GSK3b-hyperaktivitet i urineksfolierede celler sandsynligvis i stand til at forudsige progressionen af ​​DN.

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

GSK3b, en meget konserveret, redoxfølsom serin/threonin-proteinkinase, er centralt involveret i insulinsignalering samt en række andre cellulære signalveje, der er afgørende for patofysiologiske processer relateret tilnyreskade, reparation og regenerering. I insulinfølsomt væv, såsom leveren og skeletmuskulaturen, er GSK3b aktiv under basale forhold og undertrykker aktiviteten af ​​glykogensyntase.19,28 Insulin inaktiverer hurtigt GSK3b via hæmmende fosforylering ved serin 9, hvilket resulterer i glykogenbiosyntese. En voksende mængde af beviser tyder på, at GSK3b-dysregulering er forbundet med type 2-diabetes mellitus.19,29-31 Der er faktisk data, der indikerer GSK3b-overekspression og hyperaktivitet i muskler hos diabetespatienter31-33 og i fedtvæv hos overvægtige diabetiske mus.34 Desuden , transgen overekspression af GSK3b i skeletmuskler hos mus forårsager nedsat glukosetolerance, insulinresistens og hyperinsulinemi.29,35 Omvendt udviste mus, der mangler GSK3b i skeletmusklerne, forbedret glukosetolerance.36 Konsekvent er GSK3-hæmmere i stand til f.eks. lithium, efterligner insulinvirkning i cellelinjer og væv.37 Hos overvægtige diabetiske mus forbedrede GSK3-hæmmere desuden insulinfølsomheden og glucosehomeostase.38nyreer traditionelt ikke blevet betragtet som et målorgan for insulinvirkning. Imidlertid antydede overbevisende beviser for nylig, at insulin signalerer indnyreceller, især i podocytter, spiller en nøglerolle i at opretholde glomerulær ognyrehomeostase.39–41 Defekt insulinsignalering i podocytter på grund af insulinmangel eller -resistens er sandsynligvis en central initiator for mange af de patologiske læsioner observeret i DN. Desuden har kliniske undersøgelser vist, at insulinresistens korrelerer med indtræden og sværhedsgraden af ​​albuminuri selv hos normotensive patienter, som ikke har diabetes, hvilket tyder på, at insulinresistens i sig selv kan forårsage albuminuri.42 På samme måde kan mus med podocytspecifik insulinresistens, opnået ved at betinget knockout af insulinreceptoren i glomerulære podocytter, udviklede albuminuri og glomerulære læsioner, der rekapitulerer DN, på trods af fravær af hyperglykæmi eller diabetes.41 Omvendt er insulinsensibilisatorer i diabetiske dyr i stand til at bremse progressionen af ​​DN uafhængigt af glykæmisk kontrol.43 Disse resultater tyder på, at insulinsignalering regulerer podocytfunktionen uafhængigt af blodsukkerniveauet. Som nøgletransduceren af ​​insulinsignalvejen er GSK3bs rolle i patogenesen og progressionen af ​​DN imidlertid blevet meget undersøgt.

