Del 2 Påvisning af Cistanches Herba (Rou Cong Rong) lægemidler ved hjælp af artsspecifikke nukleotidsignaturer

Ved at søge nukleotidsignaturerne udviklet i denne undersøgelse fandt vi ud af, at 15 ud af 31 kinesiske patentlægemidler mærket som indeholdendeCistanches Herbaindeholdt i stedet forfalskningsstoffer, herunder otte forfalskede ingredienser og syv forfalskningsstoffer (tabel 2). For eksempel blev seks batcher erstattet med Cy. songaricum, herunder tre partier Shihu Yeguang-piller, et parti Kangguzhi Zengsheng-piller, et parti Sanbao-kapsler og et parti Wenweishu-partikler.

Desuden gav forskellige partier fra samme producent noget forskellige resultater. For eksempel, blandt tre batches fra én producent (ZCY16, ZCY69 og ZCY71), omfattede en batch en blanding af Ci.deserticolaog Cy. songaricum, en batch omfattede en blanding afCi. deserticolaogCi. tubulosaog en batch indeholdt kunCi. tubulosa. To batcher fra en anden producent (ZCY44 og ZCY70) var også forskellige: en batch indeholdt Cy. songaricum, hvorimod den anden batch indeholdtCi. deserticolaogCi. tubulosa.

Cistanches Herbablev fundet i 23 af de 31 testede kinesiske patentlægemidler (tabel 2), og kun 16 prøver var autentiske, f.eks. uden forfalskning eller forfalskede ingredienser.Ci. tubulosablev påvist i 16 partier af kinesisk patentmedicin, og Ci. deserticola blev påvist i 10 batches. O. coerulescens blev ikke påvist i nogen af ​​produkterne (tabel 2).

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

DISKUSSION

Nødvendigheden af ​​at udvikle en ny metode til overvågning af kommercielt tilgængelige lægemidler, der indeholderCistancherHerba

Cistanches Herbaer en tonic, der er meget brugt i genoprettende kinesiske patentmedicin og andre lægemidler. Kvalitetskontrollen af ​​kinesisk patentmedicin udgør dog en stor udfordring på grund af ingrediensernes mangfoldighed og kompleksitet. På grund af manglen på lovgivningsmæssigt tilsyn er der stor mulighed for produktforfalskning eller forfalskning. Derudover skal alle produkter behandles i overensstemmelse med farmakopéen eller andre standarder; forfalskning eller forfalskning er ikke tilladt under behandlingen. Der er således etableret forskellige kvalitetskontrolmetoder, såsom multi-hjerteskærende todimensionel væskekromatografi (Yao et al., 2015), nær-infrarød reflektansspektroskopi (Zhang og Su, 2014; Zhang et al., 2015) ), og væskekromatografi-massespektrometri (Wang et al., 2016b). De analytiske kemimetoder, der i øjeblikket findes i den kinesiske farmakopékommission (2015), kan dog ikke bruges til at autentificere alle ingredienserne i kinesisk patentmedicin eller til at detektere tilstedeværelsen af ​​forfalskende ingredienser. Desuden har undersøgelser vist, at målrettede metabolitter i planter ændres under produktforarbejdning, hvilket resulterer i betydelig variation i testresultater eller fuldstændig fiasko i testmetoder (Ananingsih et al., 2013). Således er molekylære værktøjer såsom artsspecifikke nukleotidsignaturer klar til at styrke kvalitetskontrolsystemer mod risikoen for svigagtig produktsubstitution og forfalskning og inklusion af umærkede ingredienser.

Selvom ITS/ITS2 betragtes som et højeffektivt værktøj til identifikation af naturlægemidler, kan disse sekvenser ikke amplificeres fra højt bearbejdede prøver (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang et al. rapporterede, at ITS2 ikke kunne amplificeres fra Angelicae Sinensis Radix-ekstrakt eller afkog kogt i mere end 120 minutter (Wang et al., 2016a). Ifølge traditionelle teknologier og den kinesiske farmakopékommission (2015) er Cistanches Herba altid højt forarbejdet for at øge dens medicinske effekt; disse processer omfatter ovntørring, saltning og dampning med vin (Zou et al., 2017), som fører til DNA-nedbrydning. Derudover tilsættes forskellige hjælpestoffer under forarbejdningen, såsom honning, stivelse og dextrin. Hvis disse hjælpestoffer ikke fjernes fuldstændigt, vil renheden af ​​DNA blive påvirket. For eksempel bruges følgende fremstillingsproces til at generere Cistanches Herba-holdige Sanbao-kapsler: "Kog de medicinske skiver i 1,5 time to gange, kombiner afkoggene og filtrer blandingen. Koncentrer filtratet til en relativ massefylde på 1,20-1,25 (ved 80°C) ◦C). Tilsæt andre formalede pulvere og kombiner dem for at opnå en homogen blanding. Tør derefter blandingen ved 60◦C, og mal den derefter til en fin

pulver." Efter den ovenfor beskrevne fremstillingsproces kunne der imidlertid opstå vanskeligheder under DNA-ekstraktion af kinesiske patentlægemidler, og lange fragmenter vil muligvis ikke blive amplificeret fra det nedbrudte DNA, hvilket ville forhindre identifikation af utroskabsstoffer. For således at sikre kvalitet og renhed af DNA, tilføjede vi yderligere trin før den genomiske DNA-ekstraktion, inklusive vask med forvaskebuffer og eluering af ti parallelle rør i et rør for hver batch.

