DEL 1 Regulativt forhold mellem kvalitetsvariation og miljø af Cistanche Deserticola i tre økotyper baseret på jordmikrobiomanalyse

Miljøet påvirker sammensætningen og funktionen af ​​jordmikrobiomet, hvilket indirekte påvirker planternes kvalitet. I denne undersøgelse blev 16S amplikonsekventering brugt til at afsløre forskellene ijord mikrobielle samfund sammensætning afCistanche deserticolai tre økotyper (salt-alkali-jord, græsarealer og sandet land). gennem korrelationsanalysen af ​​mikrobielle samfundsoverflod, phenylethanoid glycosidindhold og økologiske faktorer, det regulatoriske forhold mellem mikrobielle samfund og kvalitetsvariationen afC. deserticolablev udlagt. den metaboliske funktionsprofil af jordmikrobiomet blev forudsagt ved hjælp af Tax4Fun. Data viste, at de mikrobielle jordbundssamfund i de tre økotyper var signifikant forskellige (AMOVA, P < 0.001),="" og="" alfa-diversiteten="" i="" det="" mikrobielle="" samfund="" af="" græsmarksjord="" var="" den="" højeste.="" kernemikrobiomanalyse="" viste,="" at="" jordens="" mikrobielle="" samfund="">C. deserticolahavde for det meste tørke, salttolerance, alkaliresistens og stressresistens, såsom Micrococcales og Bacillales. Biomarkørerne, nemlig oceanospirillales (salt-alkali-land), Sphingomonadales (græsarealer) og propionibacteriales (sandjord), kan skelne mellem tre økotype mikrobielle samfund, blev udgravet gennem LEfSe og tilfældig skov. Korrelationsanalyseresultater viste, at 2'-acetylacteosid er positivt korreleret med oceanospirillaler i saltvand-alkali jordjord. De metaboliske funktionsprofiler viste stærkt berigede metabolisme (kulhydrat- og aminosyremetabolisme) og miljøinformationsbehandling (membrantransport og signaltransduktion) veje. samlet set viste sammensætningen og funktionen af ​​jordmikrobiomer sig at være vigtige faktorer for kvalitetsvariationen afC. deserticolai forskellige økotyper. Dette arbejde gav ny indsigt i det regulatoriske forhold mellem miljøet, jordens mikrobielle samfund og plantekvalitetsvariation.

Yderligere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

Cistanche deserticolaer en ikke-fotosyntetisk parasitisk plante, der kan vokse i tørre levesteder, såsom sandet land og tør flodgrøft, samt under stressende forhold, såsom saltvand-alkali-land1. Denne plante parasiterede på rødderne af psammophyte Haloxylon ammodendron, som viser stærk modstand mod barske miljøforhold2. Planter er afhængige af den gavnlige interaktion mellem rødder og mikroorganismer for at opnå næringsstoffer, fremme vækst og modstå ekstern stress3. I mellemtiden styrer jordens mikrobiome det biogeokemiske kredsløb af makronæringsstoffer, mikronæringsstoffer og andre elementer, der er afgørende for plantevækst4. Dog forholdet mellemC. deserticolaog rhizosfærens jordmikroorganismer forbliver uklare. Som følge heraf præsenterer rhizosfærens jordmikrobiom afC. deserticolaer nødvendigt.

