Del 2: En hæmmer af NF-kB og en agonist af AMPK: Netværksforudsigelse og multi-omics-integration til at udlede signalveje for akteosid mod Alzheimers sygdom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1 , Yuan-Yuan Shi2 , Xiao-Li Jiang1 , Shan-Shan Wu1 , Ping Zhou1 , Hui-Ying Wang1 , Ping Li1* og Fei Li1,2*

¹ Stat Nøgle Laboratorium af Naturlig Lægemidler, Kina Farmaceutisk Universitet, Nanjing, Kina, ² Kollegium af Apotek,Xinjiang Medical University, Urumqi, Kina

Alzheimers sygdom(AD) er den hyppigste form for demens.Acteosid(ACT) er en forbindelse isoleret fraCistanche tubulosa, som besidder fremragende neurobeskyttende egenskaber. Den underliggende mekanisme for ACT til regulering af mikroglia-polarisering forbliver imidlertid dårligt defineret. Derfor blev der etableret en beregningsnetværksmodel for at identificere drivmålene for ACT og forudsige dens mekanisme ved at integrere flere tilgængelige databaser. Den AlCl3-inducerede AD(Alzheimers sygdom) model i zebrafiskelarver blev konstitueret med succes for at demonstrere den terapeutiske effekt af ACT. Efterfølgende afslørede LPS-inducerede BV-2-celler den positive rolle af ACT i M1/M2-polarisering. NF-kB- og AMPK-vejene blev yderligere bekræftet ved transkriptomisk analyse, metabolomisk analyse, molekylærbiologiske teknikker og molekylær docking. Forskningen gav en infusiv mekanisme for ACT og afslørede forbindelsen mellem metabolisme og mikroglia-polarisering fra mitokondriefunktionens perspektiv. Endnu vigtigere var det, at det gav en systematisk og omfattende tilgang til opdagelsen af ​​lægemiddelmål, herunder ændringer i gener, metabolitter og proteiner.

Nøgleord: akteosid, BV-2-celler, metabolisme, RNA-seq, mitokondrier, neuroinflamation

Venligst klik her til del 1

Behandling forAlzheimerssygdom:Cistanche tubulosa

ACT Mitigated LPS-induced BV-2 mitokondriel dysfunktion

Mitokondrier er kernen i metaboliske veje. Udviklende beviser viser, at mitokondrier er en nøglespiller i mikroglial M1/M2-polarisering. En oversigt over mitokondrierstatus i morfologi og cellefordeling blev bedømt ved TEM. Efter LPS-stimulering blev kromatinet af BV-2-celler kondenseret, og cytoplasmaet og mitokondrierne blev reduceret (figur 4A). Derudover blev de mitokondrielle cristae i LPS-gruppen uarrangerede eller endda forsvundet, hvilket udviste delvis kristolyse, størrelsesreduktion og rundformet morfologi. Interessant nok kunne ACT-behandling lindre LPS-inducerede morfologiske ændringer på mitokondrier. På skift undersøgte vimitokondriefunktionen af ​​LPS-behandlede BV-2-celler, inklusive MMP- og ATP-produktion. MMP (Figur 4B) og ATP-produktionen i mitokondrier (Figur 4C) var signifikant forbedret i ACT-gruppen sammenlignet med dem i LPS-gruppen. Mitokondriel dysfunktion kan være relateret til det øgede niveau af ROS i cellen. Flowcytometrianalyse afslørede, at indholdet af ROS var overbelastet i LPS-gruppen (figur 4D). Heldigvis eliminerede ACT overdreven ROS. Det tyder på, at ACT kan genoprette mitokondrierfunktionen ved at rydde ROS.

ACT genoprettede mitokondrierfunktion gennem opregulering af PGC-1 og UCP-2

Peroxisom proliferativt aktiveret receptor-y co-aktivator-1a (PGC-1a) spiller en vigtig rolle i mitokondriel biogenese (Bi et al., 2019). Stimuleringen af ​​LPS reducerede ekspressionen af ​​PGC-1a, hvilket udviste mitokondrie dysfunktion. Bemærkelsesværdigt var PGC-1et gen-mRNA og proteinekspression signifikant reverseret ved ACT-behandling i LPS-behandlede BV-2-celler (figur 4E).