Selvom alle de kinesiske patentlægemidler, der blev brugt i denne undersøgelse, indeholdt 6-25 ingredienser, kunne de udviklede primerpar specifikt forstærke sekvenserne af forfalskningerne i disse kinesiske patentlægemidler. Direkte sekventering af PCR-produkterne viste rene sporfiler. Denne nukleotidsignaturmetode er således i stand til at identificere både autentiske artsingredienser og forfalskning og bør udvide anvendelsen af ​​DNA-baserede molekylære diagnostiske værktøjer til markedsovervågning.

nyreskade og sygdom kan behandles med cistanche

Nukleotidsignaturer til effektiv identifikation af Cistanches Herba-produkter

Molekylære værktøjer, der anvender PCR-teknologi, er meget lovende til autentificering af lægemidler inden for kvalitetskontrolsystemer. Den vellykkede anvendelse af primerne til identifikation af DNA-nedbrudte adulteranter fra Cistanches Herba tyder på, at en PCR-baseret detektionsmetode kunne bruges bredt. På det kinesiske urtemedicinmarked er prisen på autentiske ingredienser fra Cistanches Herba-arter mere end fem gange højere end priserne på dets utroskabsstoffer. Vores resultater viste, at Cy. songaricum er den mest almindelige forfalskning af Cistanches Herba på markedet, efterfulgt af Ci. Sinensis. Cy. songaricum blev tilføjet, fordi disse lægemidler deler lignende morfologiske egenskaber. Hertil kommer den kemiske sammensætning af Ci. sinensis ligner Cistanches Herba. Som kvalitetskontrolmarkører tilCistanches Herbaekstrakter, echinacosid og acteosid kan udvindes billigt fra Ci. sinensis. Således bruger nogle farmaceutiske fabrikker Ci. sinensis som en erstatning i produktionen af ​​Cistanches Herba-ekstrakter. Samlet set tyder resultaterne af denne undersøgelse på, at der er betydelig svindel på markedet for lægemidler.

Forfalskning i kinesisk patentmedicin svarer til den, der findes i andre lande. Lignende niveauer af forfalskning er blevet registreret i Nordamerika (Newmaster et al., 2013), Europa (Raclariu et al., 2017) og Asien (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). I denne undersøgelse var den forfalskede andel af kinesisk patentmedicin cirka 48,4 procent, hvor kun 16 af de 31 prøver var autentiske Cistanches Herba. Derudover spekulerede vi i, at de forskellige resultater produceret i produkter fra samme producent kunne tilskrives forskelle i kvaliteterne af de forskellige partier af kinesisk medicinmaterialer. Derfor, for at kontrollere kvaliteten af ​​kinesisk patentmedicin, skal råvarerne autentificeres, før de forarbejdes til produkter.

Forfalskning afCistanches Herbahar traditionelt været forbundet med spørgsmål om udbud og efterspørgsel af råvarer.Ci. deserticolaogCi. tubulosaer de to oprindelige planter, der i øjeblikket bruges til at formulereCistanches Herba. Imidlertid har Ci. deserticola er den eneste originale art i traditionelle autentiske Cistanches Herba, der er opført i Chinese Pharmacopoeia Commission (2000), hvor Ci. tubulosa er identificeret som en ægteskabsbrud. På grund af manglen på Ci. deserticola ressourcer,Ci. tubulosahar været opført som et supplement i den kinesiske farmakopé siden 2005 (Jiang og Tu, 2009). Indtil for nylig har priserne på disse urter været markant forskellige; Ci. tubulosa har været meget billigere end Ci. deserticola, fordi der er et meget større udbud af førstnævnte. Her viste vores resultater, at Ci. tubulosa er mere udbredt i kommercielt tilgængelige Cistanches Herba-produkter.

