Del 1 Påvisning af Cistanches Herba (Rou Cong Rong) lægemidler ved hjælp af artsspecifikke nukleotidsignaturer

For mere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* og Shi-lin Chen 3

1 nøglelaboratorium for bioaktive stoffer og ressourcer Udnyttelse af kinesisk urtemedicin, Undervisningsministeriet, Institut for Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medicinal Science og Peking Union Medicinal College, Beijing, Kina, 2 NHP Research Alliance, Biodiversity Institute of Ontario (BIO) ), University of Guelph, Guelph, ON, Canada,

3 Beijings nøglelaboratorium for identifikation og sikkerhedsvurdering af kinesisk medicin, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, Kina

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

Cistanches Herbaer en lægeplante, der har afgiftningsegenskaber og er almindeligt anvendt i Asien. På grund af ubalancen mellem udbud og efterspørgsel, tilføjes utroskaber ofte for at tjene penge. Der er dog ingen lovgivningsmæssig tilsyn, fordi kvalitetskontrolværktøjer ikke er tilstrækkelige til at identificere stærkt forarbejdede produkter. Således blev et nyt molekylært værktøj baseret på nukleotidsignaturer og artsspecifikke primere udviklet. ITS2-regionerne fra 251Cistanches Herbaog utroskabsprøver blev sekventeret. På basis af SNP-steder blev fire nukleotidsignaturer inden for 30-37 bp og seks artsspecifikke primere udviklet, og de blev valideret af kunstige eksperimentelle blandinger bestående af seks forskellige arter og forskellige forhold. Denne metode blev også anvendt til at detektere 66Cistanches Herbaprodukter på markedet, herunder ekstrakter og kinesisk patentmedicin. Resultaterne demonstrerede anvendeligheden af ​​nukleotidsignaturer til identifikation af forfalskende stoffer i blandinger. Markedsundersøgelsen afslørede 36,4 procent forfalskning: 19,7 procent involverede forfalskning med Cynomorium songaricum ellerCistancheSinensis, og 16,7 procent involverede substitution med Cy. songaricum, Ci. sinensis eller Boschniakia rossica. Resultaterne afslørede også, at Cy. songaricum var den mest almindelige hor på markedet. Vi anbefaler derfor brugen af ​​artsspecifikke nukleotidsignaturer til regulering af forfalskning og verifikation af kvalitetssikringen af ​​lægemiddelforsyningskæder, især for forarbejdede produkter, hvis DNA er nedbrudt.

Nøgleord: Cistanches Herba, Kinesisk patentmedicin, nukleotidsignatur, nedbrudt DNA, kvalitetskontrol af medicin

INTRODUKTION

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) er en velkendt farmakopé-registreret medicin i Asien (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Japan Pharmacopeial Convention, 2016); denne medicin er afledt af de tørrede saftige stængler afCistanche deserticolaYC Ma ellerCistanche tubulosatonic, da det ikke er giftigt og kan tages i lange perioder (Li et al., 2016). Desuden,CistancherHerba blev tildelt æren af ​​at blive udnævnt til "Desert Ginseng" på grund af dens store medicinske værdi, især til at styrke den mandlige seksuelle funktion (Zhang og Su, 2014; Gu et al., 2016). Der er mere end 100 kinesiske patentlægemidler registreret i Chinese Pharmacopoeia Commission (2015) og i andre lokale officielle udstedte standarder (Wang et al., 2012). Efterhånden som befolkningen af ​​ældre individer stiger, er der en betydelig efterspørgsel efterCistanches Herbaog dets lægemidler. Råvareressourcerne bliver dog stadig mere knappe. Faktisk er de to oprindelige arter afCistanches Herbaer blevet tilføjet til China Plant Red Data Book som statsbeskyttede vilde planter (kategori II) (Fu, 1991). De medicinske materialer på markedet dyrkes hovedsageligt i det nordvestlige Kina.

På grund af den betydelige ubalance mellem udbud og efterspørgsel afCistancherHerba, mange utroskabsmænd er kommet ind på markedet; disse utroskaber er uforenelige med standarder og kan true narkotikasikkerheden. De kendte utroskabsstoffer omfatter de tørrede saftige stængler af Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang på kinesisk),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan og Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Disse utroskabsmidler har morfologiske egenskaber svarende til demCistancherHerba, hvilket gør traditionel taksonomisk identifikation vanskelig, især efter at materialet er forarbejdet til lægemidler. Mikroskopisk identifikation er ikke tilgængelig pgaCistancherHerbahar ingen definitive eller unikke mikroskopiske egenskaber. De nuværende analytiske kemiske værktøjer er ikke tilstrækkelige til at påvise forfalskning af Cistanches Herba, fordi lignende forbindelser også findes i de kendte forfalskningsmidler Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) og Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Derfor er udviklingen af ​​en hurtig molekylær metode til autentificering af Cistanches Herba og dets produkter et presserende behov for ordentlige kvalitetskontrolsystemer i kinesisk patentmedicin og andre lægemiddelindustrier.