Det mitokondrielle afkoblingsprotein-2 (UCP-2) var også kendt for at regulere mitokondriel funktion. Som et nedstrøms protein af PGC-1a kan det kontrollere LPS-induceret MMP-depolarisering og ROS-produktion. Nylige rapporter indikerer, at det er centralt for processen med mikroglial aktivering, med modsat regulering af M1 og M2 polarisering (De Simone et al., 2015). Western blot-resultater viste, at UCP-2-proteinniveauet var faldet efter LPS-stimulering. Samtidig behandling af LPS og ACT kunne opregulere ekspressionen af ​​UCP-2 sammenlignet med LPS-behandlingen. mRNA-ekspressionsniveauet for UCP-2 viste også lignende ændringer (figur 4F). For at opsummere genoprettede ACT mitokondriernes funktion gennem opregulering af PGC-1a og UCP-2.

ACT undertrykt Microglia M1-polarisering via AMPK-aktivering

Som en central cellulær energisensor spiller AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK) en vigtig rolle i at opretholde cellemetabolismebalancen. Samtidig er PGC-1a et nedstrømsprotein af AMPK. Som vist i analysen af ​​netværksmodellen kan ACT regulere AMPK-vejen (figur 1B). Resultater afslørede, at LPS hæmmede aktiveringen af ​​AMPK, hvilket resulterede i celle

stofskifteforstyrrelser og mitokondriel dysfunktion. Det er bemærkelsesværdigt, at ACT dosisafhængigt kunne øge proteinekspressionen af ​​p-AMPK (figur 5A). Det foreslås, at ACT kan øge ekspressionen af ​​PGC-1a og genoprette mitokondriel funktion ved at aktivere AMPK-signalvejen.

I denne undersøgelse, for at undersøge, om aktiveringen af ​​AMPK bidrog til reguleringseffekten af ​​ACT på M1/M2-polarisering, blev forbindelse C (CC) anvendt til at hæmme effekten af ​​AMPK. I modsætning til det nedregulerede NO-niveau i ACT-behandlingsgruppen blokerede CC delvist effekten af ​​ACT på NO-niveauet (figur 5B). Baseret på disse resultater kunne ACT regulere M1/M2-polarisering af BV-2-celler ved aktivering af AMPK.

ACT-binding til og hæmmet NF-kB samt aktiveret AMPK

Molekylær docking blev anvendt for at bekræfte, om ACT binder til NF-kB- og AMPKa-proteinerne. Fund viste, at bindingsenergien for ACT og NF-kB var -8,4 kcal/mol, mens den for ACT og AMPKa var -10,8 kcal/mol. Signifikante afffiniteter verificerede, at ACT bandt direkte til NF-kB og AMPKa (figur 5C,D,F,G). Efterfølgende blev de mulige bindingsmåder og interaktioner i aminosyrelommerne yderligere undersøgt, herunder 11 aminosyrerester af NF-kB (figur 5E) samt 12 aminosyrerester af AMPKa (figur 5H). Disse resultater indikerede, at ACT direkte kunne påvirke NF-kB og AMPKa for at dæmpe BV-2 mikroglia M1-polarisering og fremme M2-fænotypen.

Cistanche urt

DISKUSSION

Alzheimers sygdomer en progressiv neuronal og kognitiv dysfunktionssygdom med komplekse dysregulerede mekanismer (Fakhri et al., 2020). Akkumulerende beviser har vist, at der er en signifikant sammenhæng mellem mikroglia-drevet betændelse i hjernen. Mikroglia er makrofager i hjernen (Afridi et al., 2020), der kunne aktiveres til en klassisk M1 inflammatorisk fænotype, karakteriseret ved øget sekretion af proinflammatoriske cytokiner (Hanslik og Ulland, 2020). Som en konsekvens heraf kan overdreven M1-aktivering accelerere neuronskade og neurodegeneration og endda forværre AD(Alzheimers sygdom)(Bagheri-Mohammadi, 2020). Det er således bydende nødvendigt at søge nye terapeutiske tilgange rettet mod at kontrollere mikroglia-polarisationspunkter for at give adaptive fordele.