I dennyre, GSK3b er overvejende udtrykt i podocytter og i mindre grad i mesangiale og endotelceller i glomerulus20,21 og ekstensivt udtrykt af renale tubulære celler. Der er data fra vores og andre grupper, der indikerer, at GSK3b medierer autonom podocytskade ved at integrere flere podocy topatiske signalveje.17,20,44,45 Inkonsekvens, genetisk eller farmakologisk blokade af GSK3b kan beskytte mod podocytskade og dæmpe proteinuri i dyremodeller forskellige ikke-diabetiske glomerulopatier.21 Desuden i progressivekronisknyresygdom, GSK3b viste sig at være en modulator af renal tubulær og interstitiel skade. Hvorvidt og hvordan GSK3b er involveret i DN har imidlertid været usikkert og intenst kontroversielt, selvom denne undersøgelse viste, at forbedret GSK3b-aktivering inyreog i urin eksfolierede celler kan være forbundet med udvikling eller progression af DKD. For eksempel fandt Lin et al.46 hos rotter med streptozotocin-induceret diabetes, at hæmningen af ​​GSK3b af adenosintriphosphat-kompetitiv inhibitor (20 Z,30 E)-6- brom i indirubin-30 -oxim ( BIO) svækket proteinuri og forbedrede glomerulære læsioner af DN i fravær af korrektion af hyperglykæmi, hvilket tyder på, at GSK3b spiller en skadelig rolle i DN. Også hos rotter med streptozotocin-induceret diabetes gjorde Paeng et al.22 lignende resultater ved at bruge BIO og konkluderede, at øget GSK3b-aktivitet i podocytter under diabetiske forhold er forbundet med podocytapoptose og tab i DN. Dette er i overensstemmelse med et andet in vitro-studie, hvor GSK3b viste sig at mediere podocytdedifferentiering og -skade efter eksponering for et medium med højt glukose.47 Tværtimod hævdede Mariappan et al.48, at aktiveringen af ​​GSK3b i stedet forbedrer diabetes-induceretnyreskade. I deres undersøgelse blev streptozotocin-inducerede diabetiske mus behandlet med natriumnitroprussid, en nitrogenoxiddonor, der er i stand til at aktivere GSK3b. De fandt ud af, at albuminuri, nyrehypertrofi og ekstracellulær matrixakkumulering i glomeruli alle blev forbedret i fravær af forbedring af hypertension eller hyperglykæmi. Disse fund modsiger dog skarpt dataene fra gen-målrettede knock-in mus med konstitutivt aktiv GSK3, der udviklede spontan albuminuri og podocytskade.49 For at forene de modstridende resultater bør man være forsigtig med at fortolke de data, der genereres ved brug af kemiske inhibitorer eller aktivatorer. af GSK3b. Selvom BIO gentagne gange er blevet bekræftet at være en meget selektiv lille-molekyle-hæmmer af GSK3b, er natriumnitroprussid ikke en specifik aktivator af GSK3b, men kendt for at have en potent hæmodynamisk effekt50, som sandsynligvis vil forveksle dets albuminuri-reducerende og genbeskyttende virkning i diabetiske mus. Samlet set, på trods af nogle modstridende data, har fremherskende beviser tendens til at understøtte, at GSK3b sandsynligvis er forbundet mednyreskadeog proteinuri i DN. Et par begrænsninger ved denne undersøgelse skal nævnes. For det første var de prækliniske data kun begrænset til DB/DB murine modeller. For at bestemme generaliserbarheden af ​​rollen som GSK3b idiabetisk nyreskade, er det nødvendigt at validere resultaterne i andre modeller af DN, herunder type 1 DN-modeller. For det andet blev de kliniske observationer her afledt fra retrospektive kohorter af diabetespatienter med begrænset stikprøvestørrelse og en relativt kort opfølgningstid. Ganske vist kræves der store, prospektive, randomiserede multicenterundersøgelser for at verificere vores observationer og bekræfte styrken af ​​GSK3b i urineksfolierede celler til at forudsige resultatet af DKD.

GSK3b, en meget konserveret, redoxfølsom serin/threonin-proteinkinase, er centralt involveret i insulinsignalering samt en række andre cellulære signalveje, der er afgørende for patofysiologiske processer relateret tilnyreskade, reparation og regenerering. I insulinfølsomt væv, såsom leveren og skeletmuskulaturen, er GSK3b aktiv under basale forhold og undertrykker aktiviteten af ​​glykogensyntase.19,28 Insulin inaktiverer hurtigt GSK3b via hæmmende fosforylering ved serin 9, hvilket resulterer i glykogenbiosyntese. En voksende mængde af beviser tyder på, at GSK3b-dysregulering er forbundet med type 2-diabetes mellitus.19,29-31 Der er faktisk data, der indikerer GSK3b-overekspression og hyperaktivitet i muskler hos diabetespatienter31-33 og i fedtvæv hos overvægtige diabetiske mus.34 Desuden , transgen overekspression af GSK3b i skeletmuskler hos mus forårsager nedsat glukosetolerance, insulinresistens og hyperinsulinemi.29,35 Omvendt udviste mus, der mangler GSK3b i skeletmusklerne, forbedret glukosetolerance.36 Konsekvent er GSK3-hæmmere i stand til f.eks. lithium, efterligne insulin

virkning i cellelinjer og væv.37 I overvægtige diabetiske mus forbedrede GSK3-hæmmere desuden insulinfølsomheden og glucosehomeostase.38 Nyren er traditionelt ikke blevet betragtet som et målorgan for insulinvirkning. Imidlertid har overbevisende beviser for nylig antydet, at insulinsignalering i nyreceller, især i podocytter, spiller en nøglerolle i opretholdelsen af ​​glomerulær og nyrehomeostase.39-41 Defekt insulinsignalering i podocytter på grund af insulinmangel eller -resistens er sandsynligvis en central initiator. for mange af de patologiske læsioner observeret i DN. Desuden har kliniske undersøgelser vist, at insulinresistens korrelerer med indtræden og sværhedsgraden af ​​albuminuri selv hos normotensive patienter, som ikke har diabetes, hvilket tyder på, at insulinresistens i sig selv kan forårsage albuminuri.42 På samme måde kan mus med podocytspecifik insulinresistens, opnået ved at betinget knockout af insulinreceptoren i glomerulære podocytter, udviklede albuminuri og glomerulære læsioner, der rekapitulerer DN, på trods af fravær af hyperglykæmi eller diabetes.41 Omvendt er insulinsensibilisatorer i diabetiske dyr i stand til at bremse progressionen af ​​DN uafhængigt af glykæmisk kontrol.43 Disse resultater tyder på, at insulinsignalering regulerer podocytfunktionen uafhængigt af blodsukkerniveauet. Som nøgletransduceren af ​​insulinsignalvejen er GSK3bs rolle i patogenesen og progressionen af ​​DN imidlertid blevet meget undersøgt.