Chen et al. foreslog først intern transskriberet spacer 2 (ITS2) som en universel stregkode for lægeplanter (Chen et al., 2010). Sun et al. verificerede ITS2-regionen som en foretrukken DNA-stregkode til identifikationCistancherHerba og dens ægteskabsbrud (Sun et al., 2012). ITS2 kan dog ikke bruges til at skelne kinesisk patentmedicin fra nedbrudt DNA. For nylig har et stigende antal undersøgelser vist, at "ministregkoden" er en nyttig metode til at amplificere nedbrudt DNA (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Nukleotidsignaturer er dog mere passende end ministregkoder, da de førstnævnte refererer til et eller flere nukleotider, der er unikke for en art og effektivt kan udnyttes af mange molekylære teknikker, såsom DNA-prober, mikrofluidik og loop-medieret isotermisk amplifikation ( de Boer et al., 2015). Han et al. udviklede nukleotidsignaturer for Panax ginseng, Angelica Sinensis og Lonicera japonica og identificerede med succes de tilhørende kinesiske patentlægemidler (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

funktionelle produkter indeholdendeCistancherHerba. Specifikt udviklede vi (1) fire nukleotidsignaturer og seks specifikke primerpar til at differentiere autentiskCistancherHerba og kendte forfalskningsstoffer, (2) validerede de fire nukleotidsignaturer i eksperimenter, herunder blandinger af kendte taksonomiske kuponer, der blev brugt til at fremstille Cistanches Herba-produkter, der indeholder både autentiske og forfalskede ingredienser, og (3) udførte en markedsundersøgelse af 66CistancherHerba-produkter via deres nukleotidsignaturer.

Cistanchehar mange virkninger og kan forbedre nyrefunktionen

MATERIALER OG METODER

Prøveindsamling og forberedelse

I alt blev der indsamlet 251 prøver fra blandt andet Indre Mongoliet, Xinjiang og Ningxia; disse prøver omfattede 214Cistanches Herbaog 37 ægteskabsbrud og er beskrevet detaljeret i den supplerende tabel S1. Tilsvarende voucherprøver blev valideret af taksonomer og deponeret i Herbarium af Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. I alt 35 partier af pulvere, krydderier og ekstrakter afCistancherHerba blev købt fra onlinebutikker og fysiske apoteker i Beijing og Chengdu (tabel 1). I alt 31 partier af kinesisk patentmedicin indeholdendeCistancherHerba blev købt fra forskellige apoteker (tabel 2), og de erklærede sammensætninger af forskellige kinesiske patentlægemidler er vist i supplerende tabel S3. De forskellige morfologiske egenskaber ved forskellige dosisformer er vist i figur 1.

Blandede prøver: Pulvere af Ci.deserticola, Ci.tubulosa, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica og O. coerulescens blev kunstigt blandet i forskellige kombinationer (i forholdet 1:1) før ekstraktion. Detaljerne for disse blandede prøver er vist i forklaringen i figur 3. Derudover blev pulverne fra fire forfalskningsmedel blandet med den ægte Ci. deserticola i forskellige vægtforhold: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 og 60000:1 (tabel 3). Og de to ægte produkter er blandet i samme proportioner.

Afkog: Skiver af Ci. deserticola og Cy. songaricum blev brugt til at tilberede afkoget. Skiverne (10 g) blev kogt i 300 ml dobbeltdestilleret vand i 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 minutter og derefter brugt til DNA-ekstraktion.

