Del 1: Echinacoside beskytter mod MPP plus -induceret neuronal apoptose via ROS/ATF3/CHOP Pathway Regulation

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Venligst klik her til del 2

arter (ROS) bidrager også til dens udvikling [3]. Karakteristika, der ligner PD, kan induceres af adskillige miljøgifte, herunder 1-methyl-4-phenyl- 1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), cyanid, carbondisulfid, og toluen. MPTP er meget brugt til at inducere dyremodeller af PD, og dets aktive metabolit, 1-methyl-4- phenylpyridinium ion (MPP?), bruges i cellemodeller af PD [4, 5]. MPP? hæmmer selektivt elektrontransportkæden og resulterer i overdreven ROS-produktion, hvilket inducerer neuronal død og et syndrom, der ligner PD [6]. Nylige undersøgelser har vist, at MPP? inducerer flere veje i en in vitro PD-model, herunder øget GSK3B-phosphorylering (pY206) og a-synuclein-akkumulering [5], opregulering af hæm-oxygenase-1/nikotinamidadenindinukleotidphosphatoxidase/ROS-aksen [7, 8], øget ekspression af aktiv transkriptionsfaktor 3 (ATF3) og vækststop via DNA-skade-inducerbart 153 (GADD153)/C/EBP-homologt protein (CHOP) [9]. I klinisk behandling er suppression af ROS-produkter en af de vigtigste strategier for overlevelse af neuroner og behandling af PD [1].

Echinacoside(ECH, Fig. 1A), en naturligphenylethanoidfindes i mange lægeplanter, er en hovedbestanddel afphenylethanoidglykosiderisoleret fra den traditionelle kinesiske urt,Cistanchesalsa [10]. Interessant nok har nyere undersøgelser vist detECHhar beskyttende virkninger i en musemodel af PD induceret af MPTP [10, 11].ECHdæmper også neuroblastomcelleapoptose induceret af tumornekrosefaktor-a eller 6-hydroxydopamin in vitro [12, 13]. Men de mekanismer, hvorvedECHfremmer overlevelsen af neuroner i den MPPa-inducerede PD-cellemodel forbliver uklar.

Det viste viECHmarkant reduceret ROS-produkter induceret af MPP? i SH-SY5Y-celler.ECHhæmmede også den MPP?-inducerede ekspression af ATF3, CHOP og a-synuclein, samt undertrykkede aktivering af pro-apoptoseproteinerne caspase-3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).

Cistancheechinacosideharneurobeskyttendeeffekter

Materialer og metoder

Reagenser

Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM), føtalt bovint serum, 0.25 procent trypsin, 1 procent penicillin/streptomycin og TRIzol-reagens var fra Life Technologies (Grand Island, NY). Kromatinfarvestoffet bisbenzimid (Hoechst 33342), poly-L-lysin, MPP? iodid og MPTP var fra Sigma (St. Louis, MO). Lipidperoxidationsmalondialdehyd (MDA) assaysættet og dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) var fra Beyotime Biotech (Haimen, Kina). ECH af C98 procent renhed var fra Push Biotechnology (Chengdu, Kina).

Dyr og behandlinger

Dyrevedligeholdelse og behandlinger var som beskrevet tidligere [14]. Vi brugte C57BL/6 hanmus (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, Kina) med en vægt på 24-26 g ved 10 ugers alderen. Dyrene blev holdt under standardbetingelser (12:12 timer lys: mørke cyklus, 21 ± 2C og relativ fugtighed 40 procent) og fik adgang til mad og vand ad libitum. Alle procedurer blev godkendt af den dyreetiske komité på Zhongshan Hospital, Fudan University, og udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for Care and Use of

Forsøgsdyr.