I nyren er GSK3b overvejende udtrykt i podocytter og i mindre grad i mesangiale og endotelceller i glomerulus20,21 og ekstensivt udtrykt af renale tubulære celler. Der er data fra vores og andre grupper, der indikerer, at GSK3b medierer autonom podocytskade ved at integrere flere podocytpatiske signalveje.17,20,44,45 Inkonsekvens, genetisk eller farmakologisk blokade af GSK3b kan beskytte mod podocytskade og dæmpe proteinuri i dyremodeller forskellige ikke-diabetiske glomerulopatier.21 Desuden i progressiv kronisknyresygdom, GSK3b viste sig at være en modulator af renal tubulær og interstitiel skade. Hvorvidt og hvordan GSK3b er involveret i DN har imidlertid været usikkert og intenst kontroversielt, selvom den foreliggende undersøgelse viste, at øget GSK3b-aktivering i nyrerne og i urineksfolierede celler kan være forbundet med udvikling eller progression af DKD. For eksempel fandt Lin et al.46 hos rotter med streptozotocin-induceret diabetes, at hæmningen af ​​GSK3b af adenosintriphosphat-kompetitiv inhibitor (20 Z,30 E)-6- brom i indirubin-30 -oxim ( BIO) svækket proteinuri og forbedrede glomerulære læsioner af DN i fravær af korrektion af hyperglykæmi, hvilket tyder på, at GSK3b spiller en skadelig rolle i DN. Også hos rotter med streptozotocin-induceret diabetes gjorde Paeng et al.22 lignende resultater ved at bruge BIO og konkluderede, at øget GSK3b-aktivitet i podocytter under diabetiske forhold er forbundet med podocytapoptose og tab i DN. Dette er i overensstemmelse med et andet in vitro-studie, hvor GSK3b viste sig at mediere podocytdedifferentiering og -skade efter eksponering for et medium med højt glukose.47 Tværtimod hævdede Mariappan et al.48, at aktiveringen af ​​GSK3b i stedet forbedrer diabetes-induceretnyreskade. I deres undersøgelse blev streptozotocin-inducerede diabetiske mus behandlet med natriumnitroprussid, en nitrogenoxiddonor, der er i stand til at aktivere GSK3b. De fandt ud af, at albuminuri, nyrehypertrofi og ekstracellulær matrixakkumulering i glomeruli alle blev forbedret i fravær af forbedring af hypertension eller hyperglykæmi. Disse fund modsiger dog skarpt dataene fra gen-målrettede knock-in mus med konstitutivt aktiv GSK3, der udviklede spontan albuminuri og podocytskade.49 For at forene de modstridende resultater bør man være forsigtig med at fortolke de data, der genereres ved brug af kemiske inhibitorer eller aktivatorer. af GSK3b. Selvom BIO gentagne gange er blevet bekræftet at være en meget selektiv lille-molekyle-hæmmer af GSK3b, er natriumnitroprussid ikke en specifik aktivator af GSK3b, men kendt for at have en potent hæmodynamisk effekt50, som sandsynligvis vil forveksle dets albuminuri-reducerende og genbeskyttende virkning i diabetiske mus. Samlet set, på trods af nogle modstridende data, har fremherskende beviser tendens til at understøtte, at GSK3b sandsynligvis er forbundet mednyreskadeog proteinuri i DN. Et par begrænsninger af

nuværende undersøgelse skal nævnes. For det første var de prækliniske data kun begrænset til dB/dB murine modeller. For at bestemme generaliserbarheden af ​​rollen som GSK3b idiabetisk nyreskade, er det nødvendigt at validere resultaterne i andre modeller af DN, herunder type 1 DN-modeller. For det andet blev de kliniske observationer her afledt fra retrospektive kohorter af diabetespatienter med begrænset stikprøvestørrelse og en relativt kort opfølgningstid. Ganske vist kræves der store, prospektive, randomiserede multicenterundersøgelser for at verificere vores observationer og bekræfte styrken af ​​GSK3b i urineksfolierede celler til at forudsige resultatet af DKD.

