DEL 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide hæmmer OVX-induceret knogletab i mus og RANKL-induceret osteoklastogenese

1. Introduktion

Osteoporose – en sygdom karakteriseret ved nedsat knoglemasse, unormal knoglevævsmikrostruktur, øget knogleskørhed og fraktur (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli og Ginaldi, 2006) – påvirker i øjeblikket mere end 200 millioner mennesker verden over og præsenterer en betydelig medicinsk og socioøkonomisk byrde på det moderne samfund (Strom et al., 2011). Den kliniske behandling af osteoporose fokuserer hovedsageligt på hormonsubstitution, bisphosphonat- eller denosumab-behandling. Disse metoder er effektive, men medfører langsigtede bivirkninger såsom den potentielle risiko for brystkræft og atypiske lårbensbrud (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Derfor er der et presserende behov for at udforske lægemidler, der ikke kun kan hæmmeosteoporosemen har også færre uønskede bivirkninger.

Cistanche deserticola(CD), en tonic og medicinsk fødevare, der er meget udbredt i Kina, kendt som "ørkenginseng", er den tørrede saftige stilk med skælblad afC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) og har mangfoldig og effektivfarmakologiskaktivitetersåsom immunregulering, antioxidation og anti-osteoporoseegenskaber (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Tidligere undersøgelser af de aktive stoffer i CD på osteoporosebehandling fokuserede hovedsageligt påphenylethanoidglykosider(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD'en indeholder dog også andre effektive komponenter såsom iridoider, lignaner,polysaccharider(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Den kliniske anvendelse af traditionel kinesisk medicin (TCM) er hovedsageligt vandafkogning.Polysacchariderer vandopløselige komponenter og er højst sandsynligt de vigtigste farmakodynamiske komponenter i TCM. Polysaccharider ekstraheret fra TCM blev vildt rapporteret at have en anti-osteoporoseeffekt og nogle få uønskede bivirkninger, som generelt er blevet brugt i klinikker (f.eks. polysaccharider udvundet fra Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) og Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Derfor antog vi detCistanche deserticolapolysaccharid(CDP) ekstraheret fra CD kan være et potentielt sikkert lægemiddel til behandling af osteoporose.

Typisk opretholder knogleresorption og knogledannelse en dynamisk balance under knogleombygning i koordination med flere typer celler, herunder osteoklaster, osteoblaster, knoglebeklædningsceller og osteocytter (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Et brud i denne balance kan resultere i en række forskellige knoglestofskiftesygdomme, som f.eksosteoporose(Zhu et al., 2018) og osteosklerose (Ihde et al., 2011). Osteoklaster, som end-differentierede celler afledt af den mononukleære/makrofage-linje, er de eneste celler med knogleresorptionsfunktion (Teitelbaum, 2000). Der er to nøglecytokiner, der deltager i osteoklastdifferentieringen og modningen (Koga et al., 2004): makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og receptoraktivator af nuklear faktor κB (NF-κB) ligand (RANKL). M-CSF medierer differentieringen af ​​hæmatopoietiske stamceller til osteoklast-progenitorer og fremmer differentieringen af ​​osteoklaster ved at opregulere ekspressionen af ​​RANK-receptoren (Takayanagi, 2007). Bindingen af ​​RANKL og RANK på osteoklastcelleoverfladen resulterer i følgende: (1) rekruttering af signaladaptermolekyler, såsom TNF-receptor-associeret faktor 6 (TRAF6); (2) aktivering af flere nedstrøms mål, herunder NF-KB og mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK'er); og (3) opregulering af ekspressionsniveauerne af nuklear faktor af aktiverede T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktiveringen af ​​disse signalveje regulerer direkte ekspressionen af ​​osteoklastgener, herunder sur phosphatase 5 (Acp5) [koder for tartrat-resistent sur phosphatase (TRAcP)], matrix metalloproteinase 9 (MMP9) og cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet , & Lacey, 2003). Derfor er inhiberingen af ​​RANKL-inducerede osteoklastdifferentieringsrelaterede signalveje en potentiel terapeutisk metode til osteoporose.