C. deserticolabruges ofte i Østasien, Centralasien, Nordafrika og andre lande som en slags mad- og sundhedsmedicin for at forbedre hukommelsen, forbedre den seksuelle funktion og beskytte leveren5,6. De vigtigste aktive ingredienser afC. deserticolaer phenylethanoidglycosider (PhGs), iridoider, lignaner og polysaccharider. Blandt disse komponenter er phG'erne de aktive komponenter7. Tidligere undersøgelse rapporterede, at indholdet af PhG'er i forskellige økotyper afC. deserticolabetydeligt forskellig, blandt hvilke 2'-acetylacteosid kunne bruges som en kemisk markør til at skelneC. deserticolaproduceret i Xinjiang og Indre Mongoliet1. Undersøgelser af mikrobielle samfund har vist, at mikrobielle samfund kan regulere metabolismen af ​​deres værter8,9. Derfor er en sammenligning af forholdet mellem mikrobielle samfund og metabolitter i rhizosfærens jord afC. deserticolai forskellige økotyper er et presserende behov.16S amplikon sekventering af planter rhizosfære jordprøver er blevet udført for at udforske mangfoldigheden af ​​mikrobielle samfund, hvilket giver ny indsigt i forholdet mellem planter og jord mikrobielle samfund10,11. For eksempel blev sammenhængen mellem endofytiske svampes fordeling og dynamik med C. songaricum og N. tangutorum undersøgt i mikrobiomundersøgelser ved hjælp af high-throughput sekventering11. I denne undersøgelse udførte vi 16S rRNA amplikon sekventering for at opnå jordmikrobiomer afC. deserticolai forskellige økotyper. Forskellene i jordens mikrobielle samfund i forskellige økotyper blev også sammenlignet, og de biomarkører, der kunne skelne mellem de tre økotyper, blev udgravet. Korrelationsanalyse blev derefter beregnet via den vigtigste mikrobielle samfundsoverflod, indholdet af PhG'er og økologiske faktorer, og det regulatoriske forhold blev undersøgt. Endelig, funktionen af ​​jord mikrobiomer afC. deserticolai forskellige økotyper blev forudsagt.

Materialer og metoder

Undersøgelsesstedsbeskrivelse og prøveudtagning.Ifølge feltundersøgelser,C. deserticolahar tre hovedøkotyper, herunder saltholdig-alkali-jord, græsarealer og sandjord. I april 2017 indsamlede vi jordprøver, der repræsenterede de vigtigste økotyper afC. deserticolai Kina. Jordprøver af saltvand-alkali-jord blev indsamlet fra Ebinur-søen (AB1, AB2, AB3) og Baicheng Beach (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5) i Xinjiang-provinsen. Græsjordsprøver blev taget fra Tula Village (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5) i Xinjiang-provinsen. Jordprøver af sandet land blev indsamlet fra Alxa (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) i Indre Mongoliet-provinsen og Minqin-amtet (GS1, GS2), Changcheng-amtet (GS3, GS4) i Gansu-provinsen. Længde-, bredde- og højdeoplysningerne for alle prøveudtagningspunkter er vist i tabel 1 og fig. 1. På markstedet brugte vi et cylindrisk bor i rustfrit stål med en diameter på 5 cm til at opsamle jorden ved siden af ​​den saftige stilk afC. deserticolaog dens vært, og opbevarede den øjeblikkeligt i et bærbart køleskab ved –20 grader . Efter transport til laboratoriet blev jordprøverne ført gennem en 2-mm sigte for at fjerne plantevæv, rødder, sten osv. og opbevaret ved –20 grader i køleskab før yderligere eksperimenter.

DNA-ekstraktion og 16S rRNA-sekventering.Jord-DNA blev ekstraheret ved hjælp af PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) efter manualen12. Renheden og kvaliteten af ​​det genomiske DNA blev kontrolleret ved 0,8 procent agarosegelelektroforese og nanodrop.

Den V3-V4 hypervariable region af bakterielt 16S rRNA-gen blev amplificeret med primerne 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) og 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. For hver jordprøve blev der tilføjet en 10-cifret stregkodesekvens til 5′-enden af ​​de frem- og tilbagegående primere (Allwegene Company, Beijing)12. PCR blev udført på en Mastercycler Gradient (Eppendorf, Tyskland) under anvendelse af 25 ul reaktionsvolumener indeholdende 12,5 ul KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 µl fremadgående primer (5 µM), 1 µl omvendt primer (5 µM), 5 µl DNA (samlet skabelonmængde er 30 ng) og 5,5 µl H2O. Cykelparametrene er som følger: 95 grader i 5 minutter, efterfulgt af 28 cyklusser af 95 grader i 45 s, 55 grader i 50 s og 72 grader i 45 s, med en afsluttende forlængelse ved 72 grader i 10 min. Tre PCR-produkter pr. prøve blev samlet for at afbøde PCR-biaser på reaktionsniveau. PCR-produkterne blev renset ved hjælp af et QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Tyskland) og derefter kvantificeret ved anvendelse af real-time PCR14.

Dyb sekventering blev udført på en MISeq platform hos Allwegene Company (Beijing). Efter kørslen blev billedanalyse, basiskald og fejlestimering udført ved hjælp af Illumina Analysis Pipeline Version 2.614.