Mus blev tilfældigt opdelt i fire grupper (10 mus/gruppe): gruppe A, vehikelkontrolgruppe, givet et lige så stort volumen (500 µl) normalt saltvand (NS); gruppe B, ECH kontrolgruppe, givet 20 mg/kg ECH; gruppe C, MPTP-modelgruppe, forbehandlet med et tilsvarende volumen NS; og gruppe D, ECH-behandlet gruppe, forbehandlet med 20 mg/kgECH. ECHblev opløst i NS og leveret ved intragastrisk administration hver 24. time i 15 på hinanden følgende dage. Muse-PD-modellen for gruppe C og D blev genereret af fem på hinanden følgende intraperitoneale injektioner af 30 mg/kg MPTP hver 24. time fra dag 11 til dag 15. Mus blev dræbt ved cervikal dislokation eller perfusion, der blev bedøvet med 10 procent chloralhydrat (3,6 mg/ kg) intraperitonealt 24 timer efter den afsluttende behandling.

Perfusion og vævsbehandling var som beskrevet tidligere [14]. Efter intrakardial perfusion blev hjerneprøver opsamlet og fikseret i 4 procent paraformaldehyd i 24 timer ved 4C, indlejret i paraffin og koronale sektioner omfattende hele SNc (stereotaksiske koordinater anteroposterior -3.64 til -2. mm i forhold til bregma) blev skåret ved 5 lm.

Yderligere 5 dyr fra hver gruppe blev dræbt ved cervikal dislokation, og den ventrale mellemhjerne blev hurtigt lyseret i 1 procent SDS-lysebuffer på is. CHOP- og ATF3-proteinniveauer i lysatet blev analyseret ved western blotting.

kidney injury and disease

Cistancheechinacosidehar den effekt, at den styrkernyre

Culture of Rat Ventral Midbrain (VM)

Dopaminerge neuroner

Drægtige Wistar-rotter blev købt fra Shanghai Laboratory Animal Co., (Shanghai, Kina). DA-neuroner i VM'et blev isoleret på embryonal dag 14. VM'et blev dissekeret og behandlet til etablering af primære VM DA-neuronkulturer som tidligere beskrevet [15, 16]. Kort fortalt blev vævsstykker opsamlet i iskold Hanks' balancerede saltopløsning (HBSS) og centrifugeret ved 1000 rpm ved 4C i 5 min. Vævspellet blev inkuberet i 750 l 0,1 procent trypsin-HBSS i 15 minutter ved 37 C med 5 procent CO2. Fosterkalveserum (FCS; 750 l) blev brugt til at inaktivere trypsin, og væv blev dissocieret ved forsigtig triturering

ved hjælp af en steriliseret Pasteurpipette. Cellesuspensioner blev centrifugeret ved 1000 rpm i 4 minutter ved 4C og resuspenderet i differentieringsmedium (Dulbeccos modificerede Eagle's medium/F12, 33 mmol/L D-glucose, 1 procent L-glutamin og 1 procent FCS, suppleret med 2 procent B27). Celler blev podet på poly-D-lysin (Sigma)-coatede 24-brøndvævskulturplader ved 5 9 104 celler/brønd i 500 l differentieringsmedium ved 37°C med 5 procent CO2 i 10 dage for at udvikle sig til

modne DA neuroner. VM DA neuroner blev karakteriseret ved immunoﬂuorescens med anti-b-tubulin isotype III antistof og tyrosin hydroxylase (TH) antistof (fig. S1). Celler blev behandlet med 1 mmol/L MPPa, 40 LG/ml ECH, en kombination af MPPa og ECH eller PBS alene som kontrol. Cellelevedygtighed blev analyseret med CCK-8-reagens efter 96 timers behandling.

og præsenteres som middelværdi ± SD (n {{0}}; **P \0.01 vs kontrol, #P \ 0,05, ##P \0,01 vs MPP ? behandling). C Lysmikroskopiske billeder af morfologiske ændringer induceret af MPP? eller MPP? og ECH. a, PBS kontrol; b, 40 lg/ml ECH; c, 1 mmol/L MPPa; d, 1 mmol/L MPP? og 10 lg/ml ECH; e, 1 mmol/L MPP? og 20 lg/ml ECH; f, 1 mmol/L MPP? og 40 lg/mL ECH (skalastang, 200 lm).