I denne undersøgelse havde vi til formål at bestemme virkningerne af CDP-behandling på de ovariektomiserede (OVX)-induceredeosteoporosemusemodel in vivo og på RANKL-induceret osteoklastaktivitet in vitro, med fokus på ekspressionen af ​​osteoklastspecifikke gener og aktiveringen af ​​NFATc1 og NF-KB og MAPKs signalveje. Vores resultater kan give ny indsigt i potentialet for CDP som et sikkert og effektivt lægemiddel til behandling af osteoporose.

For mere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysaccharid Cistanche deserticola har mange virkninger ved osteoporose, klik her for at vide mere

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier og prøveindsamling

CD (nr. 180801) blev købt fra Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Kina) og identificeret af professor Haibo Huang fra School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Kina. Estradiolvalerattabletter blev købt fra Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Tyskland). Alfa-modificeret minimalt essentielt medium

(-MEM) og føtalt bovint serum (FBS) blev opnået fra Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicillin/streptomycin og TRAcP-farvningssættet blev erhvervet fra Solarbio (Beijing, Kina). Rekombinant mus M-CSF og rekombinant mus RANKL blev fremskaffet af R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hydroxyapatit-coatede plader blev købt fra Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). De primære antistoffer for NFATc1 og CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK og P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); og -actin (CWBIO, Beijing, Kina) blev også opnået. De andre reagenser, der blev brugt i denne undersøgelse, var af analytisk kvalitet, og vandet blev renset ved hjælp af Milli-Q vandrensningssystemet (Millipore, Bedford, MA, USA).

2.2. CDP-ekstraktion

CD'en blev malet til et fint pulver og blandet med petroleumsether tre gange for at besejre den. Den faste remanens blev opsamlet ved filtrering og derefter tørret ved stuetemperatur. Detpolysacchariderblev ekstraheret fra de forbehandlede prøver tre gange med vand i 2 timer, koncentreret, præcipiteret ved tilsætning af vandfri ethanol til en slutkoncentration på 80 % (v/v) og opbevaret ved 4 ◦C i 24 timer. Bundfaldene blev opsamlet ved centrifugering ved 3000 rpm i 20 minutter, opløst i destilleret vand og oprenset (fjernelse af frie proteiner) ved hjælp af Sevag-metoden (Zhao et al., 2019). Den genvundnepolysacchariderblev dialyseret, tørret og opbevaret indtil videre brug. Ydermere viste de kemiske sammensætningsresultater, at det samlede sukker-, uronsyre-, sulfat- og proteinindhold i CDP var 67.63 0.98 procent , 21.05 0.49 procent , 1.{{7 }},24 procent og 8.81 0,36 procent.

Monosaccharidsammensætningen og Fourier-transformation infrarød analyse af CDP blev vist i Supplerende Fig. 1 og 2.

2.3. OVX-induceret osteoporose musemodel

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Ethics Committee ved Guangzhou University of Chinese Medicine (godkendt SYXK 2019-0202). Tredive 6-uger gamle C57BL/6 hunmus blev leveret af Experiment Animal Center ved Guangzhou University of Chinese Medicine. Efter akklimatisering i 1 uge blev en gruppe mus foretaget en simuleret operation (Sham-gruppen), mens de resterende mus blev udsat for en ovariektomioperation (OVX-gruppen). Efter operationen fik musene lov til at komme sig i 1-uge. Derefter blev mus med succes modelleret tilfældigt opdelt i 5 grupper med 6 mus pr. gruppe:

(1) Sham gruppe: behandlet med destilleret vand, (2) OVX gruppe: behandlet med destilleret vand, (3) OVX E2 gruppe (E2): behandlet med 0.13 mg/kg østradiol valerat tabletter, (4) ) OVX CDP lavdosisgruppe (CDP-L): behandlet med 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP højdosisgruppe (CDP-H): behandlet med 600 mg/kg CDP. Destilleret vand, E2 eller CDP blev indgivet med sonde en gang dagligt. Alle mus blev aflivet efter 12- uges behandlingsperiode (fig. 1A). Livmoderne blev opsamlet og vejet, og venstre skinneben blev opsamlet til efterfølgende undersøgelser. Helblodsprøver blev opsamlet og centrifugeret ved 5000 rpm for

15 min ved 4 ◦C. Serumsupernatanterne blev aspireret og opbevaret kl

—80 ◦C indtil videre analyse.

2.4. Mikrocomputertomografi (mikro-CT) analyse og knoglehistomorfometri

De venstre skinneben blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd i 48 timer og efterfølgende anbragt i centrifugerør indeholdende normalt saltvand. De faste prøver blev scannet med Skyscan 1172 mikro-CT-instrument (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgien) ved hjælp af følgende indstillinger: spænding, 80 kV; kildestrøm, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; pixel

størrelse, 9,76 μm; og rotationstrin, 0.6◦. Flere parametre i

trabekulær knogle, inklusive knoglemineraltæthed (BMD), knoglevolumenfraktion (BV/TV), knogleoverflade pr. samlet volumen (BS/TV), trabekulært antal (Tb. N) og trabekulær afstand (Tb. Sp) blev målt ved hjælp af CT- Analyser® software (Bruker micro-CT, Skyscan). Tredimensionelle billeder blev genereret ved hjælp af CTVol software (Bruker micro-CT. Skyscan).

Efter mikro-CT-analyse blev venstre skinneben afkalket i 14 procent EDTA-opløsning og indlejret i paraffin til sektionering. Prøverne blev skåret i 5 µm sektioner under anvendelse af en mikrotom før hæmatoxylin og eosin (H&E) og TRAcP farvningseksperimenter. De farvede sektioner blev undersøgt og dokumenteret ved hjælp af Olympus CX 31 mikroskop (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan).

Cistanchekan øge knogletætheden og lindre osteoporose

2.5. Serum analyse

Calcium (Ca) og phosphor (P) koncentrationerne blev bestemt i overensstemmelse med kitinstruktionerne designet af Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). TRAcP-5b- og RANKL-niveauer i serumet blev analyseret ved hjælp af henholdsvis TRAcP-5b ELISA-kit (CUSABIO, Wuhan, Kina) og RANKL ELISA-kit (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kina).

2.6. In vitro osteoklastogenese-assay

BMM'er blev isoleret fra skinnebenet og lårbenet på 6-ugegamle C57BL/6 hunmus. De isolerede celler blev dyrket i -MEM-medium indeholdende 25 ng/ml M-CSF, 10 procent FBS og 1 procent penicillin/streptomycin. Efter at have nået sammenløbet blev BMM'erne (1 104 celler/brønd) podet i 96-brøndsplader og behandlet med CDP i nærvær af 50 ng/ml RANKL. Mediet og CDP blev udskiftet hver anden dag. Efter 7 dage blev cellerne fikseret med 4 procent paraformaldehyd og farvet for tilstedeværelsen af ​​TRAcP. Antallet af osteoklaster, defineret som TRAcP-positive celler med tre eller flere kerner, blev talt og dokumenteret ved hjælp af et lysmikroskop.

2.7. Celleproliferationsassay

BMM'erne (1 × 104 celler/brønd) blev podet i en 96-brøndsplade og inkuberet natten over. Efter dette blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 og 40 µg/ml) i 48 timer. Cellesammenløbet blev detekteret og analyseret ved hjælp af IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), et langsigtet, realtids dynamisk levende cellebilleddannelsessystem.