Sammenfattende viste vores undersøgelser, at nyreekspression og aktivitet af GSK3b amplificeres i eksperimentel og klinisk DN. GSK3b-aktivitet i urineksfolierede celler kan tjene som en ny biomarkør til at forudsige progressionen af ​​DN. Vores data kan bane vejen for en storstilet, dybdegående undersøgelse af den værdi, som GSK3b i urineksfolierede celler kan tjene som en prognostisk biomarkør for DN.

METODER

Dyreundersøgelser

Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Committee, og de er i overensstemmelse med det amerikanske landbrugsministeriums regulativer og National Institutes of Health's Guide for human Care and Use of Laboratory Animals. DB/DB-hanmus og kontrol db/m kuldkammerater i alderen 6 uger blev købt fra NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Kina) og anbragt i Zhengzhou Universitys centrale dyrefacilitet. Alle mus blev fodret ad libitum, og 8 til 10 mus blev dræbt ved angivne alder. Urin- og blodprøver blev udtaget på angivne tidspunkter. Efter aflivning blev nyrerne høstet til yderligere undersøgelse. Urinalbuminniveauer blev målt under anvendelse af et muse-albumin-enzym-linket immunosorbent assay-kvantificeringskit (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Urinkreatininniveauer blev bestemt under anvendelse af et kreatininassay-kit (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Cellekultur

Betinget udødeliggjorte musepodocytter mellem passager 21 og 25 blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium suppleret med 10 procent føtalt bovint serum under tilladelige betingelser som beskrevet tidligere.22 Subkulturer af podocytterne blev udsat for ikke-permissive betingelser for at inducere differentiering i 14 dage og blev derefter udsat for et normalt miljø/kulturmedium, der indeholdt 5 mM glucose, et diabetisk miljø bestående af glucose (25 mM) og transformerende vækstfaktor b1 (2 ng/ml) eller et kontrolmedium med høj osmolalitet indeholdende 20 mM mannitol i 48 timer. Murine proksimale tubulære epitelceller og muse glomerulære mesangiale celler blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle's medium/F12 suppleret med 5 procent føtalt bovint serum. Celler blev udpladet ved w70 procent konfluens i mediet indeholdende 5 procent føtalt bovint serum i 24 timer og undergik derefter serumsult i yderligere 24 timer efterfulgt af eksponering for et normalt miljø/kulturmedium, der indeholdt 5 mM glucose, et diabetisk miljø bestående af høj glucose (25 mM) og transformerende vækstfaktor b1 (2 ng/ml), eller et kontrolmedium med høj osmolalitet indeholdende 5 mM glucose og 20 mM mannitol i 48 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet ved trypanblåt udelukkelse. På angivne tidspunkter blev celler fikseret eller cellelysater opsamlet til yderligere undersøgelse.

Forbigående transfektion af vektorer

Vektorerne, der koder for den tomme vektor eller den hæmagglutinin (HA)-mærkede konstitutivt aktive (S9A) mutant (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) af GSK3b, blev leveret af Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) og blev transficeret til dyrkede podocytter, mesangiale celler og tubulære epitelceller ved at anvende Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) som tidligere beskrevet.44 Transfektionseffektivitet blev verificeret ved immunfluorescensfarvning eller immunblotting for HA efter 12 timer. Celler blev efterfølgende opsamlet og forberedt til Western blot-analyse eller andre assays.

RNAi

En pulje af 3 mus GSK3b-specifikke små, interfererende RNA-duplekser—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACTt-30 og 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 - blev designet og syntetiseret i overensstemmelse med den komplette kodende sekvens af det murine GSK3b-gen (GenBank accessionsnr. BC060743.1). Derudover blev en forvrænget lille, interfererende RNA-sekvens (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUTt-30) uden sekvenslighed med nogen kendte gensekvenser fra mus, rotter eller mennesker brugt som kontrol for RNAi. Effektiviteten af ​​lipofectamin (Invitrogen, Carlsbad, CA)-medieret gen-silencing blev vurderet ved immunoblotanalyse for GSK3b. Tilfredsstillende undertrykkelse af GSK3b-proteinekspression blev observeret i dyrkede podocytter, mesangiale celler og tubulære epitelceller 24 timer efter RNAi. Celler blev derefter udsat for et normalt miljø/kulturmedium, et diabetisk miljø eller et kontrolmedium med høj osmolalitet i 48 timer som angivet ovenfor, før cellerne blev behandlet til yderligere assays.

