Del 1 Doxorubicin lindrer paradoksalt tumorinduceret inflammation hos unge mus

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ibrahim Y. Abdelgawad et al

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at fåprodukter og Cistanche herba

Abstrakt:

Doxorubicin(DOX) er et af de mest udbredte kemoterapeutiske midler i pædiatrisk onkologi. DOX fremkalder en inflammatorisk reaktion i flere organer, som bidrager til DOX-inducerede bivirkninger. Kræft i sig selv forårsager betændelse, der fører til flere patologiske tilstande. Den nuværende undersøgelse undersøgte den inflammatoriske respons på DOX ogtumorerved hjælp af en EL4-lymfom, immunkompetent, juvenil musemodel. Fire uger gamle C57BL/6N-hanmus blev injiceret subkutant med EL4-lymfomceller (5 × 104 celler/mus) i flankeregionen, menssvulst-frie mus blev injiceret med vehikel. Tre dage efter tumorimplantation blev både tumorfrie og tumorbærende mus injiceret intraperitonealt med enten DOX (4 mg/kg/uge) eller saltvand i 3 uger. En uge efter den sidste DOX-injektion blev musene aflivet, og hjerter, lever,nyrerog serum blev høstet. Genekspression og serumkoncentration af inflammatoriske markører blev kvantificeret ved hjælp af henholdsvis real-time PCR og ELISA. DOX-behandling væsentligt undertryktsvulstvækst i tumorbærende mus og forårsagede signifikant hjerteatrofi hos tumorfrie og tumorbærende mus. EL4-tumorer fremkaldte et stærkt inflammatorisk respons i hjertet, leveren ognyre. Påfaldende nok forbedrede DOX-behandling tumorinduceret inflammation paradoksalt for virkningen af ​​DOX i tumorfrie mus, hvilket viser en vidt divergerende effekt af DOX-behandling hos tumorfrie versus tumorbærende mus.

Nøgleord:doxorubicin; svulst; betændelse

1. Introduktion

Doxorubicin (DOX), også kendt som Adriamycin, er et af de mest udbredte kemoterapeutiske midler i pædiatrisk klinisk onkologi. På trods af dets effektivitet i en lang række kræftformer, herunder lymfom, leukæmi og andre pædiatriske kræftformer, er DOX's kliniske anvendelighed begrænset på grund af dets multiple organtoksicitet. Ud over dets markante kardiotoksicitet [1], er DOX blevet påvist at forårsage nefrotoksicitet [2-5] og hepatotoksicitet [6]. Næsten 50 procent af pædiatriske cancerpatienter modtager DOX som en del af deres behandlingsprotokol [7]. På grund af effektive kræftbehandlinger, herunder DOX, er den 5-årlige overlevelsesrate for børn diagnosticeret med kræft steget fra mindre end 60 procent i 1970'erne til mere end 80 procent nu [8,9]. Dette fører til en stor population af børnekræftoverlevere (CCS'er), anslået til at være omkring 400,000. Desværre har CCS'er høj risiko for at udvikle langsigtede bivirkninger på grund af kræftbehandling og/eller selve kræften.

DOX har vist sig at udløse systemisk inflammation [10-12] og inflammatorisk respons i flere organer inklusive hjertet [13],nyre[14] og lever [15]. Dette inflammatoriske respons har vist sig at fremme DOX-inducerede bivirkninger [16,17]. Størstedelen af ​​disse undersøgelser, der rapporterer DOX-induceret inflammation, er blevet udført isvulst-frie dyremodeller, som ikke efterligner det kliniske scenarie, hvor pædiatriske cancerpatienter modtager DOX-behandling efter diagnose med cancer. Kræft i sig selv har også vist sig at forårsage inflammation, der bidrager til flere patologiske tilstande, der kan forværre DOX-inducerede toksiciteter [18,19]. Derfor er der et kritisk behov for at etablere klinisk relevante dyremodeller for at undersøge mekanismerne for DOX-induceret toksicitet af flere organer hos unge,svulst-bærende mus for at studere samspillet mellem DOX-behandling og kræft i sig selv for at forårsage sådanne toksiciteter.

I det aktuelle studie undersøgte vi det inflammatoriske respons på DOX og tumoren i en klinisk relevant syngenisk EL4-lymfom, immunkompetent, juvenil musemodel. Denne model er veletableret inden for cancerforskning [20] og er klinisk relevant for pædiatriske cancerpatienter, da lymfom er en af ​​de mest almindelige typer af pædiatrisk cancer [21]. Brugen af ​​syngene mus er afgørende for at studere den inflammatoriske respons på både DOX og tumoren på grund af immunsystemets kritiske rolle i patogenesen af ​​inflammation [22]. Musenes alder var 5 uger efter DOX-administration, hvilket svarer til ungdomsalderen på 10-12 år hos mennesker [23]. Derudover er de indgivne DOX-doser klinisk relevante for de doser, der modtages af pædiatriske cancerpatienter [24]. Vi bestemte først virkningerne af DOX på hjertefunktionen i tumorfrie og tumorbærende mus, da DOX-induceret kardiotoksicitet anses for at være den mest klinisk relevante bivirkninger af DOX, blandt andre toksiciteter i flere organer. Derefter bestemte vi effekten af ​​DOX, tumoren og deres kombination på flere inflammatoriske markører i hjertet, leveren ognyreud over serummarkører for systemisk inflammation. Vi fandt ud af, at tilstedeværelsen af ​​EL4-tumoren fremkaldte et stærkt inflammatorisk respons i flere organer. Påfaldende nok forbedrede DOX-behandling tumorinduceret inflammation paradoksalt i forhold til den tidligere rapporterede effekt af DOX i tumorfrie mus.