Vores tidligere arbejde har verificeret, at ACT har betydelige effekter på at forbedre indlærings- og hukommelsesevnen og beskytte neuronerne i rotter (Chen Y. et al., 2020). Konsekvent viste denne undersøgelse også, at ACT kunne lindre AlCl3-induceret dyskinesi og forstyrrelse af det kolinerge system hos zebrafisk. Begejstret præsenterede ACT bemærkelsesværdige anti-inflammatoriske aktiviteter i LPS-inducerede BV-2-celler.

ACT undertrykte M1-polarisering ved at hæmme NK-kB-vejen. Udover NF-kB-vejen, opdagede RNA-seq og HPLC-Q-TOF-MS-analyse også, at ACT-behandling kunne påvirke arginin-biosyntese såvel som pantothenat- og CoA-biosyntese. Det er blevet bredt rapporteret, at iNOS kunne metabolisere Arg til NO og citrullin, hvorimod Arg-1 kunne hydrolysere Arg til ornithin og urinstof, som er forbundet med neuronreparation (Rath et al., 2014). LPS-stimulering førte til opregulering af iNOS (figur 2D) og nedregulering af Arg-1 (figur 2E), hvilket resulterede i øget NO-niveau (figur 2C). Dataene afslørede, at ACT lindrede det øgede NO-niveau igennem

arginin biosyntese.

Pantothensyre (PA) er det primære substrat for pantothenatkinase (Kumar et al., 2020) og den hastighedsbegrænsende metabolit i CoA-biosyntese. PA er den obligatoriske forløber for acetyl-CoA, som er af særlig betydning for cholinerge neuroner (Xu et al., 2020) og deltager i tricarboxylsyre (TCA) cyklus (Atamna, 2004). Nylige undersøgelser viste, at forhøjet koncentration af CoA ville føre til ændret mitokondriel morfologi og lavere ATP-indhold (Kumar et al., 2020). LPS-inducerede BV-2-celler udviste et fald i antallet af mitokondrier og en ændring af mitokondriel form. Efter LPS-induktion steg produktionen af ​​ROS i BV-2-celler. Derefter forårsagede den overbelastede ROS, at membranphospholipid blev angrebet af frie radikaler (Magnani et al., 2020), hvilket førte til tab af MMP og igen mitokondriel dysfunktion og ATP-udtømning. Det var enestående, at ACT-behandling mindskede faldet i MMP- og ATP-indhold. Disse data antydede, at ACT inducerede mitokondriel dysfunktion ved at regulere pantothenat- og CoA-biosyntese.

Det er blevet omfattende rapporteret, at mikroglia-polarisering er tæt forbundet med cellemetabolisme (Orihuela et al., 2016). Især som metabolisk hub spiller mitokondrier bemærkelsesværdige roller i regulering af cellemetabolisme. For nylig er mitokondrier blevet positioneret som et nøgledeterminantpunkt i mikroglia-polarisering (Harry et al., 2020). For bedre at forstå ACT-mekanismen vurderede vi mitokondriers funktionelle akse ved Western blot. Det afslørede, at ACT inducerede mitokondriel dysfunktion ved aktivering af AMPKa/PGC-1/UCP-2-aksen.

PGC-1a og UCP-2 er begge relateret til mitokondriel biogenese (Uittenbogaard og Chiaramello, 2014; de Oliveira Bristot et al., 2019), og de kan opfattes som hovedregulatorerne for ROS (Jamwal) et al., 2020). Rapporter indikerede, at PGC-1a-medieret mitokondriel biogenese og reduktion af ROS er afhængig af induktion af UCP-2 (Uittenbogaard og Chiaramello, 2014; de Oliveira Bristot et al., 2019; Jamwal et al., 2020). På grund af overbelastning af ROS blev udtrykket af PGC-1a og UCP-2 nedreguleret i LPS-inducerede BV-2-celler. Det foreslog, at ACT kunne eliminere overdreven ROS gennem PGC-1a og UCP-2 og dermed genoprette mitokondriefunktionen. Ifølge litteraturen kunne ændringen af ​​PGC-1a i BV-2-celler bidrage til at regulere polarisering. Interessant nok har tidligere rapport fundet, at øget PGC-1a-udtryk hæmmede NF-kB-aktiviteten i LPS-inducerede BV-2-celler (Yang et al., 2017), hvilket kvalificerede forholdet mellem PGC{{ 24}}a og NF-kB i vores undersøgelse.