2.8. Hydroxyapatit-resorptionsassay

BMM'erne ({{0}} celler/brønd) blev podet i en hydroxyapatit-coatet plade, behandlet med CDP i de angivne koncentrationer (0, 5 og 10 µg/mL) og dyrket i komplet -MEM indeholdende 25 ng/ml M-CSF og 50 ng/ml RANKL. Efter 7 dage blev cellerne vasket med en 10 procent blegeopløsning for at fjerne cellekomponenterne. Billederne af hydroxyapatitresorptionsområder blev fanget ved hjælp af IncuCyte ZOOM® og analyseret ved hjælp af ImageJ-software (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9. RNA-isolering og real-time revers transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) analyse

BMM'erne ({{0}} celler/brønd) blev podet i en 6-brøndsplade og stimuleret med RANKL og M-CSF i nærvær af CDP i forskellige koncentrationer (0, 5 og 10) µg/ml) i 5 dage. Totalt RNA blev isoleret fra cellerne eller knoglevævet fra mus under anvendelse af TRIzol-reagens (Sigma-Aldrich). Komplementært DNA blev syntetiseret fra 2 µg totalt RNA under anvendelse af et revers transkriptase-kit (TransGen Biotech, Beijing, Kina). RT-qPCR-reaktionerne blev fremstillet ved hjælp af PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) og detekteret af ABI 7500-systemet (Applied

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Cyklusparametrene for PCR blev indstillet som følger: 95 ◦C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ◦C i 15 s og 60 ◦C i 30 s. De specifikke anvendte primere er vist i tabel 1, og mængden af ​​hvert målgen blev normaliseret til GAPDH (intern kontrol).

2.10. Western blot analyse

BMM'erne ({{0}} celler/brønd) blev podet i en 6-brøndplade. Til korte tidsforløbseksperimenter blev cellerne præ-inkuberet med de forskellige koncentrationer af CDP (0, 5 og 10 µg/mL) i 1 time og derefter behandlet med 50 ng/mL RANKL i 30 min. . I et langt tidsforløb blev cellerne stimuleret med 50 ng/ml RANKL på dag 3, 5 og 7 i nærvær af CDP (0, 5 og 10 µg/ml). Totale proteiner blev ekstraheret under anvendelse af RIPA lysis buffer (CWBIO). Proteiner blev adskilt med 10 procent SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret med 5 procent skummetmælk ved stuetemperatur i 2 timer, inkuberet med primær

antistoffer natten over ved 4 ◦C og derefter med den tilsvarende sekundære

antistoffer i 1,5 time. Membranerne blev udviklet ved hjælp af ECL-reagenser (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), og billeder blev taget ved hjælp af Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Kina).

Cistanchekan øge knogletætheden

2.11. Påvisning af NFATc1-translokation ved hjælp af immunfluorescenstest

BMM'erne blev podet på {{0}}brønddækglas, stimuleret med RANKL og M-CSF og behandlet med 10 µg/mL CDP i 5 dage. Cellerne blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd i 15 minutter, vasket tre gange med PBS og permeabiliseret med 0,1 procent Triton X-100 i 10 minutter. Cellerne blev blandet med 10 procent gedeserum (CWBIO) og inkuberet i 2 timer. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ◦C og derefter med Alexa Fluor 488 gede-anti-mus sekundært antistof (Abcam, Cambridge, MA, USA) i mørke i 1 time. Dækglasset blev vasket med PBS, monteret i Prolong Gold Antifade Reagent med 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar) og

inspiceret ved hjælp af Zeiss LSM 800 med Airyscan konfokalmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

2.12. Statistisk analyse

Alle eksperimentelle data blev analyseret ved hjælp af SPSS 25.0 statistisk software (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Dataene for dyre- og celleundersøgelser er udtrykt som henholdsvis middel ± SEM og middel ± SD. Resultaterne bruger en-vejs variansanalyse eller Elevens t-test. Værdier af p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

Cistanchekan reducereapoptoseog forbedre knoglenmassefylde