2. Resultater

2.1. Effekter af DOX på kropsvægt og tumorvækst

Den nuværende undersøgelse blev etableret i juvenile mus for at efterligne det kliniske scenarie hos pædiatriske cancerpatienter som beskrevet i figur 1A. Der blev ikke observeret nogen signifikant morbiditet eller dødelighed hos hverken tumorfrie eller tumorbærende mus efter eksponering for DOX (4 mg/kg/uge i 3 uger), hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse med den samme dosis [25]. Ungdomseksponering for DOX resulterede imidlertid i en signifikant reduceret kropsvægtøgning sammenlignet med saltvandsbehandlede mus (figur 1B). For at vurdere anticancer-effekten af ​​DOX i denne EL4-lymfommodel målte vi tumorvægtene efter obduktion af mus. Kronisk DOX-administration i tumorbærende mus hæmmede signifikant EL4-tumorvæksten, hvilket demonstrerede anticancer-effekten af ​​dette doseringsregime af DOX (figur 1C).

2.2. Effekt af DOX-administration på hjertefunktion og morfometri hos tumorfrie og tumorbærende mus

DOX forårsagede hjerteatrofi som vist ved et signifikant fald i hjertevægten til tibia-længden (HW/TL) (figur 1D). Bemærkelsesværdigt var hjerteatrofi forårsaget af DOX forstærket i tumorbærende mus (figur 1D). Virkningerne af DOX, tumor og kombinationen af ​​begge på hjertefunktion og morfologi blev vurderet ved hjælp af transthorax ekkokardiografi. Repræsentative M-Mode billeder fra hver gruppe vises i figur 2A. Hverken DOX eller tumoren forårsagede signifikante ændringer i ejektionsfraktion (figur 2B), hjertevolumen (figur 2C), fraktioneret forkortelse (figur 2D), venstre ventrikulær (LV) masse (figur 2E), LV posterior vægtykkelse i diastole (LVPW' d) (Figur 2F), eller LV posterior vægtykkelse i systole (LVPW'er) (Figur 2G).

2.3. Effekt af DOX-administration på genekspression af inflammatoriske markører i hjertet af tumorbærende og tumorfrie mus

Hjerter blev høstet fra både tumorfri og EL4 lymfom tumorbærende juvenile C57BL/6N mus en uge efter administration af 4 mg/kg/uge DOX eller tilsvarende volumen sterilt saltvand i 3 uger (n=8 pr. gruppe). Efter ekstraktion af totalt RNA, hjerte-mRNA-ekspression af inflammatoriske markører interleukin-1 alfa (IL-1), interleukin-1 beta (IL-1), interleukin{{12} } (IL-6), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-), inflammatoriske kemokiner, monocyt-kemoattraktant protein-1 (Mcp-1), og CX C-motivkemokiner (Cxcl1, Cxcl9 og Cxcl10) blev bestemt ved real-time PCR. Genekspressionen af ​​flere inflammatoriske markører i hjertet var signifikant opreguleret i tumorbærende mus sammenlignet med tumorfrie mus, inklusive de pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 (Figur 3A), IL-1 ( Figur 3B), IL-6 (Figur 3C) og TNF- (Figur 3D) og de inflammatoriske kemokiner Mcp-1 (Figur 3E), Cxcl1 (Figur 3F) og Cxcl10 (Figur 3H). Mens DOX-administration i tumorfri mus ikke resulterede i signifikante ændringer i ekspressionen af ​​inflammatoriske markører i hjertet, ophævede DOX-administration signifikant den tumor-inducerede opregulering af IL-1 (figur 3B), Mcp{{44} } (Figur 3E), Cxcl9 (Figur 3G) og Cxcl10 (Figur 3H). Det er vigtigt, at to-vejs ANOVA viste en signifikant interaktionseffekt i alle markører undtagen Cxcl1, Cxcl9 og Cxcl10, hvilket demonstrerede de divergerende effekter, som DOX har på hjerteinflammatoriske markører i tumorbærende, sammenlignet med tumorfrie mus.

