Del 1 | Herba Cistanche-ekstrakt forbedrer mitokondriel ATP-generation i rottehjerter og H9c2-celler

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung og Kam Ming Ko

Institut for Biokemi, Hong Kong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, Kina

Nøgleord: ATP,Cistanche deserticola, H9c2-celler, hjerte, mitokondrier

Abstrakt

At undersøge det farmakologiske grundlag for "Yang- forfriskende" virkning af Herbal Cistanche [den tørrede hele plante afCistanche deserticolaY.C. Ma (Orobanchaceae)], i kinesisk medicin, blev virkningerne af methanolekstraktet af Herba Cistanche på mitokondriel ATP-genereringskapacitet undersøgt ved hjælp af en ex vivo rottehjertemodel og et in situ H9c2-celleassay. Behandling med Herba Cistanche-ekstrakt øgede myokardiemitokondrie-ATP-genereringskapaciteten på en dosisafhængig måde hos rotter, som vurderet ved in vitro-måling. Stimuleringen af ATP-produktionskapaciteten var forbundet med en parallel forbedring i mitokondriel elektrontransport understøttet af pyruvat, men ikke succinat. Herba Cistanche-behandlingen øgede også myokardiemitokondriekomplekset I og komplekse III-aktiviteter, hvor omfanget af stimulering på kompleks I-aktivitet var større. Herba Cistanche-behandling producerede en dosis- og tidsafhængig stigning i mitokondriel ATP-genereringskapacitet i H9c2-celler. Resultaterne tyder på, at Herba Cistanche behandling kanøge mitokondriel ATP-genereringi rottehjerter ex vivo og H9c2 celler in situ, muligvis gennemforbedring af oxidativ fosforylering.

Cistanche kan forbedre hjertefunktionen, sænke blodtrykket og sænke blodlipiderne

Indførelsen

"Yang invigoration", som legemliggør den generaliserede forbedring af kropsfunktionen i kinesisk medicin, involverer brugen af energi til at drive forskellige biokemiske processer.

I denne henseende genereres ATP, som er den universelle valuta for energi i brændstof til cellulær funktion, hovedsageligt gennem oxidativ phosphorylering i mitokondrier. Vi har postuleret, at "Yang forfriskende" urterbesidder evnen til at øge mitokondriel ATP-produktionskapacitet(Ko et al., 2004). Dette understøttes af vores nylige konstatering af, at "Yang-forfriskende", men ikke "Yin-nærende" kinesiske tonificerende urter kunne forbedre den myokardielle ATP-generationskapacitet i musehjerter ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, den tørrede hele parasitære plante (undtagen blomsten) af Cistanche deserticola Y.C. Ma (Orobanchaceae), er klassificeret som en'Yang-forfriskende 'tonificerende urt i traditionel kinesisk medicin (Chen, 1998), og det fremstår som den mest populære ingrediens i en række kinesiske patenter for- mulationer, der anvendes til Yang-invigoration'. I Kina og Japan anvendes Herba Cistanche i vid udstrækning til behandling af en lang række Yang-mangelsymptomer. Farmakologiske undersøgelser viste, at Herba Cistanche kunnescavenge frie radikaler(Xiong et al., 1996),producere beroligende(Lu, 1998),antiaging(Lee et al., 1990),antinociceptive og antiinflammatoriske virkninger(Lin et al., 2002), ogforbedre immunforsvaret(Wu et al., 2005). Den vigtigste aktive ingrediens i Herba Cistanche erphenylethanoid glycosider(Ouyang et al., 2003), som har vist sig at haveantibakteriel, antistress og antioxidativegenskaber (Xiong et al., 1998) samt anti-apoptotiske virkninger på dyrkede neuroner (Tian & Pu, 2005). I den aktuelle undersøgelse blev virkningerne af Herba Cistanche-behandling på ATP-generationskapaciteten i mitokondrier isoleret fra rottehjerter ex vivo og dyrkede H9c2-kardiomyocytter in situ undersøgt for at undersøge det farmakologiske grundlag for Herba Cistanches Yang-forfriskende virkning. For at undersøge den biokemiske mekanisme, der ligger til grund for ATP-generationens forstærkende virkning, blev virkningerne af Herba Cistanche-behandling på mitokondriel elektrontransport og komplekse I-IV-aktiviteter også undersøgt i rottehjerter.