Kliniske undersøgelser

Den kliniske del af denne undersøgelse var i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i Helsinki-erklæringen fra 1975 og blev godkendt af Institutional Review Board for Zhengzhou Universitys første tilknyttede hospital. Menneskelige forskningsdeltagere blev ikke specifikt rekrutteret til denne undersøgelse. Alle de kliniske data blev indsamlet ved retrospektiv diagramgennemgang og ved undersøgelse af arkiverede vævssnit eller bankede urinprøver. For mange eller kasserede nyrebiopsiprøver såvel som fraktionerede urinprøver er rutinemæssigt blevet deponeret på Institute of Nephrology på det første affilierede hospital ved Zhengzhou University. Arkiverede uidentificerede formalinfikserede paraffinindlejrede nyrebiopsivæv fra patienter i forskellige stadier af DN blev tilfældigt udvalgt til undersøgelse. Yderligere nyreprøver uden histomorfologiske læsioner blev udtaget fra nyrer, der blev kasseret til transplantation på grund af vaskulære anomalier eller fra præimplantationsbiopsivæv og fungerede som normale kontroller. Til det retrospektive kohortestudie blev i alt 127 patienter med type 2-diabetes mellitus, som var blevet fulgt op siden 2010 med opsamlede prøver af fraktioneret urin, retrospektivt screenet for inklusion i denne undersøgelse. De undersøgte patienter var i alderen mellem 29 og 80 år og diagnosticeret med type 2-diabetes i henhold til American Diabetes Association-kriterierne. Eksklusionskriterier omfattede tab af opfølgning, utilstrækkelig information,nyredysfunktion, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 år. Under rutinemæssig opfølgning blev demografiske data, såvel som kliniske parametre, dokumenteret, herunder køn, alder, følgesygdomme, medicin, varighed af diabetes, blodtryk, glykæmisk niveau, serumkreatininniveau, urinanalysedata, UAE og eGFR. Det kliniske resultat efter 5 års opfølgning var tilstedeværelse eller fravær af progression af nedsat nyrefunktion, hvilket blev defineret som enten $25 procent reduktion i eGFR eller progression af albuminuri som indikeret ved eskaleringen af ​​sværhedsgraden af ​​albuminuri langs forskellige kliniske stadier af DN, det vil sige normoalbuminuri, mikroalbuminuri, makroalbuminuri eller åbenlys proteinuri. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke.

Renal morfologi vurdering og immunhistokemi analyse

Paraffinindlejrede formalinfikserede musenyrevævsblokke blev skåret i 3- mm sektioner. Til generel histologi blev sektioner behandlet til periodisk syre-Schiff-farvning. Immunhistokemisk farvning for GSK3b og p-GSK3b blev udført under anvendelse af et VECTASTAIN ABC-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) som beskrevet tidligere.20 Som en negativ kontrol blev det primære antistof erstattet af ikke-immun serum fra den samme art; ingen farvning skete. De morfologiske træk ved alle sektioner blev vurderet af en enkelt observatør på en blind måde med bistand fra en nyrepatolog.

Immunfluorescerende farvning

Dyrkede celler eller frosne kryostatsektioner blev fikseret og farvet med primære antistoffer og efterfulgt af påføring af Alexa Fluor-konjugerede sekundære antistoffer (Invitrogen). Som en negativ kontrol blev primære antistoffer erstattet af præimmunt IgG fra den samme art; ingen farvning skete. Til sidst blev sektioner modfarvet med 40,6-diamidino-2-phenylindol eller propidiumiodid og monteret med VECTASHIELD monteringsmedium (Vector Laboratories). Til FL-fluorescensmikroskopi blev alle sektioner analyseret på samme tid for at udelukke artefakter på grund af variabelt henfald af fluorokromet. Snit blev undersøgt ved hjælp af et Olympus FL fluorescensmikroskop udstyret med et Spot II digitalkamera (Olympus, Tokyo, Japan). Til tofarvefarvning blev billeder erhvervet sekventielt for at undgå farvestofinterferens. ImageJ-software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) blev brugt til efterbehandling af billederne, for eksempel skalering, sammensmeltning og kolokaliseringsanalyse.