Cistanchetubulosa kan anti-aging

Dataanalyse.De rå data blev først screenet, og sekvenser blev fjernet ud fra følgende overvejelser: sekvenser kortere end 200 bp med lav kvalitetsscore (mindre end eller lig med 20) og indeholdt tvetydige baser eller matchede ikke primersekvenserne og stregkodemærkerne15. Kvalificerede læsninger blev adskilt ved hjælp af de prøvespecifikke stregkodesekvenser og trimmet med Illumina Analysis Pipeline Version 2.6. Derefter blev datasættene analyseret ved hjælp af QIIME. Sekvenserne blev grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) på et lighedsniveau på 97 procent 16 for at generere sjældne kurver og beregne rigdoms- og diversitetsindekserne. Ribosomal Database Project Classifer-værktøjet blev brugt til at klassificere alle sekvenser i forskellige taksonomiske grupper15. Klyngeanalyser blev udført baseret på OTU-oplysningerne fra hver prøve ved at bruge R til at undersøge ligheden mellem forskellige prøver17. UniFracdistances-matricen mellem mikrobielle samfund fra hver prøve blev beregnet ved hjælp af Tayc-koefficienten og repræsenteret som en uvægtet pargruppemetode med aritmetisk middel-klyngetræ, som beskriver uligheden (1-ligheden) mellem de multiple prøver18. En Newick-formateret træflet blev også genereret gennem denne analyse. Alfa-diversitet blev anvendt i analysen af ​​kompleksiteten af ​​artsdiversitet for en prøve ved hjælp af fire indekser, herunder Chao1, observerede arter, fylogenetisk diversitet (PD) heltræ og Shannon-diversitetsindeks. Disse indekser blev beregnet ved hjælp af QIIME-softwaren (Boulder, CO, USA) i Python (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. Beta-diversitetsanalyse blev brugt til at evaluere forskelle mellem prøver med hensyn til artskompleksitet. Beta-diversitet blev beregnet ved hjælp af den primære koordinatanalyse (PCoA) og klyngeanalyse i QIIME20. Analysen af ​​molekylær varians (AMOVA) blev udført under anvendelse af mothur. EdgeR blev brugt til at beregne OTU-forskellen mellem grupper. Heatmap.2 blev brugt til at tegne varmekortet, mens Ggplot blev brugt til at tegne Manhattan-kortet.

Bestemmelse af biomarkør og kernemikrobiom.Metoderne for lineær diskriminantanalyse (LDA) og tilfældig skov (RF) på Microbiome Analysts hjemmeside21 blev brugt til at bestemme biomarkørmikrobiomet.

Hjemmesiden udfører først ikke-parametrisk faktoriel Kruskal-Wallis sum-rang test for at identificere funktioner med signifikant differentiel overflod i betragtning af den eksperimentelle faktor eller klasse af interesse, efterfulgt af LDA for at beregne effektstørrelsen af ​​hver differentielt rigelige funktioner21. Funktionerne anses for at være signifikante baseret på deres justerede p-værdi. Standardadj.p-værdien cutof=0.05. RF-analyse udføres ved hjælp af randomForest-pakken5. RF er en overvåget læringsalgoritme, der er velegnet til højdimensionel dataanalyse. Denne metode anvender et ensemble af klassifikationstræer, som hver især dyrkes via tilfældigt udvalg af funktioner fra en bootstrap-prøve ved hver gren22. Kernemikrobiomanalyse blev overtaget fra kernefunktionen i R-pakkens mikrobiom af Microbiome Analyst

korrelationsanalyse af nøglemikrobielle samfund, phG-indhold og økologiske faktorer.Indholdet af syv phenylethanoidglycosider (PhG'er) af de tre økotyper af C. deserticola, nemlig echinacosid, cistanosid A, acteosid, isoacteosid, 2'-acetylacteosid, tubulosid A og cistanoside F, blev bestemt gennem HPLC. De kromatografiske forhold involverer en Waters C18-søjle (150 mm × 3,9 mm, 4,6 μm), og den mobile fase omfatter acetonitril og 0,2 procent myresyre. De kromatografiske indstillinger var som følger: 0-10 min, 10 procent →15 procent A; 10–30 minutter, 15 procent →40 procent A. Strømningshastigheden var 1 ml/min. Absorptionsbølgelængden, injektionsvolumen og kolonnetemperaturen var henholdsvis 330 nm, 10 μL og 27 grader. Metodeundersøgelsen refererer til referencegruppens foreløbige forsøgsarbejde1.