Ekspressionen af ​​PGC-1a er påvirket af opstrøms pathway-proteiner, såsom AMPK. AMPK er et nøgleprotein for

vedligeholdelse af cellulær homeostase (Qiu et al., 2020), der spiller forskellige roller i at fremme M2-polarisering af mikroglia (Chu et al., 2019). Det modulerer metaboliske veje i celler (Szewczuk et al., 2020). Vi fandt ud af, at ACT fremmede aktiveringen af ​​AMPK. Samtidig blokerede anvendelsen af ​​forbindelse C (AMPK-hæmmer) virkningen af ​​ACT på at svække LPS-induceret NO-overskud. Derfor undertrykte ACT også LPS-stimuleret M1-polarisering via AMPK-signalvejen.

Det er første gang at rapportere ACT-mekanismen til regulering af mikroglia-polarisering (figur 6). Dataene understøttede, at ACT kunne udvikles som et terapeutisk middel til neurodegenerativ sygdom forbundet med neuroinflammation, såsom AD(Alzheimers sygdom). Især koblede vi mikroglia-polariseringen med cellemetabolisme, hvilket forklarede effekten af ​​ACT gennem ændringen af ​​mitokondriernes funktion. Identifikationen af ​​denne metaboliske akse, som et mål for en unik enhed, kan føre til meget bedre terapeutiske tilgange mod mikroglia M1-polarisering, især i AD(Alzheimers sygdom).

Anti-Alzheimersygdom:Cistanche tubulosa

REFERENCER

1. Afridi, R., Lee, WH, og Suk, K. (2020). Microglia er gået skævt: forbinder immunmetabolisme med neurodegeneration. Foran. Cell Neurosci. 14:246. doi: 10.3389/fncel.2020.00246

2. Agrawal, I. og Jha, S. (2020). Mitokondriel dysfunktion ogAlzheimers sygdom: rolle af mikroglia. Foran. Aldrende Neurosci. 12:252. doi: 10.3389/fnagi.2020.00252

3. Atamna, H. (2004). Hæm, jern og mitokondrielt henfald af aldring. Aldring Res. Åb. 3, 303-318. doi: 10.1016/j.arr.2004.02.002

4. Bagheri-Mohammadi, S. (2020). Microglia indAlzheimerssygdom: Rollen af ​​stamcelle-mikroglia-interaktion i hjernens homeostase. Neurochem. Res. 46, 141-148. doi: 10.1007/s11064-020-03162-4

5. Bi, J., Zhang, J., Ren, Y., Du, Z., Li, Q., Wang, Y., et al. (2019). Irisin lindrer leveriskæmi-reperfusionsskade ved at hæmme overdreven mitokondriel fission, fremme mitokondriel biogenese og mindske oxidativt stress. Redox Biol. 20, 296-306. doi: 10.1016/j.redox.2018.10.019

6. Chen, J., Gao, L., Zhang, Y., Su, Y., Kong, Z., Wang, D., et al. (2020). Acteosid-forbedret streptozotocin-induceret indlærings- og hukommelsessvækkelse ved at opregulere hippocampus insulin, glukosetransport og energimetabolisme. Phytother. Res. 35, 392-403. doi: 10.1002/ptr.6811

7. Chen, Y., Li, YQ, Fang, JY, Li, P., og Li, F. (2020). Etablering af den samtidige forsøgsmodel for osteoporose kombineret medAlzheimerssygdomhos rotter og de dobbelte effekter af echinacosid og acteosid fraCistanche tubulosa. J. Ethnopharmacol. 257, 112834. doi: 10.1016/j.jep.2020.112834

8. Chu, X., Cao, L., Yu, Z., Xin, D., Li, T., Ma, W., et al. (2019). Hydrogenrigt saltvand fremmer mikroglia M2-polarisering og komplement-medieret synapsetab for at genoprette adfærdsmæssige underskud efter hypoxi-iskæmisk i neonatale mus via AMPK-aktivering. J. Neuroinflammation 16:104.