11-

Cistanche echinacoside har den virkning at hæmme apoptose

SH-SY5Y cellekultur

SH-SY5Y-celler var fra Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) og dyrket i DMEM suppleret med 10 procent føtalt bovint serum, 100 U/mL penicillin og 100 U/mL streptomyciner. Celler blev holdt i en fugtig 37C inkubator forsynet med 5 procent CO2. MPP? blev opløst i sterilt vand og brugt med det samme. ECH blev opløst i PBS. For at udforske ROS-relateret genekspression og proteinniveauer blev celler podet i 6-brøndsplader og dyrket i 24 timer. Cellerne blev derefter fodret med frisk medium indeholdende MPPa, ECH, en kombination af MPPa og ECH eller PBS alene som kontrol. Efter 24 timers behandling blev cellerne lyseret med 1 procent SDS-lysebuffer (1 procent SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6,5) til western blot-analyse, og totalt RNA blev isoleret direkte med TRIzol reagens.

For at analysere ATF3- og CHOP-fordelingen efter behandling blev nuklear og cytoplasmatisk ekstraktionsreagenssæt (Thermo Fisher, Waltham, MA) brugt til at ekstrahere cytoplasmatiske og nukleare fraktioner fra lægemiddelbehandlede celler og kontrolceller.

Cellelevedygtighedsanalyse

SH-SY5Y-celler blev podet i 96-brøndsplader og inkuberet natten over. Cellerne blev fodret hver 24. time med et frisk komplet medium indeholdende forskellige lægemidler og holdt i 3 dage. Derefter blev levedygtigheden vurderet under anvendelse af CCK8-celletællersættet (Dojindo, Japan). Data blev normaliseret til resultater fra PBS-kontrollen og præsenteres som gennemsnit ± SD. For at analysere levedygtighed i ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) og kontrol (GFP shRNA) celler blev cellerne tilføjet til 96-brøndsplader og dyrket i 14-16 timer. ATF3 shRNA eller GFP shRNA plasmider blev transficeret ind i SH-SY5Y celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Cellerne blev behandlet med 1 mmol/L MPP? eller et tilsvarende volumen PBS efter 24 timers transfektion og blev derefter inkuberet i 3 dage. Celletal blev talt hver dag. Data præsenteres som middelværdi ± SD.

shRNA-konstruktioner og oligoprimere

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) og GFP kontrol shRNA konstruktioner var fra GeneChem Co. (Shanghai, Kina). ATF3-målsekvensen var 50-GCAAAGT G!CCGAAAACAAGA-30 fra tidligere beskrevne metoder [17, 18]. For at detektere genekspression induceret af MPP? blev ROS stress-relaterede og PD-associerede gener udvalgt til qRT-PCR, og GAPDH blev brugt som kontrol. Alle primere blev syntetiseret af Sangon Biotech Co. (Shanghai, Kina), og primersekvenserne er anført i tabel 1.

Realtids PCR

Total RNA blev ekstraheret med TRIzol-reagens i henhold til producentens instruktioner. Omvendt transkription og kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) blev udført som tidligere beskrevet. Den omvendte transkriptionsreaktion blev udført ved hjælp af RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Scientiﬁc, Waltham, MA) i henhold til producentens instruktioner. SYB Premix Ex Taq II-kittet (TaKaRa, Dalian, Kina) blev brugt til qRT-PCR: 20-lL reaktionssystemer blev brugt med ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). PCR-parametrene omfattede følgende trin: 95°C i 3 minutter, 1 cyklus; 95C i 5 s og 60C i 40 s, 40 cyklusser. De endelige data var ikke

moraliseret til GAPDH og præsenteres som et forhold til kontrol. De primere, der anvendes til amplifikation, er anført i tabel 1.

Western Blotting

Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [19]. De primære antistoffer var anti-spaltet caspase 3 og p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Kina) og anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA og anti-histon 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Peberrodsperoxidase-mærkede sekundære antistoffer var fra Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). PVDF-membranerne var fra EMD Millipore (Billerica, MA), og ECL-substratet var fra CWBio (Suzhou, Kina). Relative proteinniveauer baseret på gråniveauer fra billedet blev analyseret med Tanon GIS-software (Tanon Biotech, Shanghai, Kina), og data præsenteres som forholdet mellem målproteinet og GAPDH.