Denne undersøgelse indsamlede 16 meteorologiske stationer nær de tre økologiske typer afC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Indre Mongoliet Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 og Wuhai 53512. Data for syv klimatiske faktorer tjente som-fra 20198 korrelationsfaktorer til 20198-korrelationsfaktorer.

Redundancy analysis of diferential metabolites and bioclimatic factors was performed by using Canoco 5 software23. Pearson correlation coefcient was calculated for biomarker microbiome abundance, compound con- tent and ecological factor data integration. In this study, the log2 data conversion was uniformly performed before the analysis. SPSS was used to calculate the Pearson correlation coefcient of the six biomarkers, six core micro- biomes, seven main active components of C. deserticola and the ecological factors in the three habitats, and the screening standard was as follows: pearson correlation coefcient (r) >{{0}}.5 og p-værdi < 0.05.="" forholdet="" mellem="" ovenstående="" faktorer="" blev="" visualiseret="" ved="" hjælp="" af="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" version="" 3.7.0)="" og="" pheatmap="">

Forudsigelse af de mikrobielle funktionelle profiler af mikrobiomet.Tax4Fun25 (R-pakke, http://tax4fun.gobics.de/) blev brugt til at forudsige de mikrobielle funktionelle profiler af mikrobiomer i jordprøverne. OTU Biom-tabellen over jordmikrobiom blev brugt som input til metagenomimputering af C. deserticola-jordprøver. Derefter blev de forudsagte genklasseforekomster analyseret på KEGG Orthology (KO) gruppeniveau 3. Resultaterne fra Tax4Fun blev analyseret i doBy (R-pakke)26.

Resultater

Mikrobiel samfundssammensætning. The 16S rRNA sequencing resulted in 834,323 raw reads, amongst which 522,929 passed the quality and length fltering. The data set comprised 20,511–48,337 (mean: 33,994) sequences per sample. The high-quality reads were clustered using >97 procent sekvensidentitet i 3541 mikrobielle OTU'er (tabel 1).

Det mikrobielle samfund blev generelt klassificeret i 19 phyla, 46 klasser og 87 ordener (fig. 2a, b og S1-S3). På phylum-niveau var Actinobacteria (35 procent), Proteobacteria (31 procent) og Firmicutes (15 procent) dominerende i saltvand-alkali-land. Græsarealet var domineret af Actinobacteria (37 procent), Proteobacteria (29 procent) og Bacteroidetes (9 procent). I sandet land var Actinobacteria (42 procent), Proteobacteria (33 procent) og Firmicutes (6 procent) dominerende. På klasseniveau var Actinobacteria (25 procent), Gammaproteobacteria (21 procent) og Bacilli (15 procent) dominerende i saltvand-alkali-land, mens Actinobacteria (22 procent), Alphaproteobacteria (16 procent) og Bacilli (8 procent) var dominerende i græsarealer. I sandet land dominerede Actinobacteria (23 procent), Alphaproteobacteria (20 procent) og Gammaproteobacteria (9 procent). På ordreniveauet (fig. 2c-e) var Micrococcales (22 procent), Oceanospirillales (15 procent) og Bacillales (15 procent) dominerende i saltvand-alkali-land. Micrococcales (11 procent) og Bacillales (8 procent) dominerede i græsarealer. De mest dominerende bakterieordener var således Micrococcales (10 procent) og Acidimicrobiales (7 procent).

Mangfoldighed af jordbakterier i de tre økotyper af C. deserticola.Målene for diversitet inden for prøven (-diversitet) afslørede en diversitetsgradient blandt de tre habitater (fig. 2f og tabel S1). Alfa-diversiteten af ​​det bakterielle mikrobielle samfund i jorden i hver prøve blev estimeret ved hjælp af samfundsrigdommen (Chao 1, som blev udtrykt som det forventede samlede antal OTU i hver prøve), observerede arter, PD-heltræ og Shannon-diversitetsindeks. De observerede arter, Chao 1 og PD heltræsindeks antydede, at græsarealer havde den højeste diversitet, mens -diversiteten af ​​salt-alkali- og sandjorde er ens. Resultaterne af therarefaktionskurver (fig. S1) svarer til ovenstående resultater.