2.4. Effekt af DOX-administration på genekspression af inflammatoriske markører i leveren af ​​tumorfrie og tumorbærende mus

Lever blev høstet fra både tumorfri og EL4 lymfom tumorbærende juvenile C57BL/6N mus en uge efter administration af 4 mg/kg/uge DOX eller tilsvarende volumen sterilt saltvand i 3 uger (n=8 pr. gruppe). Efter ekstraktion af totalt RNA, hepatisk mRNA-ekspression af inflammatoriske markører IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 og Cxcl10 blev bestemt ved real-time PCR. Tumorbærende mus havde signifikant forhøjet hepatisk ekspression af de pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 (Figur 4A), IL-1 (Figur 4B), TNF- (Figur 4D), Cxcl9 (Figur 4G), og Cxcl10 (figur 4H) sammenlignet med tumorfrie mus. Selvom det er mindre bemærkelsesværdigt, viser to-vejs ANOVA en signifikant effekt af tumoren på den hepatiske genekspression af IL-6 (figur 4C). Tovejs ANOVA viste en signifikant interaktionseffekt mellem tumoren og DOX i Cxcl10 (figur 4H). DOX-administration reducerede tumorinduceret opregulering af IL-1 og TNF- (figur 4B, D). Hverken DOX eller tumoren havde en signifikant effekt på den hepatiske ekspression af inflammatoriske kemokiner Mcp-1 og Cxcl1 (figur 4E, F).

2.5. Effekt af DOX-administration på genekspression af inflammatoriske markører i nyren hos tumorfrie og tumorbærende mus

Nyrerne blev høstet fra både tumorfri og EL4 lymfom tumorbærende juvenile C57BL/6N mus en uge efter administration af 4 mg/kg/uge DOX eller tilsvarende volumen sterilt saltvand i 3 uger (n=8 pr. gruppe). Efter ekstraktion af totalt RNA, nyre-mRNA-ekspression af inflammatoriske markører IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 og Cxcl10 blev bestemt ved realtids-PCR. I overensstemmelse med de observerede ændringer i hjertet og leveren havde tumorbærende mus signifikant øget nyreekspression af de pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 (Figur 5A), IL-1 (Figur 5B), TNF- (figur 5D) og Mcp-1 (figur 5E) sammenlignet med tumorfri mus. Derudover viser to-vejs ANOVA en signifikant effekt af tumoren på den renale genekspression af Cxcl1 (figur 5F), Cxcl9 (figur 5G) og Cxcl10 (figur 5H). DOX-administration i tumorbærende mus forbedrede signifikant den tumor-inducerede opregulering af IL-1 (Figur 5B), IL-6 (Figur 5C), TNF- (Figur 5D) og Mcp{{43} } (Figur 5E). Inden for disse markører viste tovejs ANOVA også en signifikant interaktion mellem DOX og tumoren, hvilket demonstrerede de forskellige virkninger, som DOX har på nyreinflammatoriske markører i tumorbærende sammenlignet med tumorfrie mus.

2.6. Effekt af DOX-administration på histopatologiske egenskaber i hjertet, leveren og nyren hos tumorfrie og tumorbærende mus

Hjerter, lever og nyrer blev høstet fra en kohorte af tumorfri og EL4 lymfom tumorbærende juvenile C57BL/6N mus en uge efter administration af 4 mg/kg/uge DOX eller tilsvarende volumen sterilt saltvand i 3 uger ( n=4 pr. gruppe). Den histopatologiske evaluering viste ingen større patologiske ændringer i hjertet (figur 6A). Kun minimal inflammatorisk celleinfiltration, påvist som sjældne foci af minimalt cellulær blandet (mononukleær og neutrofil) inflammation, blev observeret i levervævet høstet fra DOX-behandlet tumorfri (tre ud af fire mus), saltvandsbehandlet tumorbærende ( to ud af fire mus) og DOX-behandlede tumorbærende mus (tre ud af fire mus) (figur 6B). Histopatologisk evaluering af nyrerne viste ingen større patologiske ændringer i alle grupper undtagen DOX-behandlede tumorbærende mus (figur 6C), hvor to ud af de fire mus i denne gruppe viste regioner med fuld tykkelse tubulær regenerering, fibrose og mild interstitiel betændelse, der påvirker cirka 5 procent af det samlede vævsareal.

2.7. Divergerende virkninger af DOX på seruminflammatoriske cytokiner i tumorfrie versus tumorbærende mus

Vi har tidligere rapporteret, at akut DOX-administration fremkaldte et systemisk inflammatorisk respons hos voksne C57BL/6N-mus [11]. Heri bestemte vi effekten af ​​kronisk DOX-administration på serumniveauer af de inflammatoriske markører IL-6 og TNF- i juvenile tumorfrie og tumorbærende mus. Saltvandsbehandlede tumorbærende mus viste en markant, men statistisk insignifikant, stigning i serum IL-6 (figur 7A) og TNF- (figur 7B) sammenlignet med tumorfri mus. Det er vigtigt, at to-vejs ANOVA viste en signifikant interaktion mellem DOX-administration og tumoren på serumniveauerne af IL-6 og TNF-. Faktisk normaliserede DOX-administration tumorinduceret opregulering af IL-6 til et niveau der svarer til kontroltumorfrie mus (figur 7A).