De effektive ingredienser i Cistanche kan rense forskellige aktive iltfrie radikaler

Materialer og metoder

Kemikalier, cellekultur og urtematerialer

ATP, ADP og 3-[4,5-dimethylthiozol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) blev købt hos Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Luciferase-opløsning (ATPlite) blev opnået fra PerkinElmer (Boston, MA, USA). Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) og føtalt kvægserum (FBS) blev købt hos GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). H9c2 cellelinje blev købt fra ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche blev leveret af en lokal urtehandler (Lee Hoong Kee). Urten blev godkendt af leverandøren, og en kuponprøve (HKUSTY00301) blev deponeret i Institut for Biokemi, Hong Kong University of Science & Technology (HKUST).

Urteekstraktion

Herba Cistanche (100 g) blev skåret i små stykker og derefter ekstraheret ved opvarmning under tilbagesvaling i 300 ml methanol ved 65◦C i 2 timer. Proceduren blev gentaget to gange. Det samlede ekstrakt blev tørret ved at fordampe opløsningsmidlet under reduceret tryk, og methanolekstraktet af Herba Cistanche blev opnået med et udbytte på 39% (w/w). Kemisk analyse viste, at methanoleks- kanalen af Herba Cistanche indeholdt totale saponiner, totale flavonoider, totale lignaner og polysaccharider i koncentrationer på henholdsvis 1,62% (w/w), 0,08%, 0,15% og 75,6%.

Dyrepleje

Voksne han-Sprague-Dawley-rotter (8-10 uger; 250-300 g) blev opretholdt under en 12-timers mørk / lyscyklus i et luft- / fugtighedskontrolleret rum ved ca. 22 ◦ C og tillod mad og vand ad libitum i dyreplejefaciliteterne på HKUST. Eksperimentelle protokoller blev godkendt af Forskningspraksisudvalget ved HKUST.

Lægemiddelbehandling

Dyrene blev tilfældigt opdelt i grupper med fem til seks dyr i hver. I behandlingsgrupperne blev rotter intragastrisk administreret med methanolekstraktet af Herba Cistanche (opløst/suspenderet i vand) ved stigende daglige doser (0,031-0,5 g/kg) i 3 dage. Kontroldyr modtog kun vand. Fireogtyve timer efter den sidste dosering blev hjertet opnået fra phenobarbital-anæstetiserede dyr og underkastet biokemisk analyse.

Fremstilling af mitokondrielle fraktioner og måling af ATP-produktionskapacitet (ATP-GC) ex vivo

Hjerte venstre ventrikulære vævsprøver blev udskåret og skyllet med iskold isotonisk buffer (0,32 M saccharose, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/ HCl, pH 7,4). Hjertemitokondrielle fraktioner blev fremstillet ved differentiel centrifugering i isotonisk buffer ved 4◦C. Et 10% (w/ v) hjertehomogenat blev fremstillet ved homogenisering af det hakkede ventrikulære væv med en teflonglashomogenisator ved 4000 o / min i 20-30 komplette slag. Homogenatet blev centrifugeret ved 600 × g i 10 minutter for at fjerne kerner og celleaffald. Supernatanten blev derefter centrifugeret ved 8000 × g i 30 minutter for at sedimentere mitokondrierne (Evan, 1992). Pellets blev resuspended i 1 ml af den isotoniske buffer og rekonstituerede mitokondriefraktionerne. Den mitokondrielle ATP-GC af ubehandlede dyr blev målt ved metoden Leung et al. (2005)

Cistanche polysaccharider kan forsinke den fysiologiske degeneration af organer og degenerering af cellemorfologi