Computerstyret morfometri

Billeder af immunhistokemi-farvning blev fanget og digitaliseret ved hjælp af et computeriseret billedanalysesystem bestående af et højopløsnings-ladningskoblet digitalkamera, der er knyttet til et mikroskop (Olympus BX41, Olympus) og til en computer. Billeder blev vist med en pixelopløsning på 1024 768 pixels (rumlig opløsning, 0,24 mm/pixel). Til billeder af immunhistokemi-farvning af humant nyrevæv blev ImageJ-software brugt til billedsegmentering, tærskeletablering og signalintensitetsmålinger. Manuelle rettelser blev udført efter behov. Samlet blev 10 glomeruli eller 10 tilfældige tubulointerstitielle felter udtaget til morfometrisk analyse, og de endelige data blev udtrykt som værdien af ​​integreret pixeltæthed i forhold til kontrolgruppen.

Western immunoblot analyse

Dyrkede celler blev lyseret;nyrevæveller isolerede renal glomeruli blev homogeniseret i radioimmunpræcipitationsanalysebuffer suppleret med proteaseinhibitorer, og prøver blev behandlet til immunoblotanalyse. Til immunoblotanalyse af det begrænsede antal eksfolierede celler i urinen blev Western blot-protokollen modificeret som beskrevet tidligere ved at bruge de højtydende NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) og højkvalitets transfermembraner.25 Raffineret immunoblotting kunne opdage moderat udtrykte proteiner i så få som 1000 celler. Antistofferne mod GSK3b, fibronectin, collagen IV, actin og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); dem mod synaptopodin blev købt fra PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Tyskland); og dem mod ZO-1 og p-GSK3b blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistisk analyse

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 sammenligninger. Kategoriske data blev sammenlignet mellem grupper ved hjælp af chi-kvadrat-testen. Lineær regressionsanalyse blev anvendt til at undersøge mulige sammenhænge mellem 2 parametre. Univariate Cox proportional hazards regressionsanalyser blev udført for at vurdere sammenhænge mellem de relevante variable og risikoen for progression af nedsat nyrefunktion, efterfulgt af multivariate analyser med hensyn til potentielle konfoundere. ROC-kurveanalyse blev udført, og arealerne under ROC-kurverne blev målt for at analysere styrken af ​​visse variabler til at forudsige progressionen af ​​nedsat nyrefunktion hos diabetespatienter. Ikke-normalfordelte variabler, såsom UAE, blev transformeret ved hjælp af logaritme for at opnå normalitet for Cox-andelen af ​​farer regressionsanalyser ROC-kurveanalyser. Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af PSS version 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P-værdier<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

AFSLØRING

Alle forfatterne erklærede ingen konkurrerende interesser.

ANKENDELSER

En del af denne undersøgelse blev præsenteret som en mundtlig præsentation på KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15.-20. november 2016, Chicago, IL. RG blev delvist støttet af fonden for Sundhed. XL blev støttet af et forskningsstipendium til at modtage ekstramural træning. ZL blev støttet af National NaturalScience Foundation of China tilskud U1604284, 81770672 og 81873612. Finansierne havde ingen rolle i udformningen og udførelsen af ​​denne undersøgelse, indsamling og fortolkning af dataene eller forberedelse og godkendelse af manuskriptet.

FORFATTERS BIDRAG

RG udtænkte de konceptuelle ideer. XL, ZL og RG bidrog til undersøgelsens design. XL, PW, BC, YG, AYG og BF udførte cellekulturforsøgene. XL og ZL udførte dyreforsøg og indsamlede data fra diabetespatienter. XL, LJW, DKM, LDD, ZL og bidrog til diskussionen og fortolkningen af ​​resultaterne. gik i spidsen for at skrive manuskriptet. XL, BC og BF bidrog til manuskriptredigering. Alle forfattere var enige om, at hele konceptet og ejerskabet af dette værk tilhører RG. Alle forfattere godkendte det endelige manuskript.

SUPPLERENDE MATERIALE

Supplerende metoder.