Som konklusion er nukleotidsignaturerne og PCR-baserede

metoder udviklet i denne undersøgelse kan tjene som nyttige redskaber for lægemiddelindustrien til at autentificere ingredienser og påvise utroskabsstoffer iCistancherHerba produkter. I overensstemmelse med følsomhedsresultatet, selv om andelen af ​​adulterant var én ud af ti tusinde, kan det påvises via qRT-PCR. Det betyder, at når en nukleotidsignatur er detekteret iCistancherHerba-holdige funktionelle produkter, det kunne identificeres som en forfalskning eller forfalsket ingrediens. En ny løsning til påvisning af forfalskede ingredienser eller forfalskede Cistanches Herba blev leveret, som ikke tidligere var tilgængelig via kemiske detektionsmetoder i den kinesiske farmakopé. Derudover kunne denne metode bruges til at validere stigende typer medicin og til at udvide anvendelserne af DNA-baserede molekylære diagnostiske værktøjer til markedsovervågning.

For at aflastekronisknyresygdommedcistanche

FORFATTERS BIDRAG

JH udtænkte undersøgelsen og deltog i dens design. XW, RX og JC bidrog med prøver og udførte eksperimenterne. XW analyserede dataene. XW, JH, ZZ, S-GN, JS og SC udarbejdede manuskriptet. Alle forfattere har læst og godkendt det endelige manuskript.

FINANSIERING

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China [bevillingsnummer 81673552], CAMS Innovation

Fund for Medical Sciences [grant number 2016-I2 M- 3-016], og United Fund Key Project fra National Natural Science Foundation of China [grant nummer U1403224].

ANKENDELSER

Vi vil gerne takke vores kolleger, som hjalp med prøveindsamling, identifikation, laboratoriearbejde og manuskriptforberedelse, herunder Chaokui Sun, Dianyun Hou og Piao Zhang.

SUPPLERENDE MATERIALE

Det supplerende materiale til denne artikel kan findes online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/fuld#tillægsmateriale

Supplerende figur S1|Justeringsresultatet af ITS2-sekvens fra seks arter.

Supplerende figur S2|Agarosegelelektroforese af alle prøver.

Supplerende tabel S1|Prøveudtagning af oplysninger om Cistanches Herba og dens forfalskning.

Supplerende tabel S2|Sekvensinformation for beslægtede arter downloadet fra GenBank.

Supplerende tabel S3|De erklærede sammensætninger af forskellige kinesiske patentmedicinske prøver.

Supplerende datablad S1|Alle sekvenserne opnået i denne undersøgelse.

Cistanchedeserticola har mange effekter

REFERENCER

Ananingsih, VK, Sharma, A. og Zhou, W. (2013). Grøn te-katechiner under fødevareforarbejdning og opbevaring: en gennemgang af stabilitet og detektion. Food Res. Int. 50, 469-479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS og Wang, ZH (2007). Echinacoside forhindrer de striatale ekstracellulære niveauer af monoamin

neurotransmittere fra reduktion i 6-hydroxydopaminlæsionsrotter. J. Ethnopharmacol. 114, 285-289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., et al. (2010). Validering af ITS2-regionen som en ny DNA-stregkode til identifikation af medicinske plantearter. PLoS ONE 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., et al. (2014). Biologisk ingrediensanalyse af traditionel kinesisk medicinpræparat baseret på high-throughput-sekventering: historien om Liuwei Dihuang Wan. Sci. Rep. 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Den kinesiske farmakopékommission. (2000). Farmakopé af Folkerepublikken Kina. Del I. Beijing: China Medical Science Press.

Den kinesiske farmakopékommission. (2015). Farmakopé af Folkerepublikken Kina. Del I. Beijing: China Medical Science Press.

de Boer, HJ, Ichim, MC og Newmaster, SG (2015). DNA-stregkodning og lægemiddelovervågning af naturlægemidler. Drug Saf. 38, 611-620. DOI: 10.1007/s40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR og Haque, I. (2011). DNA-ministregkodning: en tilgang til retsmedicinsk identifikation af nogle truede indiske slangearter. Retsmedicinsk. Sci. Int. Genet. 5, 181-184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Edgar, RC (2004). MUSKEL: multipel sekvensjustering med høj nøjagtighed og høj gennemstrømning. Nucleic Acids Res. 32, 1792-1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Fu, L. (1991). Kina Plant Red Data Book. Del I. Beijing: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Song, J., Chen, S., Ragupathy, S., et al. (2017). Afledt teknologi til DNA-stregkodning (nukleotidsignatur og SNP-dobbeltspidsmetoder) detekterer forfalskning og substitution i kinesisk patentmedicin. Sci. Rep. 7:5858. DOI: 10.1038/s41598-017-05892-år

Gu, CM, Yang, XY og Huang, LF (2016). Cistanches Herba: en neurofarmakologisk gennemgang. Foran. Pharmacol. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB og Hebert, PDN (2006). En minimalistisk stregkode kan identificere en prøve, hvis DNA er nedbrudt. Mol. Ecol. Noter 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Japans farmakopékonvention. (2016). The Japanese Pharmacopoeia, 17. udg. Tokyo: Japans ministerium for sundhed, arbejde og velfærd, 1831-1832.