DNA-ekstraktion, polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation og sekventering

Prøver, afkog og blandede prøver: Prøverne (40-50 mg) blev formalet til fine pulvere via en Retsch MM400 laboratorieblandermølle (Retsch Co., Tyskland) ved en frekvens på 30 Hz. Det genomiske DNA blev efterfølgende ekstraheret med et Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., Kina) i henhold til producentens instruktioner. ITS2 blev amplificeret af de universelle primere 2F/3R (Chen et al., 2010).

parallelt pr. batch. Det kinesiske patentmedicinpulver blev vasket med 700 µL forvaskebuffer [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), pH 8,0;

700 mM NaCl; 2 procent polyvinylpyrrolidon (PVP)-40; og 0,4 procent -mercaptoethanol] flere gange, indtil supernatanten var klar og farveløs, hvorefter blandingen blev centrifugeret ved 7500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Bundfaldet blev efterfølgende brugt til at ekstrahere det genomiske DNA via Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) i henhold til producentens instruktioner. Til sidst blev DNA fra hver batch koncentreret i et rør. Seks artsspecifikke primerpar – SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR og LDF/LDR – blev designet via Primer Premier

6.0 software (Premier Co., Canada) til at forstærke Cistanches Herba og dets forfalskning (detaljerne er vist i tabel 4). PCR blev udført i en 50 µL-volumen reaktion indeholdende 1 µL af

KOD FX (Toyobo Co., Japan), 25 µL 2 x PCR-buffer, 10 µL dNTP'er (2 mM), 1,5 µL af hver primer (10 µM) og 4 µL (~50 ng) DNA-skabelon; det resterende volumen bestod af dobbeltdestilleret vand. Reaktionerne blev udført af

en termisk cykler (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); de termiske programmer er anført i tabel 4. PCR-produkterne blev undersøgt via 3 procent agarosegelelektroforese og oprenset til tovejssekventering med en ABI 3730XL-sekventering (Applied Biosystems Co.) i overensstemmelse med Sanger-sekventeringsmetoden. Derefter blev følsomheden af ​​de seks primere testet via den kvantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay med et CFX96 Real-time System (Bio-rad Lab., USA). Cyklustærsklerne blev automatisk beregnet af systemet via "PCR Baseline Subtracted Curve Fit"-modellen. qRT-PCR blev udført i en 15 µL-volumen reaktion indeholdende 7,5 µL SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Japan), 1,0 µL af hver primer (10 µM) og 1,0 µL DNA-skabelon med det resterende volumen bestående af dobbeltdestilleret vand. qRT-PCR blev udført med tre tekniske replikater baseret på hvilke standardfejlen blev beregnet.

Sekvensanalyse: Sekvenserne blev redigeret og manuelt samlet via CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA).

ITS-sekvenser fra GenBank blev annoteret via Hidden Markov-modellen (HMM) for at opnå ITS2-sekvenserne (Keller et al., 2009). Sekvenserne blev derefter justeret med MEGA 5.0-software via "Muscle"-justeringsmetoden (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Cistanchehar mange effekter og kan forstærkenyrefungere

RESULTATER

Udvikling af nukleotidsignaturer og artsspecifikke primerpar til Cistanches Herba og Adulterants

PCR-amplifikations- og sekventeringssuccesraterne for de 251 prøver var 100 procent, når primerparret 2F/3R blev brugt. Den justerede længde af Cy. songaricum ITS2-sekvenser var 229 bp (Supplerende figur S1). Analyse af sekvenserne fra herbariumarterne og dem fra nært beslægtede arter hentet fra GenBank (Supplerende tabel S2) afslørede to enkelt nukleotidpolymorfi (SNP)-steder for Cy. songaricum. På basis af SNP'erne, en Cy. songaricum-specifik 30- bp nukleotidsignatur (5'-caattatttg agggcattg taagaagcgt-3') blev udviklet (figur 2A). Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) resultater i NCBI viste, at denne nukleotidsignatur var unik for Cy. songaricum (tabel 5). Med en lignende analyse af sekvenserne fra nært beslægtede arter blev en til to SNP'er opdaget fra Ci. sinensis, B. rossica og O. coerulescens. På basis af SNP'erne blev nukleotidsignaturerne for de tre andre adulteranter også udviklet på samme måde, inklusive en 34 bp signatur (5'-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3') for Ci. Sinensis, en 37 bp signatur (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') for B. rossica, og en 31 bp signatur (5'-gtctgtcgtg tcggatggtg ttg{gttg} co′gttg} g. (Figur 2BD). BLAST-analyse i NCBI afslørede også, at disse nukleotidsignaturer var specifikke og ikke til stede i nogen anden art (tabel 5).

Cistanches Herbaog dets forfalskningsmidler kunne amplificeres samtidigt fra blandinger via 2F/3R universal primerparret. Således designet vi artsspecifikke primere til nukleotidsignaturamplifikation ved at justere ITS2-sekvenserne. Fire specifikke primerpar - SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR og LDF/LDR - blev designet til at amplificere nukleotidsignaturerne af Cy. songaricum, B. rossica, Ci. henholdsvis sinensis og O. coerulescens (tabel 4). Længden af ​​amplikonerne var henholdsvis 123, 72, 131 og 71 bp.