9. de Oliveira Bristot, VJ, De Bem Alves, AC, Cardoso, LR, Da Luz Scheffer, D., og Aguiar, AS Jr. (2019). Rollen af ​​PGC-1alfa/UCP2-signalering i de gavnlige virkninger af fysisk træning på hjernen. Foran. Neurosci. 13:292. doi: 10.3389/fnins.2019.00292

10. De Simone, R., Ajmone-Cat, MA, Pandolfi, M., Bernardo, A., De Nuccio, C., Minghetti, L., et al. (2015). Det mitokondrielle afkoblingsprotein-2 er en masterregulator for både M1 og M2 mikrogliale responser. J. Neurochem. 135, 147-156. doi: 10.1111/jnc.13244

11. Fakhri, S., Pesce, M., Patruno, A., Moradi, SZ, Iranpanah, A., Farzaei, MH, et al. (2020). Dæmpning af Nrf2/Keap1/ARE inAlzheimerssygdomaf plantesekundære metabolitter: en mekanistisk gennemgang. Molecules 25:4926. doi: 10.3390/ molecules25214926

12. Hanslik, KL, og Ulland, TK (2020). Rollen af ​​mikroglia og Nlrp3-inflammatoriet iAlzheimerssygdom. Foran. Neurol. 11:570711. doi: 10.3389/ fneur.2020.570711

13. Harry, GJ, Childers, G., Giridharan, S. og Hernandes, IL (2020). En sammenhæng mellem mitokondrier og mikroglia-effektfunktion. Hvad tror vi, vi ved? Neuroimmunol. Neuroinflammation. 7, 150-165.

14. Jamwal, S., Blackburn, JK og Elsworth, JD (2020). PPARgamma/PGC1alpha-signalering som et potentielt terapeutisk mål for mitokondriel biogenese i neurodegenerative lidelser. Pharmacol. Ther. 219:107705. doi: 10.1016/j. pharmthera.2020.107705

15. Ji, SL, Cao, KK, Zhao, XX, Kang, NX, Zhang, Y., Xu, QM, et al. (2019). Antioxidantaktivitet af phenylethanoidglycosider på glutamatinduceret neurotoksicitet. Biosci. Biotechnol. Biochem. 83, 2016-2026. doi: 10. 1080/09168451.2019.1637243

16. Kumar, A., Kumar, Y., Sevak, JK, Kumar, S., Kumar, N. og Gopinath, SD (2020). Metabolomisk analyse af primære humane skeletmuskelceller under myogen progression. Sci. Rep 10:11824.

17. Lai, X., Xiong, Y., Zhou, J., Yang, F., Peng, J., Chen, L., et al. (2019). Verbascoside dæmper akut inflammatorisk skade i eksperimentel cerebral blødning ved at undertrykke TLR4. Biochem. Biofys. Res. Commun. 519, 721-726. doi: 10. 1016/j.bbrc.2019.09.057

18. Li, L., Wang, Y., Wang, H., Lv, L. og Zhu, ZY (2020). Metaboliske reaktioner fra BV-2-celler på puerarin på dets polarisering ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi-massespektrometri. Biomed. Chromatogr. 34:e4796.

19. Li, W., Deng, R., Jing, X., Chen, J., Yang, D. og Shen, J. (2020). Acteosid forbedrer eksperimentel autoimmun encephalomyelitis ved at hæmme peroxynitrit-medieret mitofagiaktivering. Fri Radik. Biol. Med. 146, 79-91. doi: 10.1016/j.freeeradbiomed.2019.10.408

20. Li, YQ, Chen, Y., Fang, JY, Jiang, SQ, Li, P. og Li, F. (2020).

21. Integreret netværksfarmakologi og zebrafiskemodel til at undersøge dobbelteffektkomponenter afCistanche tubulosatil behandling af både osteoporose ogAlzheimerssygdom. J. Ethnopharmacol. 254, 112764. doi: 10.1016/j.jep.2020. 112764