Tabel S1. Karakteristika for kontrolpersoner og patienter med diabetisk nefropati, stratificeret efter histologiske klasser af diabetisk nefropati. Tabel S2. Baseline demografiske, kliniske og laboratoriedata for den retrospektive kohorte af diabetespatienter i tidlig stadium uden tegn på DKD. Tabel S3. Demografiske, kliniske og laboratoriedata for patienter med type 2-diabetes i tidlig stadium, stratificeret i henhold til deres nyreresultater efter 5 års opfølgning. Figur S1. Den øgede nyreaktivitet af GSK3b forudsiger udviklingen og sværhedsgraden afdiabetikernyresygdomi db/db mus. Han-db/db- og db/m-mus blev fulgt op mellem 4 og 13 uger gamle. (A) Blod blev udtaget fra ikke-fastende mus ved 4 og 7 ugers alderen, og plasmaglucoseniveauer blev analyseret. *P < 0.001="" versus="" db/m="" mus="" ved="" 7="" ugers="" alderen.="" n="" ¼="" 15-18.="" (b)="" der="" blev="" udtaget="" stikurin="" ved="" 4,="" 7,="" 10="" og="" 13="" ugers="" alderen="" og="" underkastet="" urinalbumin="" og="" urinkreatinin-assay="" til="" bestemmelse="" af="" urin-albumin-til-kreatinin-forhold="" (uacr'er).="" *p="">< 0,001="" versus="" db/m="" mus="" ved="" 10="" ugers="" alderen="" (n="" ¼="" 15-18);="" #p="">< 0,001="" versus="" db/m="" mus="" ved="" 13="" ugers="" alderen.="" n="" ¼="" 15-18.="" (c)="" alle="" mus="" modtog="" åben="" nyrebiopsi="" ved="" 7="" ugers="" alderen,="" og="" biopsiprøver="" blev="" behandlet="" til="" immunoblotanalyse="" for="" p-gsk3b,="" gsk3b="" og="" gapdh.="" (d)="" immunoblots="" blev="" udsat="" for="" densitometrisk="" analyse.="" den="" relative="" overflod="" af="" gsk3b="" og="" p-gsk3b="" blev="" bestemt="" som="" densitometriske="" forhold="" mellem="" respektive="" molekyle/gapdh="" som="" foldændringer="" sammenlignet="" med="" kontrol="" db/m="" mus.="" den="" relative="" aktivitet="" af="" gsk3b="" blev="" beregnet="" som="" forhold="" mellem="" p="" gsk3b="" og="" gsk3b="" som="" folder="" af="" kontrol="" db/m="" mus.="" (e)="" lineær="" regressionsanalyse="" viste="" en="" statistisk="" signifikant="" positiv="" sammenhæng="" mellem="" renal="" gsk3b-aktivitet="" ved="" 7="" ugers="" alderen="" hos="" db/db-mus="" og="" udviklingen="" og="" sværhedsgraden="" af="" ​​albuminuri,="" et="" kendetegn="">diabetikernyresygdomved 13 ugers alderen. R ¼ 0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Receiver operationskarakteristisk kurveanalyse viste, at renal GSK3b-aktivitet i tidlige stadier af diabetes (7 ugers alder) giver fremragende nøjagtighed og kraft til at forudsige udviklingen af ​​albuminuri og DKD ved 13 ugers alderen i db/db mus. Figur S2. Insulinresistens og høj glucose i omgivelserne aktiverer synergistisk GSK3b i nyreceller. (A) dyrkede murine podocytter, (B) urin glomerulære mesangiale celler (MMC'er) og (C) renale tubulære epitelceller (TEC'er) blev transficeret med scramblede siRNA oligonukleotider (siCon) eller siRNA oligonukleotider (siIRb) specifikke for b isoformen insulinreceptoren (IRB) til at modellere tilstanden af ​​insulinresistens in vitro. Celler blev derefter eksponeret i 48 timer for det normale glucoseholdige normale miljø (NG) eller det højt glucoseholdige diabetiske miljø (HG). Cellelysater blev opsamlet og underkastet immunoblotanalyse for IRB, p-GSK3b, GSK3b og GAPDH efterfulgt af densitometrisk analyse af blottene. *P < 0,01="" versus="" irb-ekspression="" i="" sicon-behandlede="" celler="" udsat="" for="" det="" samme="" miljø="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" versus="" det="" samme="" proteinekspression="" i="" siirb="" þ="" ng-="" eller="" sicon="" þ="" hg-gruppen="" (n="" ¼="" 3),="" &p="">< 0,05="" versus="" den="" samme="" proteinekspression="" i="" den="" anden="" þ="" hg="" eller="" siirb="" þ="" ng="" gruppe="" (n="" ¼="" 3).="" figur="" s3.="" ekspressionsniveauer="" af="" gsk3b-mrna="" i="" humane="" nyreprøver="" udtaget="" fra="" sunde="" levende="" donorer="" og="" patienter="" med="" diabetisk="" nefropati.="" data="" blev="" afledt="" fra="" www.nephroseq.org="" på="" basis="" af="" ju="" ckd="" glom-datasættet51="" og="" udtrykt="" som="" log2="" mediancentreret="" intensitet.="" figur="" s4.="" forbedret="" aktivitet="" af="" gsk3b="" i="" urineksfolierede="" celler="" indsamlet="" fra="" diabetespatienter="" i="" tidlige="" stadier="" forudsiger="" udviklingen="" af="" ​​diabetisk="" nyresygdom.="" (a,="" b)="" påvisning="" af="" gsk3b="" og="" aktiveret="" gsk3b="" i="" urineksfolierede="" celler="" indsamlet="" fra="" diabetespatienter="" i="" tidlig="" stadium="" (pts)="" og="" raske="" kontroller="" (ctrls).="" urineksfolierede="" celler="" blev="" opsamlet="" og="" lyseret.="" cellelysater="" blev="" behandlet="" til="" immunblotanalyse="" for="" gsk3b,="" p-gsk3b="" og="" gapdh.="" (c)="" immunoblots="" blev="" udsat="" for="" densitometrisk="" analyse.="" den="" relative="" overflod="" af="" gsk3b="" og="" p-gsk3b="" blev="" bestemt="" som="" densitometriske="" forhold="" mellem="" respektive="" molekyle/gapdh="" som="" foldændringer="" sammenlignet="" med="" kontroller="" (ctrl'er).="" den="" relative="" aktivitet="" af="" gsk3b="" blev="" beregnet="" som="" forhold="" mellem="" p-gsk3b="" og="" gsk3b="" som="" folder="" af="" normal="" kontrol="" (ctrls).="" (d)="" receiver="" operationskarakteristisk="" kurveanalyse="" viste,="" at="" den="" relative="" gsk3b-aktivitet="" (p-gsk3b/gsk3b-forhold)="" i="" urineksfolierede="" celler="" indsamlet="" fra="" tidlige="" diabetespatienter="" giver="" fremragende="" nøjagtighed="" i="" forudsigelse="" af="" udviklingen="">diabetisk nyresygdomom 5 år, hvor arealet under kurven (AUC) er 0.886.