Derudover blev i alt 214 ITS2-sekvenser fra eksperimentelle Cistanches Herba-materialer analyseret. To korte specifikke primere - HMRCF/HMRCR og GHRCF/GHRCR for Ci. deserticola og Ci. tubulosa, henholdsvis - blev designet til at forstærke de korte områder af de nedbrudte prøver (tabel 4). Længden af ​​amplikonerne var henholdsvis 132 og 134 bp.

Validering af nukleotidsignaturen og den artsspecifikke primermetode baseret på kunstige blandinger og afkog

Amplifikationseffektiviteten af ​​de nye primerpar blev valideret ud fra blandingen. PCR-produkter blev opnået via hvert primerpar for hver målartet art, som vist

cq-værdier for B. rossica eller O. coerulescens kunne opnås, selv proportionen af ​​prøver var 30000:1 eller 40000:1, og amplifikationsresultaterne for Ci. sinensis, Ci.tubulosa, og Ci deserticola kunne påvises, når forholdet var 20000:1. Men der kunne ikke opnås nogen påviselige resultater for Cy. songaricum, når det udgjorde andelen af ​​20000:1.

For at verificere om nukleotidsignaturmetoden fungerer med forarbejdede materialer, afkog af Ci. deserticola og Cy. songaricum blev tilberedt. Resultaterne viste, at den korte stregkode fra Ci. deserticola kunne amplificeres, selv efter at prøverne var kogt i 210 min. Derudover er nukleotidsignaturen af ​​Cy. songaricum kunne amplificeres efter at prøverne var kogt i 150 minutter, mens ingen PCR-produkter blev påvist efter prøverne var kogt i 210 eller 240 minutter (figur 4). Sekvenseringsresultaterne viste, at den korte nukleotidsignatur blev opnået med succes fra afkogningen.

Markedsundersøgelse af forfalskning via nukleotidsignatur og specifikke primere

Ovenstående metode blev anvendt til påvisning afCistancherHerba produkter på markedet. Femogtredive partier afCistancherHerba-skiver, pulvere og ekstrakter blev amplificeret og sekventeret ved at bruge seks designede specifikke primere (agarosegelelektroforeseresultaterne er vist i Supplerende Figur S2, og sekvenserne er opført i Supplerende Datablad 1). Analyse af sekvenserne via deres nukleotidsignaturer afslørede, at fem partier af skiver var autentiske. En skivebatch og en pulverbatch blev erstattet med Cy. songaricum og et ekstrakt blev erstattet med Ci. sinensis. De andre seks partier af pulvere var blandinger: fem blev forfalsket med Cy. songaricum og Ci. sinensis og en var forfalsket med Cy. songaricum (tabel 1). Derudover blev en skivebatch erstattet med Salvia miltiorrhiza.

Cistanches Herba i kinesisk patentmedicin udsættes for forskellige processer, der gør autentificering vanskelig. De seks primerpars evne til at amplificere de artsspecifikke nukleotidsignaturregioner fra de kinesiske patentlægemidler blev testet (agarosegelelektroforeseresultaterne er vist i supplerende figur S2). De fleste kinesiske patentlægemidler indeholder komponenter af forskellige arter. For eksempel indeholder Shihu Yeguang-piller (ZCY34) 25 ingredienser, herunder Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) og Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Ud fra disse ingredienser kunne Cistanches Herba amplificeres specifikt via primerparret GHRCF/GHRCR. Direkte sekventering af PCR-produkterne afslørede meget rene spor. Et synligt bånd kunne dog ikke opnås med primerparret HMRCF/HMRCR.

Et andet eksempel er Kangguzhi Zengsheng piller (ZCY44). Der er otte ingredienser forudenCistancherHerba i denne kinesiske patentmedicin, men der var ingen synlige bånd opnået af hverken GHRCF/GHRCR eller HMRCF/HMRCR, hvilket betød, at ingenCistanches Herbavar til stede. Men den utroskabelige region Cy. songaricum blev amplificeret med succes af det specifikke primerpar SYF1/SYR1. Sekvenseringsresultaterne viste den korte nukleotidsignatur af Cy. songaricum blev opnået med succes.

Cistanchehar mange funktioner og haranti-inflammatoriskeffekter