Acteosidicistanchehave gode effekter pånyre

AMOVA-resultaterne (tabel S2) viste, at p < 0.001,="" hvilket="" indikerer="" en="" signifikant="" forskel="" mellem="" de="" tre="" habitater.="" resultaterne="" af="" klyngetræer="" med="" bray="" distance="" diversity="" (fig.="" s2)="" af="" de="" tre="" habitatjordprøver="" viste,="" at="" salt-alkali-jordprøverne="" var="" tæt="" klyngede,="" og="" afstanden="" mellem="" græsarealet="" og="" sandjordsprøverne="" var="" tæt.="" resultaterne="" af="" de="" ubegrænsede="" pcoas="" af="" uvægtede="" unifrac="" afstand="" 2d="" plots="" (fig.="" 2g)="" viste,="" at="" de="" forskellige="" jordprøver="" af="" bakterielle="" mikrobielle="" samfund="" fra="" forskellige="" habitater="" var="" godt="">

sammenligning af jordbakteriesamfund af de tre økotyper af ca. deserticola.Forskellige OTU-overflodsvarmekort og vulkankort (fig. 3b, e, d, h og tabel S3) indikerede, at sammenlignet med sandede jordprøver blev henholdsvis 24 og 17 OTU'er beriget og udtømt i saltvand-alkali-land på ordensniveau. Sammenlignet med prøver af sandet land blev 8 og 11 OTU'er desuden beriget og udtømt i græsarealet. Venn-diagrammet (fig. 3c,f) illustrerede, at 216 OTU'er var udtømt i sandet land, 8 var udtømt i saltvand-alkali

land og 1 OTU overlappede mellem saltvand-alkali og sandet land. Ydermere blev 3 OTU'er beriget med græsarealer, mens 161 blev beriget med sandet land, herunder 6 OTU'er, der overlappede mellem græsarealer og sandede arealer. Manhattan-grundene (fig. 3a) viste, at Xanthomonadales var mere beriget og udtømt i saltvand-alkali-land end dem i sandet land, mens Xanthomonadaceae-bakterien WWH73, WD2101 jordgruppe, Vibrionales og Verrucomicrobiales var betydeligt udtømt på ordensniveau. Ved at sammenligne græsarealer med sandet land var Xanthomonadales, WD2101 jordgruppe, Vibrionales og Verrucomicrobiales betydeligt udtømte.

Cistanchedeserticola har mange virkninger på behandlingdiabetes

Bestemmelse af biomarkør og kernemikrobiom i de tre økotyper af C. deserticola.LEfSe- og RF-metoderne (fig. 4a,b,d) blev brugt til at identificere træk med signifikant differentiel overflod på tværs af jordprøverne, beregne effektstørrelsen af ​​hver differentielt rigelige træk og bestemme biomarkørbakteriemikrobiom i de tre habitater på rækkefølgeniveau . Resultaterne præsenteret i tabel S4 afslørede, at LDA-scoren for Oceanospirillales, Bacillales og Flavobacteriales var den højeste blandt dem i saltvand-alkali-landet, mens den for Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacterales, Burkholderiales og Sphingobacteriales var den højeste blandt dem i græsarealer. LDA-scoren for Propionibacteriales, Rhodospirillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales og Pseudonocardiales var dominerende i sandet land. Med udelukkelse af udefinerede og duplikerede ordrer blev disse OTU'er klassificeret i seks ordrer, og deres overflod blev tegnet i et varmekort (fig. 4c).

Persistensmetoden blev overtaget fra kernefunktionen i R-pakkens mikrobiom for at identificere kernemikrobiomet i de tre økotyper af C. deserticola. Dette kernebakteriemikrobiom indeholdt seks ordener, herunder Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales og Sphingomonadales. Med udelukkelse af uafgrænsede og duplikerede ordrer blev disse OTU'er klassificeret i seks ordrer, og deres overflod blev tegnet i et varmekort (fig. 2h).

Persistensmetoden blev overtaget fra kernefunktionen i R-pakkens mikrobiom for at identificere kernemikrobiomet i de tre økotyper af C. deserticola. Dette kernebakteriemikrobiom indeholdt seks ordener, herunder Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales og Sphingomonadales. Med udelukkelse af uafgrænsede og duplikerede ordrer blev disse OTU'er klassificeret i seks ordrer, og deres overflod blev tegnet i et varmekort (fig. 2h).