REFERENCER

1. Umanath K, Lewis JB. Opdatering om diabetisk nefropati: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884-895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Ændringer i diabetesrelaterede komplikationer i USA, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514-1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan til forsinkelse eller forebyggelse af mikroalbuminuri ved type 2-diabetes. N Engl J Med. 2011;364:907-917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetiske mekanismer for diabetisk nefropati. J Am Soc Nephrol. 2005;16(suppl 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Klinisk manifestation og naturlig historie af diabetisk nefropati. Bidrag Nephrol. 2011;170:19-27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-års opfølgning af intensiv glukosekontrol ved type 2-diabetes. N Engl J Med. 2008;359:1577-1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. Mikroalbuminuri og risikoen for tidlig progressiv nyrefunktionsnedgang ved type 1-diabetes. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353-1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Risiko for progression af normoalbuminurisk CKD til nyresygdom i slutstadiet hos personer med diabetes: CRIC-undersøgelsen (Chronic Renal Insufficiency Cohort). Am J Nyre Dis. 2018;72:653-661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Behovet for tidlige prædiktorer for risiko for diabetisk nefropati: er albuminudskillelseshastigheden tilstrækkelig? Diabetes. 2000;49:1399-1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Lav glomerulær filtrationshastighed hos normoalbuminure type 1-diabetespatienter: en indikator for mere fremskredne glomerulære læsioner. Diabetes. 2003;52:1036-1040.

11. Krolewski AS. Progressiv nyrefald: det nye paradigme for diabetisk nefropati ved type 1-diabetes. Diabetes pleje. 2015;38:954-962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Ikke-proteinurisk diabetisk nefropati. J Clin Med. 2015;4:1761-1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Udvikling og progression af nefropati i type 2-diabetes: Det Forenede Kongerige Prospective Diabetes Study (UKPDS 64). Nyre Int. 2003;63:225-232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Urinbiomarkører i vurderingen af ​​tidlig diabetisk nefropati. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. Urin-IgG4 og Smad1 er specifikke biomarkører for renale strukturelle og funktionelle ændringer i de tidlige stadier af diabetisk nefropati. Diabetes. 2018;67:986-993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Exocytosemedieret urinudskillelse af megalin i fuld længde er forbundet med patogenesen af ​​diabetisk nefropati. Diabetes. 2017;66:1391-1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Glykogensyntase kinase 3b dikterer podocytmotilitet og fokal adhæsionsomsætning ved at modulere paxillinaktivitet: implikationer for den beskyttende effekt af lavdosis lithium i podocytopati. Am J Pathol. 2014;184:2742-2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glykogensyntase kinase-3: egenskaber, funktioner og regulering. Chem Rev. 2001;101:2527-2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glykogensyntasekinase-3 (GSK3): regulering, handlinger og sygdomme. Pharmacol Ther. 2015;148:114-131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. b-isoformen af ​​GSK3 medierer autonom podocytskade i proteinurisk glomerulopati. J Pathol. 2016;239:23.