Måling af mitokondriel elektrontransport

Måling af elektrontransport i isolerede mitokondrier, som er baseret på reduktionen af MTT, som pr[1] dannet som beskrevet af Cohen et al. (1997). Mitokondrier blev fremstillet ved en proteinkoncentration på 1 mg/ml med en inkubationsbuffer (250 mM saccharose, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4). Et aliquot (40 μL) af mitokondrierne blev blandet med 100 μL hver af 15 mM pyruvat eller 0,5 mM succinat og 0,42 mg/ml MTT. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37◦C i 10 minutter med blid omrystning. Efter inkubationen blev reaktionsblandingen afsluttet ved tilsætning af 100 μL lysisbuffer (10%, w/v, natriumdodecylsulfat og 45% dimethylformamid, justeret til pH 4,7 med iseddikesyre). Efter at have stået i 5 minutter blev absorbansaflæsninger af reaktionsblandingen taget med en mikrotiterpladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og rapporteret som forskellen mellem 570 nm og 630 nm. Data blev udtrykt som en procentdel af gennemsnitsværdien af kontrolgruppen (dvs. Herba Cistanche-ubehandlet).

Cellekultur

H9c2-celler, en permanent cellelinje afledt af hjerte-myoblaster (Hescheler et al., 1991), blev dyrket som monolag i DMEM suppleret med 10% (v / v) FBS. Mediet indeholdt glucose (4,5 g/l) og glutamin (4,5 mM) suppleret med NaHCO3 (17 mM), penicillin (100 IE/ml) og streptomycin (100 μg/ml). Alle celler blev dyrket under en atmosfære på 5% (v/v) CO2 i luft ved 37◦C. Mediet blev erstattet af frisk medium hver 2. eller 3. dag. En bestand af celler blev dyrket i en 75 cm2 dyrkningskolbe og splittet før sammenløbet i et subkultivationsforhold på 1:10. Til ATP-GC-assay blev H9c2-celler podet med en densitet på 2,5 × 104 celler / brønd i en 24-brønds plade. Efter cellefastgørelsen, Herba Cistanche-ekstrakt (opløst i fosfatbufret saltvand; PBS) blev påført i mediet, og cellerne blev inkuberet i stigende perioder (2-16 timer) af tiden. Kontrolceller (ubehandlede) fik kun PBS.

Måling af ATP-GC in situ

Efter de angivne inkubationsperioder med Herba Cistanche ekstrakt i stigende koncentrationer (50-300 μg/ml), blev ATP-GC-analysen udført. Mediet blev opsuget, og celler blev behandlet med digitonin (50 μg/ml) i en inkubationsbuffer (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5% BSA, pH 7,4) i 3 minutter ved 37◦C. Efter at have aspireret digitonin, glutamat (5 mM), malat (5 mM) og ADP (60 μM) blev tilsat cellerne til mitokondriel ATP-generering, som blev overvåget med stigende tidsintervaller spænder fra 0 til 15 minutter. Reaktionen blev afsluttet med tilsætning af 60 μL perchlorsyre (30 %, w/v), og reaktionsblandingerne blev derefter centrifugeret ved 600 × g i 10 minutter ved 4◦C. En alikvote (120 μL) af supernatanten blev blandet med 90 μL 1,4 M KHCO3 til neutralisering. Blandingerne blev centrifugeret igen ved 600 × g ved 4◦C, og supernatanterne blev målt for ATP-indhold som beskrevet tidligere. ATP-GC for de ubehandlede celler blev estimeret ved at beregne arealet under grafens kurve (AUC1) afbildning af ATP genereret (nmol/mg protein) mod tid (0-15 min) og udtrykt i vilkårlige enheder. Til Herba Cistanche-behandlede celler, AUC1-værdier for stigende inkubationstider (3, 5, 7, 10 og 15 min) blev normaliseret til en respektive gennemsnitlig kontrolværdi fra ubehandlede prøver og udtrykt som procentvis kontrol. Derefter området under kurve (AUC2) for grafen, der viser procentvise kontrolværdier mod inkubationstid (3-15 min) blev beregnet og udtrykt i vilkårlige enheder. Data fra Herba Cistanche-behandlet grupper blev udtrykt som en procentdel af kontrollen fra ligningen:

[AUC2(HerbaCistanche − behandlet)/AUC2(ubehandlet)] ×100%

Målinger af kompleks I-IV og citratsyntase Aktiviteter

Mitokondriel elektrontransportkæde (ETC) kompleks I- III-aktiviteter blev målt ved hjælp af spektrofotometriske metoder ved anvendelse af komplekse specifikke substrater (NADH for komplekse I, succinat til kompleks II og decylubiquinol til kompleks III) som beskrevet (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al., 2005; Mark et al., 2001). Kompleks IV-aktivitet blev målt ved hjælp af et cytokrom c oxidase assay kit fra Sigma. Mitokondriecitratsyntaseaktivitet blev målt ved metoden af Srere (1969).

Proteinanalyse

Proteinkoncentrationer af mitokondrielle fraktioner og celler lysater blev bestemt ved hjælp af et BioRad-proteinassay kit med bovin serumalbumin som standard (0,038–0,600 mg/ml).

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som gennemsnitlige ± standardfejl i middelværdi (SEM). De blev analyseret ved envejsanalyse af varians (ANOVA). Post hoc flere sammenligninger var udført med LSD. P-værdier<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Resultater

Virkninger af Herba Cistanche behandling på myokardie mitokondriel ATP-GC hos rotter

Som vist i figur 1 øgede behandling med Herba Cistanche-ekstrakt i doser på op til 0,5 g/kg myokardiemitokondriel ATP-GC på en dosisafhængig måde hos rotter, med Stimuleringsgraden er 89 % i en dosis på 0,5 g/kg.

Virkninger af Herba Cistanche behandling på mitokondriel elektrontransport i rottehjerter

Omfanget af elektrontransport i isolerede mitokondrier blev målt ved at overvåge reduktionen af MTT. Den substratet, der blev anvendt til analysen, var enten pyruvat eller succinat.

Figur 1.Effekten af Herba Cistanche-behandling på mitokondriel ATP-genereringskapacitet i rottehjerter ex vivo

Hver bjælke repræsenterer gennemsnit ± SEM, med n = 5. Dyr blev oralt behandlet med Herba Cistanche ved de angivne daglige doser i 3 dage. ATP-produktionskapaciteten blev målt som beskrevet i "Materialer og metoder". Data blev udtrykt i procentvis kontrol med hensyn til værdier (AUC2) af den respektive ubehandlede kontrolgruppe. ∗Væsentligt anderledes fra den respektive ubehandlede kontrolgruppe væsentligt anderledes fra den Herba Cistanche-behandlede gruppe ved 0,5 g/kg.

Figur 2. Virkninger af Herba Cistanche-behandling på mitokondriel elektrontransport i rottehjerter

Hver bjælke repræsenterer middelværdien ± SEM, med n = 5. a) Pyruvatunderstøttet (b) succinatstøttet mitokondriel elektrontransport blev målt ved MTT-reduktion som beskrevet i "Materialer og metoder". Data blev udtrykt i procentdelen af ubehandlede kontrolværdier [pyruvatunderstøttet: OD570nm− OD630nm = 0,0206 ± 0,0001 (SEM), n = 5; succinatstøttet: mand, 0,255 ± 0,015, n = 5]. ∗Væsentlig forskellig fra de respektive ubehandlede kontrolgruppe; en signifikant forskellig fra 0,5 g/kg-gruppen.

Som vist i figur 2a øgede Herba Cistanche-behandlingen dosisafhængigt omfanget af mitokondriellelektron transport understøttet af pyruvat i rottehjerter, med den optimale stimulering, der kan observeres ved doser på 0,5 g/kg. Der er dog ingen væsentlige ændringer i omfanget af mitokondrie elektrontransport understøttet af succinat blev påvist i Herba Cistanche-behandlede rottehjerter (fig. 2b).

For del 2,klik her.