22. Linnerbauer, M. og Rothhammer, V. (2020). Beskyttende funktioner af reaktive astrocytter efter fornærmelse af centralnervesystemet. Foran. Immunol. 11:573256. doi: 10.3389/fimmu.2020.573256

23. Magnani, ND, Marchini, T., Calabro, V., Alvarez, S. og Evelson, P. (2020). Mitokondriers rolle i redox-signaleringsnetværket og dets resultater i inflammatoriske syndromer med høj indvirkning. Foran. Endokrinol. (Lausanne) 11:568305. doi: 10.3389/fendo.2020.568305

24. Orihuela, R., Mcpherson, CA, og Harry, GJ (2016). Mikroglial M1/M2 polarisering og metaboliske tilstande. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665. doi: 10.1111/ bph.13139

25. Perea, JR, Bolos, M. og Avila, J. (2020). Microglia indAlzheimerssygdomi forbindelse med tau-patologi. Biomolecules 10:439.

26. Qiu, WQ, Pan, R., Tang, Y., Zhou, XG, Wu, JM, Yu, L., et al. (2020). Lychee frø polyphenol hæmmer Abeta-induceret aktivering af NLRP3 inflammasom via den LRP1/AMPK-medierede autofagi-induktion. Biomed. Pharmacother. 130:110575. doi: 10.1016/j.biopha.2020.110575

27. Rath, M., Muller, I., Kropf, P., Closs, EI, og Munder, M. (2014). Metabolisme via arginase eller nitrogenoxidsyntase: to konkurrerende argininveje i makrofager. Foran. Immunol. 5:532. doi: 10.3389/fimmu.2014.00532

28. Shiao, YJ, Su, MH, Lin, HC og Wu, CR (2017). Acteosid og isoacteosid beskytter amyloid beta-peptid-induceret cytotoksicitet, kognitivt deficit og neurokemiske forstyrrelser in vitro og in vivo. Int. J. Mol. Sci. 18:895. doi: 10.3390/ijms18040895

29. Szewczuk, M., Boguszewska, K., Kazmierczak-Baranska, J. og Karwowski, BT (2020). AMPKs rolle i metabolisme og dets indflydelse på reparation af DNA-skader. Mol. Biol. Rep. 47, 9075-9086. doi: 10.1007/s11033-020-05900-x

30. Tsukahara, T., Haniu, H., Uemura, T. og Matsuda, Y. (2020). Terapeutisk potentiale af svinelevernedbrydningsprodukt: ny indsigt og perspektiver for mikroglia-medieret neuroinflammation i neurodegenerative sygdomme. Biomedicines 8:446. doi: 10.3390/biomedicines8110446

31. Uittenbogaard, M. og Chiaramello, A. (2014). Mitokondriel biogenese: et terapeutisk mål for neuroudviklingsforstyrrelser og neurodegenerative sygdomme. Curr. Pharm. Des. 20, 5574-5593. doi: 10.2174/1381612820666140305224906

32. Wei, W., Lu, M., Lan, X., Liu, N., Wang, H., Du, J., et al. (2019). Neurobeskyttende effekt af verbascoside på hypoxisk-iskæmisk hjerneskade hos neonatal rotte. Neurosci. Lett. 711:134415. doi: 10.1016/j.neulet.2019.134415

33. Xu, J., Patassini, S., Begley, P., Church, S., Waldvogel, HJ, Faull, RLM, et al. (2020). Cerebral mangel på vitamin B5 (d-pantothensyre; pantothenat) som en potentielt reversibel årsag til neurodegeneration og demens i sporadiskAlzheimerssygdom. Biochem. Biofys. Res. Commun. 527, 676-681. doi: 10. 1016/j.bbrc.2020.05.015

34. Yang, X., Xu, S., Qian, Y. og Xiao, Q. (2017). Resveratrol regulerer mikroglia M1/M2-polarisering via PGC-1alfa under tilstande med neuroinflammatorisk skade. Hjernens adfærd. Immun. 64, 162-172. doi: 10.1016/j.bbi.2017.03.003

Cistanche tubulosa