Jiang, Y. og Tu, PF (2009). Analyse af kemiske bestanddele i Cistanche-arter. J. Chromatogr. 1216, 1970-1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Keller, A., Schleicher, T., Schultz, J., Müller, T., Dandekar, T., og Wolf, M. (2009). 5.8S-28S rRNA-interaktion og HMM-baseret ITS2-annotering. Gene 430, 50-57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L., og Ito, Y. (2001). Præparativ isolering og oprensning af acteosid og 2'-acetylacteosid fra Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck ved højhastigheds modstrømskromatografi. J. Chromatogr. A 912, 181-185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J. og Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): en af ​​de bedste farmaceutiske gaver inden for traditionel kinesisk medicin. Foran. Pharmacol. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB, og Tu, PF (2013). Kemiske bestanddele fra Cistanche Sinensis (Orobanchaceae). Biochem. Syst. Ecol. 47, 21-24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X. og Han, J. (2016). En nukleotidsignatur til identifikation af amerikansk ginseng og dets produkter. Foran. Plant Sci. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M. og Shaw, PC (2015). Identifikation af bestanddele af urter i ginseng-afkog ved hjælp af DNA-markører. Hage. Med. 10:1. DOI: 10.1186/s13020-015-0029-x

Meusnier, I., Singer, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD og Hajibabaei, M. (2008). En universel DNA-ministregkode til biodiversitetsanalyse. BMC Genomics 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Grguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S. og Ragupathy, S. (2013). DNA-stregkodning registrerer forurening og substitution i nordamerikanske urteprodukter. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G., et al. (2017). Veronica officinalis-produktgodkendelse ved hjælp af DNA-metabarcoding og HPLC-MS afslører udbredt forfalskning med Veronica chamaedrys. Foran. Pharmacol. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S., og Sathishkumar, R. (2016). Estimering af urteproduktgodkendelse og forfalskning i Indien ved hjælp af et vouchert, DNA-baseret biologisk referencematerialebibliotek. Drug Saf. 39, 1211-1227. DOI: 10.1007/s40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. og Han, JP (2012). Molekylær identifikation af Cistanches Herba og dets forfalskningsstoffer baseret på nrITS2-sekvens. J. Med. Planter Res. 6, 1041-1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., og Kumar, S. (2011). MEGA5: molekylær evolutionær genetik analyse ved hjælp af maksimal sandsynlighed, evolutionær afstand og maksimal sparsomhed metoder. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX, et al. (2016b). Samtidig kvantificering af 50 bioaktive forbindelser med den traditionelle kinesiske medicinformel Gegen-Qinlian afkog ved hjælp af ultrahøjtydende væskekromatografi kombineret med tandem massespektrometri. J. Chromatogr. 1454, 15–25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY og Xie, WY (2012). Cistanche deserticola

YC Ma, "Desert ginseng": en anmeldelse. Er. J. Chin. Med. 40, 1123-1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J. og Chen, S. (2016a). En nukleotidsignatur til identifikation af Angelicae Sinensis Radix (Danggui) og dets produkter. Sci. Rep. 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

et al. (2015). Samtidig kvantificering af fem Panax notoginseng-saponiner ved multi-hjerteskærende todimensionel væskekromatografi: metodeudvikling og anvendelse til kvalitetskontrol af otte Notoginseng-holdige kinesiske patentlægemidler. J. Chromatogr. 1402, 71-81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C. og Su, J. (2014). Anvendelse af nær-infrarød spektroskopi til analyse og hurtig kvalitetsvurdering af traditionelle kinesiske lægemidler. Acta. Pharm. Synd. B 4, 182-192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., et al. (2015). Nær-infrarød reflektansspektroskopi (NIRS) til hurtig bestemmelse af ginsenosid Rg1 og Re i kinesisk patentmedicin Naosaitong-pille. Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 139, 184-188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P., og Jiang, Y. (2017). Anvendelse af 1H NMR-baseret metabolomik til diskrimination af forskellige dele og udvikling af en ny behandlingsarbejdsgang for Cistanche deserticola. Acta. Pharm. Synd. B 7, 647-656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Erklæring om interessekonflikt: Forfatterne erklærer, at undersøgelsen blev udført i fravær af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Copyright © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang og Chen. Dette er en artikel med åben adgang, der distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution License (CC BY). Brug, distribution eller reproduktion i andre fora er tilladt, forudsat at den eller de originale forfattere og copyright-indehaverne krediteres, og at den originale publikation i dette tidsskrift er citeret i overensstemmelse med accepteret akademisk praksis. Ingen brug, distribution eller reproduktion er tilladt, som ikke er i overensstemmelse med disse vilkår.